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猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp9的组成、细胞内定位及复制非必需位点的分析

2020-12-02阅读(1103)

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp9的组成、细胞内定位及复制非必需位点的分析

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种严重影响全球养猪业的重要病原。非结构蛋白9（nsp9）是PRRSV的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）,参与形成病毒的复制与转录复合体（RTC）,在病毒的复制调控和致病性方面具有重要的作用。迄今为止,PRRSVnsp9的生物学特性尚未完全阐明。本研究聚焦于分析PRRSVnsp9的组成、定位和与细胞内膜系统的关系及其潜在的复制非必需位点,以期为进一步阐明nsp9的功能提供科学依据。在PRRSV感染细胞中nsp9是否包含nsp8尚无定论。为了证实nsp8构成nsp9的N端,经表达和纯化nsp8融合蛋白（GST-nsp8）,制备出兔源抗nsp8多克隆抗体（多抗）,并利用nsp9和nsp10单克隆抗体（单抗）、nsp7和nsp9多抗,采用免疫沉淀技术鉴定nsp9的分子大小。结果显示,PRRSV感染细胞中的nsp9分子量介于72～95 kDa之间,且与体外表达的nsp8-90RF1b大小一致,但大于体外表达的nsp9ORF1b。同时,nsp8多抗分别能够检测并通过免疫沉淀结合与nsp9大小一致的条带,且经质谱分析其为包含nsp9ORF1b的肽段,而nsp7和nsp10抗体则不能。进一步通过体外切割试验证明nsp8-9ORF1b不能被PLP2和nsp4切割。以上结果表明PRRSVnsp8构成nsp9的N端部分。对nsp9在PRRSV感染细胞中的定位及与细胞内膜系统的关系进行了分析。应用Globplot分析了 nsp9的二级结构,并利用激光共聚焦鉴定出aa1-139、aa237-333和aa494-685是nsp9的膜结合区域,且后两者部分定位于线粒体。利用生物物理试验分离PRRSV感染MARC-145细胞的线粒体组分和细胞质组分。检测结果显示,nsp9主要分布于线粒体组分,且高盐和高pH值溶液均不能将其从线粒体中释放出来,表明nsp9紧密结合于线粒体膜结构。进一步研究发现其他RTC相关蛋白nsp2和nsp10也主要分布于线粒体组分。将线粒体组分分层,结果显示nsp9、nsp2和nsp10与线粒体蛋白处于相同的分层。然而,激光共聚焦观察结果显示,在PRRSV感染MARC-145细胞内,nsp9与线粒体无明显共定位。最后利用siRNA干扰技术证明线粒体外膜蛋白MFN2与PRRSV的复制和增殖有关。以上结果表明,以nsp9为核心的PRRSV RTC与线粒体膜有密切关系。分析了 PRRSV nsp9中复制非必需位点。对16个PRRSV 2（基因2型）代表性毒株nsp9氨基酸序列进行了同源性分析,结果表明不同毒株nsp9氨基酸同源性为94.9%～99.7%,仅PRRSV毒株HB-1/3.9的nsp9第109位甘氨酸（G109）缺失。利用感染性cDNA克隆技术,构建并拯救出分别以pWSK-HB-1/3.9和pWSK-JXwn为骨架的插入病毒RvHBn9+109G和缺失病毒RvJXn9AG109,测定拯救病毒在细胞上的增殖动态,分析了 nsp9 G109对PRRSV复制的影响。结果表明,RvHBn9+109G与RvHB-1/3.9在MARC-145细胞上的复制能力无明显差异;而RvJXn9AG109接种MARC-145细胞后,在12 hpi、24 hpi和36 hpi的病毒滴度分别是RvJXwn的36.67倍（p<0.001）、17.02倍（p<0.01）和8.38倍（p<0.5）;接种猪肺泡巨噬细胞（PAMs）后,在12hpi和24hpi的病毒滴度分别是RvJXwn的17.52倍（p<0.001）和14.68倍（p<0.001）。而以pWSK-JXwn为骨架进一步构建的nsp9 G109两侧、N端和C端结构域连接处、C末端和N端氨基酸缺失的全长cDNA克隆质粒,并未拯救出病毒。以上结果表明,G109是PRRSVnsp9中的复制非必需位点,其缺失不影响PRRSV在细胞上的增殖。综上所述,我们的研究揭示了:（1）nsp8构成nsp9的N端;（2）在感染细胞中,nsp9与细胞线粒体膜有密切关系;（3）nsp9第109位甘氨酸是PRRSV复制非必需位点。研究结果为阐释PRRSVnsp9的生物学功能提供了重要的科学依据,也为深入研究nsp9调控PRRSV的复制和致病性的分子机制奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 引言
  •   1.1 国内外研究概况
  •   1.2 研究的目的和意义
  •   1.3 研究内容和技术路线
  •     1.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp8构成nsp9 N端的鉴定
  •     1.3.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp9与细胞线粒体膜整合的分析
  •     1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp9中复制非必需位点分析
  •   1.4 研究目标
  • 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp8构成nsp9 N端的鉴定
  •   2.1 前言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 材料
  •     2.2.2 方法
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 Nsp8基因的扩增
  •     2.3.2 GST-nsp8蛋白的表达、纯化与鉴定
  •     2.3.3 兔源抗GST-nsp8多克隆抗体的制备
  •     2.3.4 PRRSV感染MARC-145细胞中nsp8与nsp9的共定位分析
  •     2.3.5 PRRSV感染MARC-145细胞中nsp9包含nsp8的鉴定
  •     2.3.6 融合表达nsp8和nsp9真核质粒的构建
  •     2.3.7 瞬时转染与病毒感染细胞中nsp9大小的比较
  •     2.3.8 PLP2/nsp4对nsp8-9切割活性的分析
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp9与细胞线粒体膜整合的分析
  •   3.1 前言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 材料
  •     3.2.2 方法
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 PRRSV nsp9的膜结合区域鉴定
  •     3.3.2 PRRSV nsp9三个膜定位区域的亚细胞定位分析
  •     3.3.3 PRRSV nsp9在线粒体中的亚定位分析
  •     3.3.4 PRRSV nsp9和其他RTC蛋白与线粒体膜组分关系的分析
  •     3.3.5 PRRSV nsp9与线粒体在感染细胞中的共定位分析
  •     3.3.6 干扰线粒体外膜蛋白对PRRSV增殖的影响
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp9中复制非必需位点分析
  •   4.1 前言
  •   4.2 材料和方法
  •     4.2.1 材料
  •     4.2.2 方法
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 PRRSV nsp9氨基酸序列同源性分析
  •     4.3.2 PRRSV HB-1/3.9 nsp9第109位氨基酸插入cDNA的构建与病毒拯救
  •     4.3.3 PRRSV JXwn06 nsp9第109位氨基酸缺失cDNA克隆的构建与病毒拯救
  •     4.3.4 PRRSV nsp9第109位氨基酸对病毒增殖的影响
  •     4.3.5 PRRSV JXwn06 nsp9第109位氨基酸两侧氨基酸缺失cDNA克隆的构建和病毒拯救
  •     4.3.6 PRRSV JXwn06 nsp9 N端和C端连接处氨基酸缺失cDNA克隆的构建和病毒拯救
  •     4.3.7 PRRSV JXwn06 nsp9 C末端氨基酸缺失cDNA克隆的构建和病毒拯救
  •     4.3.8 PRRSV nsp9 N末端氨基酸缺失cDNA克隆的构建和病毒拯救
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 第五章 结论
  • 第六章 创新点
  • 第七章 文献综述
  •   7.1 动脉炎病毒科
  •     7.1.1. 动脉炎病毒科RdRP的结构特征及与病毒复制的关系
  •     7.1.2. 动脉炎病毒科RdRP在细胞内的定位
  •     7.1.3. 动脉炎病毒科RdRP对病毒致病性的影响
  •   7.2 冠状病毒科
  •     7.2.1. 冠状病毒科RdRP的结构特征
  •     7.2.2. 冠状病毒科RdRP在细胞内的定位
  •     7.2.3. 冠状病毒科致病因子
  •   7.3 正黏病毒科
  •     7.3.1. 正黏病毒科聚合酶复合体的结构特征
  •     7.3.2. 正黏病毒科聚合酶的定位
  •     7.3.3. 正黏病毒科聚合酶对病毒致病性和宿主适应性的影响
  •   7.4 黄病毒科
  •     7.4.1. 黄病毒科RdRp的结构特征
  •     7.4.2. 黄病毒科RdRp在细胞内的定位
  •     7.4.3. 黄病毒科RdRp对病毒致病性的影响
  •   7.5 微RNA病毒科
  •     7.5.1. 微RNA病毒科RdRp的结构特征
  •     7.5.2. 微RNA病毒科RdRp在细胞内的定位
  •     7.5.3. 微RNA病毒科RdRp对病毒致病性的影响
  •   7.6 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 刘园园

    导师: 杨汉春,韩军

    关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,非结构蛋白,端构成,线粒体膜,克隆,复制非必需位点

    来源: 中国农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业大学

    分类号: S852.651

    总页数: 138

    文件大小: 11399K

    下载量: 528

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