编辑PFF细胞的P53基因及其信号通路中重要基因的表达分析

论文摘要

旨在编辑PFF细胞的P53基因,并分析其信号通路中重要基因的表达。本研究首先将设计好的两条sgRNAs装载入PX459 V2.0质粒中,订购两条携带241W、242S、266H突变位点的单链寡核苷酸（SSODN）作为供体DNA（一条带有前两个突变,另一条带有266H突变）,利用电转法将打靶载体和SSODNs共转染到PFF细胞中,筛选单克隆细胞后检测打靶区域的编辑情况,并检测编辑细胞中信号通路重要基因（MDM2、FAS、WIP1、BAX、P21和DD1α）的表达及检测编辑细胞的增殖能力。结果表明,在筛选到的107个单克隆细胞中,分别有4个为两个位点（R241和R242）纯合子和杂合子编辑型,1个为R266位点纯合子编辑型、63个纯合子缺失型、11个序列倒置型、11个纯合子点插入型、3个杂合子缺失型（或混合克隆）和10个野生型,未获得3个位点同时被编辑的细胞。RT-PCR和Western blotting结果显示,纯合子缺失型细胞中P53几乎不表达;RT-PCR检测显示,在纯合子缺失型细胞和双位点编辑型细胞中MDM2、FAS、BAX、P21基因的表达量极显著下降（P<0.01或P<0.001）;Western blotting结果显示,在纯合子缺失型细胞中,未检测到P21基因的表达蛋白,MDM2的表达量也较明显地下降。CCK-8检测试验表明,编辑型细胞的增殖能力显著（P<0.05）或极显著（P<0.01或P<0.001）高于野生型细胞。综上所述,本试验成功地将PFF细胞中P53基因的两个野生型位点编辑成与人肿瘤发生相关的位点,P53基因被编辑后显著影响了其信号通路中部分重要基因的表达,本试验所获得双位点编辑细胞,为下一步研制P53点编辑模型猪奠定了重要的基础。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 乔传民,刘为伟,杨强,江浩筠,黄路生,幸宇云

关键词: 单链寡核苷酸,基因编辑

来源: 畜牧兽医学报 2019年11期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 江西农业大学省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室

基金: 国家自然科学基金(31771372),国家科技重大专项(2016ZX08006-003)

分类号: Q78

页码: 2215-2225

总页数: 11

文件大小: 2346K

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标签：单链寡核苷酸论文;  基因编辑论文;