论文摘要
目的川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）作为药食同源植物,不仅可以作为食品食用,也可以作为药用目的。为了保证川贝母食用、药用安全,对其进行质量控制研究,进一步为严格控制川贝母药材质量打下基础,从而保证食用安全。方法利用HPLC-ELSD检测手段测定1-2年与3-4年野生川贝母药材中的西贝母碱（Imperialine）、贝母素甲（Peimine）和贝母素乙（Peiminine）的含量,为川贝母生物碱代谢工程供给了材料拣选的依据。以从原产地康定折多山野生抚育基地采撷的野生川贝母药材鳞茎为材料,利用聚合酶链反应（PCR）技术克隆卷叶贝母HMGR基因（FcHMGR）的全长cDNA和CAS基因（FcCAS）开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,并基于在线工具对FcHMGR和FcCAS序列进行生物信息学分析。通过荧光定量（qRT-PCR）手段检测1-2年与3-4年野生鳞茎cDNA样本中FcCAS和FcHMGR相对含量。此外,还利用原核表达体系对HMGR进行了酶活测定。结果1不同年限（1-2年与3-4）年野生川贝母的生物碱含量数据分析发现,3-4年野生川贝母生物碱含量的积累较高,推测可能与其合成的基因表达水平有关。2针对随着年限的增长,生物碱积累越高这一现象,本研究克隆了两个与生物碱合成相关的基因:HMGR和CAS。（1）FcHMGR基因全长为2072bp,包含一个1680bp的完整开放阅读框,编码559个氨基酸。同源性与氨基酸保守结构域结果显示,该蛋白具有HMGR活性必需的典型多肽位,实时荧光定量PCR结果显示,FcHMGR在3-4年野生川贝母鳞茎中表达量更高。SDS-PAGE剖析显示,FcHMGR基因在表达感受态细胞BL21中可以表达,并且它是可融合的蛋白质。FcHMGR酶活检测表明FcHMGR是一个具有功能性的蛋白。（2）FcCAS编码区ORF长为2 271 bp,编码756个氨基酸,并与NCBI上公布的天门冬、芭蕉、油棕等植物CAS蛋白的相似性达80%以上;qRT-PCR实验表明FcCAS在3-4年野生川贝母鳞茎中表达水平高于1-2年生。结论川贝母生物碱随着年限的增长而呈现含量越多的现象可能与其合成相关基因的高表达呈正相关,进一步分析这些基因的克隆和功能,为卷叶贝母生物碱含量和表达调控的研究奠定了基础。
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缩略词表（List of abbreviation）摘要Abstract引言第一章 基于生物活性物质测定开展川贝母质量控制研究 1 研究目的和意义 2 研究内容 2.1 试验仪器、试剂与材料 2.1.1 仪器与试剂 2.1.2 生物碱类对照品 2.1.3 材料的准备 2.2 实验方法 2.2.1 对照品溶液制备 2.2.2 供试品溶液制备 2.2.3 色谱条件 2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察 3 结果与分析 3.1 3-4 年野生川贝母药材生物碱含量的测定 3.2 1-2 年野生川贝母药材生物碱含量的测定 3.3 川贝母药材中三种有效成分的含量测定结果 4 小结第二章 川贝母关键酶基因HMGR的克隆与表达 1 研究目的和意义 2 材料、仪器与试剂 2.1 植物材料 2.2 主要实验仪器 2.3 菌株和载体 2.4 试剂 2.5 实验引物 3 实验方法 3.1 卷叶贝母FcHMGR基因c DNA的合成 3.1.1 卷叶贝母鳞茎总的RNA提取 3.1.2 卷叶贝母FcHMGR基因c DNA的合成 3.1.3 卷叶贝母FcHMGR基因c DNA全长的获得 3.2 卷叶贝母FcHMGR基因的克隆及生物信息学分析 3.2.1 PCR产物的回收与连接 3.2.2 转化 3.2.3 阳性克隆的筛选 3.2.4 卷叶贝母FcHMGR基因生物信息学分析软件 3.3 卷叶贝母FcHMGR 基因的荧光定量PCR实验 3.3.1 qRT-PCR引物的设计 3.3.2 卷叶贝母FcHMGR基因cDNA的获得 3.3.3 PCR反应步骤 3.4 卷叶贝母FcHMGR基因原核表达载体的构建 3.4.1 连接产物的转化与单克隆的培养 3.4.2 阳性单克隆的筛选 3.4.3 质粒的提取 3.5 卷叶贝母FcHMGR基因原核表达载体的诱导表达 3.6 HMGR-pGEX酶活性的分析 3.6.1 蛋白含量标准曲线 3.6.2 HMGR-pGEX酶活性试剂的准备 3.6.3 酶活测定 4 结果与分析 4.1 川贝母鳞茎总RNA的质量分析 4.2 川贝母FcHMGR基因全长c DNA的克隆 4.3 FcHMGR基因生物信息学分析 4.3.1 FcHMGR蛋白的分子量及等电点预测 4.3.2 FcHMGR蛋白保守结构域分析 4.3.3 蛋白质跨膜结构以及信号肽的预测 4.3.4 氨基酸序列的同源性分析 4.3.5 构建系统进化树分析 4.3.6 FcHMGR蛋白的二级、三级结构预测 4.4 卷叶贝母FcHMGR基因的荧光定量PCR实验 4.5 卷叶贝母FcHMGR基因原核表达的诱导表达 4.6 HMGR活性检测 5 小结第三章 川贝母关键酶基因CAS的克隆与表达 1 研究目的与意义 2 材料、仪器与试剂 2.1 植物材料 2.2 试剂与仪器 2.3 菌株和载体 3 实验方法 3.1 卷叶贝母FcCAS基因cDNA全长的获得 3.1.1 卷叶贝母的总RNA的提取与cDNA的合成 3.1.2 卷叶贝母FcCAS基因的克隆 3.2 卷叶贝母FcCAS基因序列分析 3.3 卷叶贝母FcCAS基因的荧光定量PCR实验方法 4 结果与分析 4.1 卷叶贝母FcCAS基因cDNA的获得 4.1.1 卷叶贝母鳞茎总RNA质量检测 4.1.2 卷叶贝母FcCAS基因ORF的克隆 4.2 FcCAS基因序列分析 4.2.1 FcCAS基因编码蛋白特性分析 4.2.2 氨基酸序列比对和基因进化分析 4.3 FcCAS基因表达量的分析 5 小结结论参考文献附录A 附录内容名称攻读硕士学位期间发表论文及科研成果致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 陈晓仪
导师: 赵琦
关键词: 川贝母,基因克隆,荧光定量
来源: 成都大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,生物学,轻工业手工业
单位: 成都大学
分类号: TS218;Q503;Q78
总页数: 74
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标签：川贝母论文; 基因克隆论文; 荧光定量论文;
