于新芬[1]2003年在《黑曲霉N25植酸酶phyA基因玉米表达载体的构建》文中认为以本课题组测定出的黑曲霉N25植酸酶phyA基因为目的基因(GenBank Accession No.AF218813)，从信号肽序列切割位点序列之后设计上游引物(设计一个XbaI酶切位点)；在终止密码子处设计下游引物(设计一个KpnI酶切位点)。用高保真度的聚合酶进行扩增，得到了大小约1.4kb的单一条带产物，即为phyA表达片段。将该产物经XbaI和KpnI酶切处理后连接到含有胚乳特异性启动子(EGH5 promoter)的中间载体pBPC47的多克隆位点上，转化大肠杆菌JM109菌株，在含100μg/mL的Amp抗性的LB平板上筛选到了的阳性菌落。质粒酶切分析和PCR分析结果表明获得了pBPC47-phyA重组质粒，命名为pBA；采用EcoRI和HindIII内切酶从pBA质粒中酶切出启动子-phyA-终止子(EGH5-phyA-nos)片段，插入到玉米表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点，并转化大肠杆菌JM109菌株，用光生物素标记的phyA基因探针进行菌落原位杂交，在100μg/mL的Km抗性LB培养基上筛选到了阳性转化菌落，质粒酶切分析结果表明获得了pCAMBIA1300重组表达载体，命名为pCBA。pCBA重组表达载体的构建为phyA基因在玉米种子的高效表达奠定了基础。以胚乳特异性启动子构建植酸酶基因的玉米表达载体，以玉米种子作为植物生物反应器生产植酸酶在国内外尚属首次。在玉米种子中特异性生产植酸酶，符合未来饲料的营养要求，可为生产廉价、高效、方便的植酸酶提供新途径，便于植酸酶的推广使用，有重要的学术价值和应用前景。该重组质粒现已转化玉米愈伤组织，分化出的幼苗已移栽大田。
沈亚欧[2]2005年在《植酸酶基因（phyA）转化玉米的研究》文中进行了进一步梳理植酸酶是催化植酸磷(肌醇六磷酸及其盐类)分解成肌醇和无机磷酸盐的一类磷酸酶,它可以分为两类:肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(EC.3.1.3.8)和肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(EC.3.1.3.26),其主要来源于酵母菌、霉菌及细菌等微生物;另外,在反刍动物的瘤胃和高等植物体内也含有植酸酶。磷是生物机体内不可缺少的元素,植物体内磷的主要存在形式是植酸磷,在种子中植酸磷的含量约占其总磷的70%左右。而植物体内天然植酸酶的量相对于植酸磷的水平是很低的,并不足以使植物从大量的植酸磷中释放出足量的无机磷。由于单胃动物的胃肠道也不能分泌植酸酶,从而难以充分利用植物性饲料中的植酸磷源,为满足动物对磷的需求,通常须要在饲料中添加无机磷,这样一方面提高了饲料的成本,另一方面使自然界中的无机磷资源受到严重的威胁;同时,动物不能利用的植酸磷直接从粪便中排出,又会造成环境的磷污染;此外,植酸是一种抗营养因子,它能抑制动物对植物性饲料中的Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)、K~+等金属离子、蛋白质、维生素以及脂肪酸等营养成分的消化吸收,从而降低饲料的营养价值。因此,在动物饲料中添加外源植酸酶逐渐成为提高饲料营养价值和降低环境磷污染的一种有效措施。 作为一种饲料作物,玉米虽然不能为动物的生长发育提供主要磷源,但它是动物饲料中最主要的成分。通过植物基因工程手段使植酸酶在玉米子粒中高效表达,既能降低其内部植酸的水平;同时子粒在饲喂动物后,其中大量的植酸酶在动物胃肠道释放后,又能作用于胃肠道内其它饲料成分中的植酸,提高其营养价值。这样既免去了外源植酸酶的添加,降低了饲料成本,又减少了畜牧生产对环境造成的磷污染。 本研究通过基因枪和农杆菌介导两种方法将含有来源于黑曲霉N25的植酸酶phyA基因的植物胚乳特异表达载体pCBA-Hyg导入玉米优良自交系18-599(红)中,对T_0代转基因植株进行PCR检测,共获得9株PCR为阳性的植株,在这9株中有7株收获了T_0代转基因种子。对这些转基因干种子进行的植酸酶比活力测定,其中有5个株系的干种子其内部植酸酶比活力与对照相比有显着提高,最高的两个株系分别提高了60.85%和44.98%,证明phyA基因已经整合到玉米基因组染色体上并进行了有效的表达。进一步对部分转基因干种子中的无机磷含量进行测定,结果表明有两个株系的干种子中无机磷的含量与对照相比有显着提高,而它们恰好是干种子中植酸酶活力最高的两个株系,证明转基因植酸酶对种子中的植酸磷进行了有效的分解,从而提高
张馨月[3]2013年在《黑曲霉植酸酶phyA基因的分离及转化拟南芥的研究》文中研究表明植酸(phytic acid or myo-inositol hexakisphosphate)及其盐类是植物种子中肌醇的主要来源和磷的主要储存形式,同时也是单胃动物中的一种抗营养因子。植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohyrolases, phytase)是催化植酸及其盐类水解成肌醇和无机磷酸盐的一类磷酸酶。磷是生物机体内不可缺少的重要矿物元素之一,它在植物体内主要是以植酸磷的形式存在,在植物种子中植酸磷的含量约占其总磷量的70%左右,而植物体内天然植酸酶的含量是很低的,因此不足以使植物从大量的植酸磷中释放出足量的无机磷去供自身生长发育所用。在单胃动物体内由于缺乏植酸酶,所以很难充分利用植物性饲料中的植酸磷源,必须要在饲料中额外添加无机磷以满足动物机体对磷的需求,不仅造成了磷源的浪费,又增加了饲料成本,同时不能被单胃动物所吸收利用的植酸磷随动物粪便排出体外,这样的高磷粪便又造成严重的环境污染,因此利用植物来生产植酸酶具有重要的意义。本研究从黑曲霉中克隆出能够编码植酸酶的phyA基因,并构建了含有phyA基因的两个植物表达载体,通过Floral-dip法将phyA基因转入到受体材料拟南芥中,并对转基因拟南芥种子中植酸酶的活性进行了检测。主要研究结果如下：1.本研究成功从黑曲霉中克隆得到了能够编码植酸酶的phyA基因全长序列,该基因长度1506bp,该基因能够编码467个氨基酸。2.成功构建了含有phyA基因的两个植物表达载体pCAMBIA1301-phyA和pCAMBIA1301-PAO-phyA,并将这两个植物表达载体的质粒转化到农杆菌EHA105中,获得了可以用于转化植物的含phyA基因的农杆菌菌液。3.通过Floral-dip法将phyA基因转入到拟南芥中,经过1%的Basta筛选和PCR检测,共获得了13株转基因拟南芥T1代植株,其中有6株是在转基因拟南芥种子中特异性表达的植株,另外7株是在转基因拟南芥种子的油体蛋白上特异性表达的植株,证明了来源于黑曲霉中的phyA基因已成功转入到拟南芥基因组DNA中。4.通过对转基因拟南芥T1代种子中植酸酶活性的测定,初步证明了phyA基因在拟南芥种子中编码的植酸酶可以正确表达,并且转基因拟南芥种子中所表达的植酸酶具有较好的活性,在非转基因野生型拟南芥种子中植酸酶平均活性仅为2.86U/min,而在转基因拟南芥种子中特异性表达的植酸酶平均活性为57.15U/min,在转基因拟南芥油体蛋白上特异表达的植酸酶平均活性为52.61U/min。
陈惠[4]2004年在《基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究》文中提出植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂,其使用效果已在世界范围内得到了确证。但是,目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限,主要原因在于:(1)植酸酶基因工程菌的产酶量有待进一步提高;(2)植酸酶的热稳定性欠佳不能完全满足饲料加工、贮藏的要求。目前,蛋白质工程技术已成为修饰和改造天然酶的有效手段,为植酸酶产量的提高和热稳定性的改善开辟了新的途径。本研究在对本课题组已注册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上,通过对phyA基因进行同义突变、定点突变以及结构延伸突变,获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性良好的植酸酶,其结果主要如下: 1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA(GenBank:基因注册号为AF218813,蛋白质序列号为AAF25481)进行PCR介导的定点突变。在不改变其所编码氨基酸条件下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变,构建了含正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyA~m。电击转化毕赤酵母GS115,经筛选培养基MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变的高酶活酵母转化子2株。这2株转化子的Southern blotting结果显示突变基因phyA~m以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中;表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,其酶蛋白分子大小为70.15kD;转化子酶活测定结果可知,经密码子优化的突变重组酵母的酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子。密码子优化后的突变重组酵母株PP-NP~m-8于麦芽汁培养基中诱导36h后,酶活力可达47600 U·ml~(-1),比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667 U·ml~(-1))提高了1.01倍,经十代传代实验汪实重组转化子遗传稳定性良好。 2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母PP-NP~m-8的植酸酶突变基因phyA~m进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354,358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(1354M,L358F),得到了两个突变体PP-NP~(m-1)(F43Y)及PP-NP~(m-2)(I354M,L358F)。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA~(m-1),pPIC9k-phyA~(m-2)在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物
彭远义[5]2004年在《植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究》文中认为植酸酶是一类能催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的酶，它具有解除植物性饲料(或食品)中植酸的抗营养作用、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率、促进生长发育、提高动物生产性能、减少粪便中磷的排放量、降低磷对环境的污染等多种功能，因而受到国内外的广泛关注。植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景，但微生物天然菌株产酶水平较低，加上天然植酸酶的某些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求，从而限制了植酸酶在生产中的推广应用。通过植酸酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基因，以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质，从而降低生产成本，提高其使用有效性，己成为世界性的研究热点之一。 本研究的目的旨在通过从土壤中筛选酸性植酸酶高产菌株，并进一步通过诱变选育提高其产量，对高产突变菌株植酸酶基因进行克隆和分析，在此基础上，构建植酸酶高产基因工程菌，从而为植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下： 1 植酸酶高产菌株的筛选 利用植酸钙选择性子板培养基从土样中筛选出102株酸性植酸酶产生菌，从中挑选出透明圈较大的菌株32株，经分离纯化后分别进行摇瓶复筛，28℃、220r/min发酵5天后，在37℃、pH2.5或pH5.5条件下用钒钼酸铵法检测其酶活，结果发现有3株菌产酶活性较高且产酶性能较为稳定。其中编号为03214号的菌株在37℃、pH2.5时酶活性最高，达345U/mL发酵液；编号为041和0324号的菌株在37℃、pH5.5时酶活性最高，分别达285U/mL和250U/mL发酵液。根据产酶活性情况，选取03214号菌株作进一步鉴定和诱变选育的出发菌株。经初步鉴定，03214号菌为黑曲霉，编号为Aspergillus niger03214。 2 植酸酶高产菌株黑曲霉N14的诱变选育 以Aspergillus niger03214为出发菌株，通过紫外线诱变处理不同时间，经平板初筛和摇瓶复筛，获得一株产酶活性较高的突变株03214-3，酶活为373U/mL发酵液，比出发菌株提高了8％左右。以突变株03214-3为出发菌，经0.8mg/mL的亚硝基胍诱变处理不同时间，最终获得了产酶活性较原始菌株Aspergillus niger03214提高了22.3％，达422.3U/mL发酵液的突变菌株，编号为Aspergillus nigerN14。 将黑曲霉N14在PDA斜面上连续传7代，分别测定各代菌株酶活，结果其酶活稳定在410～430U/mL发酵液之间，说明突变株黑曲霉N14具有良好的遗传稳定性，可作为下一步基因工程研究的出发菌株。 3 黑曲霉N14基因组DNA的提取及植酸酶phyA基因的克隆，，画.‘，，妇..圈.翻‘通~ 以A，e啥1111”nigerN14为出发菌，采用改良氯化节法和斑迹抽提法提取基因组DNA，经紫外分光光度计测得DNA的ODZ曰心D翔均在1.80左右，表明这两种方法均适合提取黑曲霉基因组DNA。但在所用菌丝体重量相同的条件下，以氯化节法提取的pNA浓度较高。 根据曲霉菌属植酸酶基因具有高度同源性的特点，结合已报道植酸酶神州基因序列，自行设计一对特异性引物(上游引物:5，月队GGG叼℃八TGGGCG子巳n刃口，;下游引物:5，CAGC以六GCA阳心咙火CTCCGC3，)，采用乃仰七。t DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶)，通过PCR方法从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出了预期的约1.skb的特异性产物，将其与pMD18.T载体连接后，转化大肠杆菌Dll5Q，.经质粒抽提、五之口月111、tl双酶切鉴定和PcR鉴定，确认该目的基因已得到成功克隆。4黑曲霉N14植酸酶夕句以基因序列分析 DNA序列测定表明，本试验所克隆的目的基因片段含有植酸酶户州基因的完整序列(GeneBank AcceSSIOn:AY4269”)，夕句讨基因全长15仅无p，其中包含一段长102bp的内含子序列，编码467个氨基酸，5’端有拼编码19个氨基酸的信号肤序列。植酸酶活性位点序列CRvTEAQvLsRHGA即n红DsKCK位于氨基酸序列的+71~+93。黑曲霉N14植酸酶夕勺讨基因中G+仁含量达54.7%，密码子第叁位碱基的G+C含量高达67%。黑曲霉N14植酸酶助州基因与报道的产植酸酶活性最高的天然黑曲霉标准株N刊心乃135(来源于孟，己心iuus niger介uum夕va:a~ori)的尸句“基因(GeneBankA以尤SSion:M94550)及A.nigerN25PhyA基因(GeneBankA。戈SSion:AF21如13)、A.nigervar~夕句“基因(枷eBank Aa笼ssfon:ID2421)、A.niger5K-57夕hJ讨基因(G闭eBaDk八口戈SSion:川叨227(X))同源性分别为%.7%、%.8%、%.4%和91.7%，而编码的氨基酸序列同源性分别为98%、97.8%、%.7%和95.7%。进一步采用公pa叮IProtParam等软件对黑曲霉N14植酸酶夕句“基因编码氨基酸序列及编码的蛋白质二级结构预测进行分析，结果表明，黑曲霉Nl助h)“基因所编码氨基酸序列存在10个潜在的N-糖基化位点，与黑曲霉NRRU 135和黑曲霉N25的p勺讨基因所编码氨基酸序列上的N-糖基化位点个数及位置完全相同，而糖基化对微生物表达的植酸酶的生物合成和热稳定性至关重要;理论PI为4.95，分子量为5 n42.0，分子式为q6eH蝴3Ns990，消。;负电荷氨基酸残基 (As尹Glu)有51个，正电荷氨基酸残基(A犯+切s)有34个。实验结?
吴静, 闫艳春[6]2004年在《黑曲霉N-2植酸酶phyA基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建》文中研究指明根据已发表的植酸酶phyA基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以黑曲霉N-2总DNA为模板,扩增出不包含假定信号肽序列的phyA基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为1350bp,与已发表的黑曲霉NRRL3135的phyA基因的同源性为92.4%(不计内含子),编码1个含449个氨基酸残基的蛋白质,推导的氨基酸序列同源性为95.1%。将该基因与分泌型载体pPIC9K连接,构建了植酸酶基因的重组酵母表达载体pPIC9K/phyA。
邹立扣[7]2004年在《枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因在大肠杆菌中的表达及玉米表达载体的构建》文中研究说明本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02中性植酸酶phyC基因为目的基因(GenBank Accession No．AY220075)，在成熟肽序列之前设计上游引物，在终止密码子处设计下游引物(引入BamHⅠ／SalⅠ)。用含高保真度的聚合酶TaqPlus进行扩增，得到了大小约1.1kb的单一条带产物，获得phyC基因表达片段，将该产物与pUC18-T载体进行连接，酶切鉴定后，经BamHⅠ和SalⅠ酶切回收处理phyC片段，连接到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌JM109，在含100μg／ml的Amp抗性的LB平板上筛选后，经菌落PCR及酶切鉴定，获得阳性克隆菌株。用终浓度为0.1mM IPTG在含100μg／ml的Amp抗性的LB中诱导表达，酶活测定结果表明，表达产物具有植酸酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带，相对分子量(Mr)为69kD，30℃诱导3h后，表达的目的蛋白量占菌体总蛋白的47.4％。 在成熟肽序列之前设计上游引物，在终止密码子处设计下游引物(引入BamHⅠ／SacⅠ)。用含高保真度的聚合酶TaqPlus进行扩增，得到了phyC基因表达片段，将该产物与pUCm-T载体进行连接，酶切鉴定后，将该产物经BamHⅠ和SacⅠ酶切处理后连接到含有胚乳特异性启动子(EGH5 promoter)的中间载体pBPC47的多克隆位点上，转化大肠杆菌JM109菌株，在含100μg／ml的Amp抗性的LB平板上筛选到了的阳性菌落。质粒酶切分析和菌落PCR分析结果表明获得了pBPC-phyC重组质粒；在分析了pBPC47载体的基础上，选用了叁酶切，先用BglⅡ和HindⅢ双酶切中间重组载体pBPC-phyC，再用Xhol单酶切，回收了叁酶切片段，把启动子-phyC-终止子(EGH5-phyC-NOS)片段插入到经HindⅢ、BamHⅠ双酶切的表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点，转化大肠杆菌JM109后，经60μg／ml Kana抗性筛选、菌落PCR、质粒酶切鉴定后，筛选到了阳性转化菌落，质粒酶切分析结果表明获得了pB-C-phyC重组表达载体，并用基因枪法成功转化玉米愈伤组织。 本研究为中性植酸酶基因在微生物及植物中的高效表达奠定了良好的基础，具有重要的学术价值和应用前景。
王严[8]2007年在《曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究》文中提出植酸酶作为一种单胃动物饲料添加剂，其饲喂效果已经在世界范围内得到确认。但目前植酸酶在饲料中的推广应用还相当有限，究其原因主要有二：一是天然材料中植酸酶含量太低导致植酸酶生产成本过高；二是当前商业植酸酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。通过从自然界筛选具备良好饲用酶潜质的植酸酶产生菌，利用分子生物学技术获得植酸酶基因，再将基因高效表达在生物反应器中是解决上述问题的一个策略，业已成为植酸酶的世界性研究热点之一。本研究从土壤中筛选出一株黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶产生菌和一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶产生菌，克隆了二者的植酸酶基因，并将其高效表达在毕赤酵母中，获得了性质优良的基因工程植酸酶。另外，本研究将烟曲霉植酸酶成功表达在烟草中，首次利用植物生物反应器生产这类耐热植酸酶，为其今后的生产开辟了一条新途径，同时，鉴于植物基因工程在解决作物有效利用土壤有机磷资源上所具备的潜能，对转基因烟草在磷胁迫条件下的生长状况也进行了分析。具体实验内容及结果如下：1．利用植酸钙平板初筛和摇瓶复筛的方法，在30℃和45℃分别获得植酸酶产生菌WY-6和WY-2，酶活力均达到0.14U／mL。菌株WY-6所产植酸酶的最适pH为3.0，最适温度为55℃；菌株WY-2所产植酸酶的最适pH为5.5，最适温度亦为55℃。二者分别被鉴定为黑曲霉菌和烟曲霉菌，在中国工业微生物菌种保藏中心的菌种收录号为CICC 40700和CICC 40699。2．通过PCR扩增的方法获得来源于黑曲霉WY-6和烟曲霉WY-2的植酸酶基因全序列，分别命名为phyA(GenBank accession no．AY745739)和fphyA(GenBank accession no．AY745738)。phyA全长1506bp，共编码467个氨基酸；fphyA全长1459bp，共编码465个氨基酸。由phyA所推导的氨基酸序列与黑曲霉NRRL3135植酸酶具有97％的同源性；由fphyA所推导的氨基酸序列与烟曲霉ATCC34625植酸酶具有91％的同源性，与黑曲霉NRRL3 135植酸酶具有66％的同源性。3．将phyA克隆到表达载体pPIC9K中，电击转入毕赤酵母GS115，获得黑曲霉WY-6植酸酶基因工程酵母GS115／phyA。经甲醇诱导60h后，GS115／phyA的产酶达到最高峰，酶活力达到28.2U／mL，为出发菌株酶活力的200倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离子交换层析叁个分离步骤后，重组植酸酶得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为147U／mg，分子量约为67kDa；在pH2.5～6.5范围内均具有较高酶活性，两个最适pH分别为3.0和5.5；最适温度为55℃；以植酸钠为底物时的K_m为0.112mmol／L，K_(cat)为243／s；与胃蛋白酶以0.01的比率(pepsin／phytase，wt／wt)混合作用2h后，仍保留70.9％的残余酶活力。4．将fphyA克隆到表达载体pPIC9K中，电击转入毕赤酵母GS115，获得烟曲霉WY-2植酸酶基因工程酵母GS115／fphyA。经甲醇诱导60h后，GS115／fphyA的产酶达到最高峰，酶活力达到16U／mL，为出发菌株酶活力的114倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离子交换层析及凝胶过滤层析四个分离步骤后，重组植酸酶得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为51U／mg，分子量约为88kDa；仅在酸性范围内呈现酶活性，最适pH为5.5；最适温度为55℃；具有较高耐热能力，90℃处理15min后，保留43.8％的残余酶活力；可水解多种磷酸底物，其中对植酸钠的特异性最高，以植酸钠为底物时的K_m为0.114mmol／L，K_(cat)为102／s；与胃蛋白酶以0.1的比率(pepsin／phytase，wt／wt)混合作用2h后，仍具有90.1％的残余酶活力；蛋白二级结构受溶液pH值影响，在pH6.0时的α-螺旋含量最高(35.6％)。5．将含烟草钙调蛋白信号肽序列的烟曲霉WY-2植酸酶基因组成型表达在烟草中。PCR鉴定和Southern杂交分析表明植酸酶基因已整合到烟草的基因组DNA中；RT-PCR和Western杂交结果说明植酸酶基因已成功转录并在蛋白水平上得到表达。转基因烟草经土培4周后达到了最高的植酸酶表达水平，其叶片中的植酸酶含量达到总可溶蛋白的2.3％，酶活力为野生型烟草的13倍。重组植酸酶的分子量约为63kDa；最适pH为5.5；最适温度为55℃；具有较高耐热能力，90℃处理15min后，仍保持28.7％的残余酶活力。6．在烟草钙调蛋白信号肽的引导下，重组植酸酶由转基因烟草的根分泌到体外。水培40天后，转基因烟草培养基中的植酸酶含量达到烟草根分泌蛋白的2.012％，酶活力为野生型烟草的15.3倍。以植酸盐为唯一磷源的培养条件下，转基因烟草的生长状况明显好于野生型烟草，生长45天的转基因烟草的地上部干重、根干重、总磷含量分别为对照烟草的2.0、1.5、2.7倍。进一步分析培养基中植酸盐的消耗情况表明磷营养的提高与植酸酶基因的表达有关。
马孟根[9]2001年在《黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段的克隆及pPIC9K重组酵母表达载体的构建》文中指出采用改良二次沉淀法从黑曲霉N25中抽提出细胞总DNA。根据本课题组已经测定出的，并在GenBank中注册的黑曲霉N25植酸酶phyA基因的全序列（Accession No. AF218813），从信号肽序列切割位点序列之后（第19个氨基酸之后）设计上游引物（设计一个EcoRI酶切位点）；在终止密码子处设计下游引物（设计两个酶切位点KpnⅠ和NotⅠ）。用高保真度的聚合酶Advantage-HF PCR Kit进行表达片段扩增，通过对PCR条件的优化，得到了大小约1.4kb的单一条带产物。将该产物经EcoRⅠ和KpnⅠ酶切处理后连接到pUC18载体上，转化大肠杆菌JM109菌株，在含Amp和x-gal的LB平板上筛选到了白色的阳性菌落。质粒酶切分析结果表明获得了pUC18-phyA重组质粒（命名为pANP-1）；测序结果表明，表达片段除不含有信号肽和内含子外，其序列与黑曲霉N25植酸酶phyA基因相对应的序列完全一致。采用EcoRⅠ和NotⅠ内切酶从pANP-1质粒中酶切出phyA基因表达片段，插入到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K的多克隆位点，并转化大肠杆菌DH5a菌株，用光生物素标记的phyA基因探针进行原位杂交，筛选到了阳性转化菌落，质粒酶切分析结果表明获得了pPIC9K—phyA重组表达载体，命名为pPNP-1。pPNP-1重组表达载体的构建为phyA基因在毕赤巴斯德酵母中的高效表达奠定了基础。
邹立扣[10]2007年在《优化设计的植酸酶phyC基因及phyA～m-phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达研究》文中研究表明植酸酶作为畜禽及水产等动物的一种绿色饲料添加剂，已日益广泛使用于饲料工业中，其使用效果已在世界范围内得到了确证。根据其最适pH值，植酸酶主要分为酸性(EC3．1．3．8，phyA基因编码)及中性植酸酶(EC3．1．3．26，phyC基因编码)。其中来源于真菌的酸性植酸酶，其酶促反应的pH有效作用范围在2.5～5.5之间，目前，以对真菌来源的酸性植酸酶研究最多，并进行了规模化发酵生产。而中性植酸酶其酶促反应的pH有效作用范围在6～9之间，由于研究较少，产酶量较低等原因的尚无商品投入市场。而对于融合植酸酶的研究也未见报道。为提高中性植酸酶的产量，本论文首次优化设计了中性植酸酶phyC基因，获得了优化设计的phyCs基因，并现实了其在毕赤巴斯德酵母的表达；为拓宽植酸酶的pH作用范围，降低生产成本，本研究创造性地将酸性植酸酶phyA~m及中性植酸酶phyCs基因融合连接，并首次现实了融合基因phyA~m-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达；完成了对重组酵母菌的液体发酵实验；并对重组植酸酶的酶学性质进行了研究。本论文主要开展了以下研究：1．从课题组成功克隆的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02中性植酸酶基因phyC(GenBankNo：AFAY220075)出发，对phyC基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1152bp，编码一个383个氨基酸的多肽，其中编码成熟肽基因序列长1074bp，编码358氨基酸成熟肽。其中(G+C)％含量为46.2％，密码子第叁位(G+C)％碱基含量为56.7％；加上毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)％为44.3％，密码子第叁位(G+C)％碱基含量为43.6％。按P．pastoris密码子偏爱性，密码子分析显示基因中RSCU值＜0.3的密码子数量为118个，占整个基因密码子的33％。对phyC基因mRNA分析表明，phyC基因mRNA折迭后最小自由能△G=-437.30 kcal／mol，其起始密码子被包裹在mRNA折迭所形成的发夹环中。2．确定优化方案设计phyC基因，并首次人工合成phyCs基因。全方位改造天然phyC基因序列，根据毕赤酵母密码子偏爱性，去除植酸酶基因中酵母表达低频密码子，替换为酵母高频密码子，获得能在毕赤酵母中高效表达的中性植酸酶优化基因长度为1074bp的phyCs，改造后的基因与phyC基因的同源率为73.5％，(G+C)％变为49.1％，密码子第叁位GC碱基含量变为60.1％；加上毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)％变为46.2％，密码子第叁位GC碱基含量变为52％；消除了序列中的AT富含区；自由能△G由提高至-434.90kcal／mol，其起始密码子并为被包裹在mRNA折迭所形成的发夹环中；在合成基因上游5’端加入SnaBI酶切位点，下游3’端加入NotI酶切位点，以便基因转入表达载体pPIC9K。3．经克隆及序列测定后，首次构建了优化中性植酸酶基因酵母表达载体pPIC9K-phyCs。经SacI线性化后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，实现了phyCs基因在酵母中的分泌表达。结果表明，经甲醇诱导摇瓶发酵120h后，优化phyCs基因重组酵母酶活达到18.5U／ml(WEBI)为优化前酶活的9倍，经液体分批补料发酵96h后，中性植酸酶酶活达到54U／m1(wBSG)，由此可见，中性植酸酶产量得到大幅度提高，SDS-PAGE分析显示，诱导植酸酶的分子量为51kDa，去糖基化后植酸酶大小为42kDa。4．为拓宽植酸酶的pH作用范围，生产出满足单胃动物及水产动物的新型植酸酶，降低生产成本，构建了植酸酶融合phyA~m-phyCs基因表达载体pPIC9K-A~mCs。从酸性植酸酶基因phyS(GenBank No：AF218813)出发，根据phyA~m(经81位、82位Arg密码子进行同义突变)、phyCs基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体pPIC9K多克隆位点序列特点，采用PCR法获得植酸酶phyA~m基因表达片段(上游插入SnaBI酶切位点，下游插入AvrⅡ酶切位点)，将扩增片段连入pUCm-T获得克隆载体pUCm-phyA~m；采用PER法获得植酸酶phyCs基因表达片段并加入接头(G_4S)_3(上游插入AvrⅡ酶切位点，下游插入NotⅠ酶切位点)，将扩增片段连入pUCm-T获得克隆载体pUCm-phyCs。AvrⅡ，NotⅠ双酶切克隆载体pUCm-phyCs及表达载体pPIC9K，成功构建了融合植酸酶基因中间表达载体pPIC9K—phyCs。经酶切及序列测定后，SnaBI，AvrⅡ双酶切pPIC9K-phyCs及pUCm-phyA~m，本研究创造性地酸性植酸酶phyA~m及中性植酸酶phyCs基因融合连接，并构建了表达载体pPIC9K-phyA~mCs。5．BspEI线性化表达载体pPIC9K-phyA~mCs后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，首次实现了融合基因phyA~m-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达。经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，首次实现了phyA~m-phyCs融合植酸酶基因在毕赤巴斯德酵母中分泌表达。研究结果表明，经甲醇诱导摇瓶发酵120h后，酶活达到20.5U／ml(wEBI)。发酵结果显示，发酵84h后融合植酸酶的酶活达到176U／ml。SDS-PAGE分析表明，诱导融合植酸酶糖基化较严重，去糖基化后植酸酶大小为94.6kDa，而酸性植酸酶去糖基化后大小为52.6kDa，由此可见融合植酸酶于酵母中表达成功。6．对表达中性植酸酶、融合植酸酶的酶学性质进行了研究。经过硫酸铵沉淀、乙醇丙酮沉淀、透析、浓缩及层析离子交换纯化后，测定了重组中性及融合植酸酶的热稳定性值、最适反应pH值及最适反应温度等酶学性质。结果显示重组中性植酸酶最适反应温度为70℃，最适pH值为7.5，pH6-9时植酸酶保持了较高的酶活性，80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在97％及83％左右。与未优化前相比，pH作用范围从6-8扩大为6-9，最适反应温度提高了5℃，热稳定性相差不大。去糖基化后测定酶学性质显示植酸酶最适反应温度、最适pH值没有发生变化，但热稳定性下降，80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在77％及70％左右，比去糖基化前下降20％及13％。由此可见，优化重组植酸酶与未优化前植酸酶酶学性质相比，最适反应温度提高，pH值作用范围增大，糖基化对中性植酸酶的热稳定性有较大影响。融合植酸酶纯化后，结果显示重组融合植酸酶最适反应温度为55℃，最适pH值出现叁个峰值分别为2.5，5.5-6.0及7.0，pH5.5时酶活最高，pH7.0时候酶活为5.5的84％，pH2.5时酶活为5.5的82％。80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在63％左右，85℃、90℃、95℃及100℃处理5分钟及10分钟残留均保留在50％-60％左右。由此可见，融合植酸酶pH作用范围变宽，其在pH2.5-7范围内均能保持较高酶活，与酸性植酸酶相比融合植酸酶的热稳定性也有一定的提高。本文首次实现了优化设计并人工合成的中性植酸酶基因phyCs在毕赤巴斯德酵母中的表达，与未优化相比酶活提高了9倍；创造性地现实了融合植酸酶基因phyA~m-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达，表达的融合植酸酶具有较宽的pH作用范围，其在pH2.5-7范围内均能保持较高酶活，且具有较好的热稳定性；首次完成了对重组中性、酸性植酸酶酵母菌的液体发酵实验，中性植酸酶及融合植酸酶液体分批补料发酵后，酶活分别达到58U／ml和176ml。
参考文献：
[1]. 黑曲霉N25植酸酶phyA基因玉米表达载体的构建[D]. 于新芬. 四川农业大学. 2003
[2]. 植酸酶基因（phyA）转化玉米的研究[D]. 沈亚欧. 四川农业大学. 2005
[3]. 黑曲霉植酸酶phyA基因的分离及转化拟南芥的研究[D]. 张馨月. 吉林农业大学. 2013
[4]. 基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究[D]. 陈惠. 四川农业大学. 2004
[5]. 植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究[D]. 彭远义. 西南农业大学. 2004
[6]. 黑曲霉N-2植酸酶phyA基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建[J]. 吴静, 闫艳春. 生物技术通讯. 2004
[7]. 枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因在大肠杆菌中的表达及玉米表达载体的构建[D]. 邹立扣. 四川农业大学. 2004
[8]. 曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究[D]. 王严. 大连理工大学. 2007
[9]. 黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段的克隆及pPIC9K重组酵母表达载体的构建[D]. 马孟根. 四川农业大学. 2001
[10]. 优化设计的植酸酶phyC基因及phyA～m-phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达研究[D]. 邹立扣. 四川农业大学. 2007