C3PO在果蝇siRNAs及miRNAs通路中功能机制的研究

论文摘要

果蝇的Translin-Trax八聚体蛋白被命名为C3PO（Component 3 Promoter of RISC）是由于其在Ago2相关的pre-RISC向成熟的RISC转化过程中起到了促进作用。siRNAs在Dcr2与R2D2的协同作用下,被带进Ago2中,并与Dcr2,R2D2以及Ago2形成了成熟的RISC前体。这个RISC前体要变成一个成熟的RISC需要将Ago2上结合的双链siRNAs变成单链siRNA。这个过程牵涉到Guide strand的选择,Passenger strand的切割以及切割产物从RISC中的移除及自身降解。Translin-Trax八聚体能够帮助Passenger strand顺利降解。它本身就是一个镁离子依赖的核酸内切酶,序列长度在7nt以上的核酸单链都能被它切割。在移除并降解了单链的siRNA之后,这个八聚体蛋白有了新的名字——C3PO。C3PO有助于Ago2-RISC的成熟,这意味着RISC发挥作用将更有效率。基于C3PO的这一特点,我们开始了对C3PO在果蝇中小RNA通路的功能研究。在果蝇的exo-siRNAs通路中,RISC的核心蛋白是Ago2。我们用dsEGFP-pAc5.1/V5-His B-EGFP这个EGFP报告系统来反映果蝇中C3PO被敲减之后的exo-siRNAs通路的RNA干扰效果的强弱。结果表明,敲减Translin或者Trax任意一个都会减弱C3PO的活性,进而降低该通路的RNA干扰,使本应被沉默的EGFP表达水平得到了恢复。我们进一步研究敲减C3PO对果蝇endo-siRNAs通路的影响。在这个实验中,我们在敲减Translin这个保证C3PO稳定性的蛋白之后,发现pMT-EGFP-esi-2.1受到内源性小RNA的基因沉默效果减弱了。我们对野生型果蝇与Translin突变果蝇进行小RNA高通量测序,发现在突变果蝇中,esi-2.1的passenger链含量上升了,并且guide链含量也随之上升了。这个现象说明缺少了C3PO的帮助,Ago2-RISC的活性降低,内源性的小RNA干扰效果减弱。研究了C3PO在两个以Ago2作为RISC核心的小RNA通路中的功能之后,我们继续观察它的缺失对miRNAs通路活性的影响。首先我们分析突变果蝇与野生型果蝇的小RNA高通量测序数据,发现Translin突变果蝇的miRNAs含量高于野生型。继而通过pMT-EGFP-bantam-bulged这个报告质粒,我们发现在C3PO敲减的细胞中,miR-bantam含量增加,其对目的基因的翻译抑制效果也增加。我们得出结论,C3PO在miRNAs通路中发挥作用不再依赖Ago蛋白,而是负责降解细胞质中游离的miRNAs。这样C3PO即防止星链的堆积,又加快了从靶基因上脱落下来的成熟链的降解,保证果蝇自身基因调控的正常进行。

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论文创新点

摘要

Abstract

1 文献综述

1.1 果蝇的RNA干扰介绍及抗病毒机制

1.1.1 RNA干扰的机制

1.1.2 RNA干扰的抗病毒机制

1.1.3 病毒感染过程中产生的小RNA

1.1.4 昆虫病毒编码的RNA干扰抑制因子

1.1.5 虫媒病毒是否编码RNA干扰抑制子

1.1.6 其他抗病毒的小干扰RNA

1.1.7 昆虫体内受诱导产生的抗病毒反应

1.2 果蝇中的内源性siRNAs通路

1.2.1 来源于转座元件的siRNAs

1.2.2 来源于cis-natural antisense transcripts（cis-NAT）的siRNAs

1.2.3 来源于hpRNA的 siRNAs

1.2.4 果蝇的endo-siRNAs的产生需要Loquacious（Loqs）

1.3 果蝇体内的miRNAs通路

1.3.1 miRNAs的产生

1.3.2 靶位点RNA对 miRNAs稳定性的影响

1.3.3 加尾跟修剪现象区分内源性与外源性的小RNA沉默

1.4 Translin-Trax多聚体（C3PO）的背景介绍

1.4.1 Translin与 Trax的研究历史

1.4.2 Translin的结构与功能

1.4.3 Trax的功能研究

1.4.4 不同物种间Translin与 Trax多聚体的相似性

1.4.5 果蝇中Translin-Trax多聚体的研究

1.4.6 Translin-Trax多聚体的新名字:C3PO

1.4.7 不同物种的C3PO的功能研究

1.4.8 人的C3PO的结构研究

1.4.9 果蝇的C3PO的结构与功能研究

1.4.10 C3PO的核酸酶活性

2 C3PO在果蝇exo-siRNAs通路中的功能研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 敲减构成C3PO的两个蛋白Translin与 Trax

2.3.2 C3PO影响果蝇外源性小RNA通路的RNA干扰

2.4 讨论

3 Translin蛋白在果蝇endo-siRNAs通路中的功能研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果

3.3.1 构建外源小RNA通路报告基因

3.3.2 沉默Translin对果蝇内源性小RNA通路功能的影响

3.3.3 pMT-EGFP-esi-2.1 的翻译水平的变化

3.3.4 Translin突变果蝇与野生型果蝇测序数据分析

3.4 讨论

4 C3PO在果蝇miRNAs通路中的功能研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果

4.3.1 野生型与Translin突变型果蝇小RNA测序数据中的miRNAs表达量分析

4.3.2 Translin突变果蝇中与Ago2 蛋白相关的miRNAs的变化分析

4.3.3 Translin突变果蝇中与Ago1 蛋白相关的miRNAs的变化分析

4.3.4 外源表达的let-7在C3PO敲减的S2 细胞中的含量检测

4.3.5 miR-bantam靶位点基因重组质粒的构建与检测

4.4 讨论

参考文献

攻博期间发表与待发表的科研成果

研究总结

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘愈杰

导师: 胡远扬

关键词: 果蝇,通路

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q75

总页数: 111

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C3PO在果蝇siRNAs及miRNAs通路中功能机制的研究

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