携带遗传标记的PPV全长感染性克隆构建及其生物学特性研究

携带遗传标记的PPV全长感染性克隆构建及其生物学特性研究

论文摘要

(目的)猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)感染能够突破胎盘屏障引起初孕母猪流产、死胎和木乃伊胎等,严重威胁养猪业的健康发展。PPV基因组全长约5.0 kb,包含两个开放性阅读框(open reading frame,ORF),5′端的ORF1编码3个非结构蛋白NS1、NS2及NS3,3′端的ORF2编码2个结构蛋白VP1和VP2,目前有关PPV的结构和非结构蛋白在其致病过程中的作用及机制尚不清楚,且至今也没有针对PPV结构与非结构蛋白的单克隆抗体,因此,构建PPV全长感染性克隆,用于深入探讨这些蛋白在PPV致病过程中的作用机制势在必行。(方法)本研究首先通过人工合成两端发夹结构,应用融合PCR技术(overlap PCR)体外扩增中间序列,在体外经过无缝克隆技术(Infusion)连接,构建PPV全长感染性克隆质粒,并在全长DNA感染性克隆的VP1上(A3058T)通过无义突变引入Eco R I酶切位点作为遗传标记,用于区分拯救病毒和亲本病毒。采用脂质体将全长感染性克隆质粒转染PK-15细胞进行病毒拯救。(结果)结果显示在盲传至5代可以观察到典型CPE,利用电镜、Western-blot、间接免疫荧光检测,结果表明病毒拯救成功,命名Y-PPV。细胞试验结果显示,Y-PPV感染PK-15细胞后能够引起明显的特征性病变和稳定遗传携带的遗传标记,且具有和亲本毒株相似的复制增殖能力及诱导细胞凋亡特性。动物试验结果发现,Y-PPV与亲本毒株相比具有相似的组织嗜性和致组织病变能力。(结论)该研究结果为进一步探讨PPV的致病机制以及疫苗的研发奠定理论基础和提供试验材料。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •     1.1.1 病毒和细胞
  •     1.1.2 载体和菌株
  •     1.1.3 主要试剂
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 PPV中间编码序列的扩增
  •     1.2.2 PPV全长DNA感染性克隆质粒的构建
  •     1.2.3 病毒拯救及鉴定
  •     1.2.4 拯救病毒的遗传稳定性
  •     1.2.5 拯救病毒的复制特性
  •     1.2.6 拯救病毒诱导凋亡特性
  •     1.2.7 体内动物试验验证
  • 2 结果
  •   2.1 PPV分离株的遗传进化分析
  •   2.2 PPV全长DNA克隆质粒的构建和鉴定
  •   2.3 拯救病毒的鉴定
  •   2.4 拯救病毒遗传标记的遗传稳定性检测
  •   2.5 拯救病毒的复制特性检测
  •   2.6 拯救病毒诱导凋亡特性检测
  •   2.7 动物体内试验验证
  • 3 讨论
  • 文章来源

    类型: 国内会议

    作者: 陈松彪,黄勇,童德文

    关键词: 猪细小病毒,感染性克隆,遗传标记,致病性

    来源: 中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会 2019-07-27

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学动物医学院

    分类号: S852.651

    页码: 417-432

    总页数: 16

    文件大小: 1259k

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