转录激活因子XlnR及其同系物在草酸青霉中的功能研究与纤维素酶系高产菌株的构建

论文摘要

丝状真菌由于能够分泌较完整的木质纤维素降解酶系,并且产酶水平比较高,因此广泛应用于工业纤维素酶的生产。构建具有高产酶能力的丝状真菌菌株是降低木质纤维素降解酶生产成本、推动纤维素乙醇等行业发展的重要途径。丝状真菌中木质纤维素降解酶的合成主要受转录因子的组合调控。根据转录因子对木质纤维素降解酶基因的激活或抑制功能,一般将其分为两类:第一类为转录激活因子,主要包括CLR-1、CLR-2/ClrB、XLR-1/Xyr1/XlnR、ACEⅡ、ACEⅢ、AraR/ARA1等;第二类为转录抑制因子,主要包括CRE1/CreA、ACEI、BglR等。目前,在草酸青霉中已经鉴定到的木质纤维素降解酶基因调控转录因子有CreA、ClrB、XlnR和AmyR等。其中,XlnR是调控木聚糖酶基因表达最重要的转录激活因子,并且参与部分纤维素酶基因的表达调控。在多数木质纤维素降解丝状真菌中都可以发现转录激活因子XlnR同系物的存在,该蛋白结构和功能相对比较保守,并且在半纤维素降解和木糖代谢过程中发挥至关重要的作用。在本论文中,我们研究了草酸青霉转录调控因子XlnR的结构域组成特征,并探究了异源XlnR同系物在草酸青霉中的调控特性。对XlnR及其同系物的研究有助于加深对不同物种间XlnR同系物功能保守性的认识,同时也有利于为菌株的理性改造与木质纤维素降解酶高产菌株的构建提供有效靶点。本论文的主要研究结果如下:1.草酸青霉XlnR功能结构域的研究借助于酵母报告基因检测系统,通过构建不同区域的XlnR序列与酵母转录因子Gal4 DNA结合域的融合蛋白,对草酸青霉XlnR的激活结构域进行鉴定,确定了第351-694位氨基酸序列含有激活结构域。将草酸青霉XlnR靠近N端的一段特有的谷氨酰胺（Q）重复序列删除以后,XlnR对纤维素酶与半纤维素酶基因的调控能力增强,说明该段序列在一定程度上抑制了草酸青霉XlnR活性的发挥。发现位于XlnR C末端的序列对于草酸青霉XlnR活性发挥至关重要,其删除会使XlnR丧失调控活性,这与黑曲霉中XlnR C末端删除后的结果不同。通过对XlnR中可能参与解除葡萄糖抑制的氨基酸保守位点（第868-871位氨基酸）进行研究发现,XlnR中第871位氨基酸的极性与XlnR激活功能的发挥有直接关系,且第871位氨基酸的丢失会造成XlnR活性的丧失。当第871位的丙氨酸删除之后,XlnR激活能力丧失;突变为亲水性氨基酸之后,XlnR的激活能力降低;突变为疏水性氨基酸,XlnR激活能力变强,且该位点氨基酸疏水性越强,XlnR激活能力越强。此外,借助于酵母双杂交实验,我们确定了XlnR激活结构域与位于C端的氨基酸序列存在相互作用,说明两者之间可能在草酸青霉中通过改变相互作用的有无来实现XlnR活性的调节。2.异源XlnR同系物在草酸青霉中的功能研究将与草酸青霉XlnR亲缘关系较近的黑曲霉AXlnR、亲缘关系较远的里氏木霉Xyrl以及粗糙脉孢菌XLR-1,分别在草酸青霉xlnR缺失突变株中进行异源表达,发现这三种异源XlnR同系物均能够激活草酸青霉木质纤维素降解酶系的表达。在包括草酸青霉本源XlnR在内的四种XlnR同系物中,里氏木霉Xyr1对草酸青霉纤维素酶基因调控能力最强,这可能与Xyr1在里氏木霉本源宿主菌中具有较强的纤维素酶基因调控能力有关。粗糙脉孢菌XLR-1对草酸青霉纤维素酶基因调控能力最弱。前人研究表明,XLR-1在粗糙脉孢菌中并不参与纤维素酶基因的调控,但在草酸青霉中,粗糙脉孢菌XLR-1却可以在一定程度上参与纤维素酶调控,提高xlnR缺失株的纤维素酶酶活。总的来说,XlnR同系物在异源宿主菌株中仍旧具有功能的保守性,可以参与到异源宿主菌的木质纤维素降解酶表达调控网络中,并发挥其调控功能。将XlnR同系物的保守氨基酸进行点突变,发现点突变后的Xyr-1A824V、XLR-1A828V、AXlnRA805V对草酸青霉木质纤维素降解酶基因的激活能力较突变前Xyr1、XLR-1、AXlnR分别更强。其中,Xyr1A824V在四种XlnR同系物突变体中的激活能力最强。同时,首次发现黑曲霉保守位点突变A805V也能够提高其对草酸青霉木质纤维素降解酶表达的激活效果。在草酸青霉中,该突变体与草酸青霉XlnRA871V激活效果接近。此前的研究结果证明,在本源宿主菌中突变后的XlnR同系物与突变前相比对木质纤维素降解酶基因具有持续激活能力及增强激活功能,本论文研究发现在异源宿主菌（草酸青霉）中这种持续激活的优势依旧存在。这些异源突变体功能的发现为草酸青霉菌株的遗传改造提供了更多的选择性。3.异源XlnR表达调控模块在草酸青霉中的功能研究以M12作为出发株,在草酸青霉菌株DB2中成功地建立了 Rec/six筛选标记重复利用系统,并且发现该系统对草酸青霉纤维素酶的产生没有影响。将含有里氏木霉转录激活因子Txyr1A824V及其靶标纤维素酶基因Tcbh1-Teg1的表达调控模块在草酸青霉中进行异源表达,发现纤维素酶基因Tcbh1和Teg1能够进行低水平的表达,且Xyr1A824V表达调控模块对草酸青霉纤维素酶酶活的提升效果优于单独Xyr1A824V的表达。由于外源的纤维素酶基因启动子在草酸青霉中不能高效地启动基因的表达,将其更换为草酸青霉本源的启动子,进而使外源纤维素酶基因实现了高效表达。纤维素酶基因启动子优化后的里氏木霉来源和粗糙脉孢菌来源表达调控模块均优于转录因子的单独过表达,显示将转录因子和其靶标基因共表达在菌株遗传改造中具有可行性。4.木质纤维素降解酶高产菌株的构建借助于Rec/six筛选标记重复利用系统,在菌株DB2的基础上累积过表达来自于草酸青霉、里氏木霉和粗糙脉孢菌的XlnR表达调控模块,使菌株的纤维素酶和半纤维素酶酶活均得到大幅提升。其中,构建的高产菌株RE-4-2相比于原始菌株M12滤纸酶活提高了5.1倍,木聚糖酶活提高了28倍。高产菌株RE-4-2所产酶系对预处理后的玉米秸秆的糖化效率也比出发菌株M12提高了 93%,纤维素转化率提高了 1.57倍。为进一步提高菌株对半纤维素的降解能力,在高产菌株RE-4-2的基础上过表达了点突变的AraRA731V,得到菌株RE-4-2-AraRA731V,其阿拉伯呋喃糖苷酶活比RE-4-2提高了 7.2倍,木糖苷酶活也提高了 1.2倍。通过对预处理后玉米秸秆的糖化实验,发现菌株RE-4-2-AraRA731V所产还原糖比菌株RE-4-2提高了13%。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 夏呈强

导师: 宋欣

关键词: 草酸青霉,转录激活因子,异源表达,木质纤维素降解酶

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

专业: 生物学,环境科学与资源利用,农业基础科学

单位: 山东大学

分类号: X712;Q78

总页数: 155

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