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土霉素高效降解菌OTC-16的降解特性及耐药性初探

2020-12-02阅读(379)

土霉素高效降解菌OTC-16的降解特性及耐药性初探

论文摘要

土霉素是四环素类抗生素中的一种,因其成本低、易使用,常在畜牧业中作为饲料添加剂来预防动物疾病并促进动物生长。然而土霉素在畜牧业中的广泛应用和不彻底降解,造成了普遍的环境残留和抗性基因扩散,严重威胁了人类生存和安全。自然环境中微生物降解是去除抗生素残留的主要手段。本研究在前期筛选获得一株能够降解土霉素的菌株OTC-16的基础上,利用传统结合分子生物学手段对该菌株进行了鉴定;从接种量、初始pH、温度等角度出发研究了菌株发挥降解效应的环境适应性;对在不同pH条件下菌株在土壤中降解土霉素的实际应用效应进行了评估;最后利用生物信息学手段挖掘了该菌株的相关耐药基因并对菌株的实际抗药性进行了测定。研究结果如下:（1）利用传统结合分子手段将该菌株鉴定为Arthrobacter nicotianae。除土霉素外,菌株OTC-16还在一定程度上对四环素和金霉素有降解作用。对菌株的作用机制初步研究发现,菌株OTC-16主要通过生化降解途径降低土霉素浓度而非简单的菌体表面吸附,而降解相关活性物质主要通过分泌于胞外发挥作用。研究了菌株OTC-16发挥土霉素降解效应的环境适应范围,结果表明OTC-16菌株在pH 6.0-10.0生长良好,对碱性环境有较强的适应性;对土霉素具有较高的耐受性,在土霉素含量0 mg·L-1-500mg·L-1范围,OTC-16菌株均能生长良好。其中在接种量、初始pH、温度和土霉素初始浓度分别为3%（v/v）、pH 9.0、30℃和150 mg·L-1时,菌株OTC-16对土霉素的降解效果最好。（2）土壤模拟试验评估了菌株OTC-16在不同土壤中的应用效果。实验结果表明,本研究获得的降解菌OTC-16在碱性的土壤环境中去除土霉素残留具有独特的优势。培养10 d后,添加的降解菌对在酸性、中性和碱性土壤中的土霉素的降解率分别提高了16.0%,6.3%和40.7%,且添加菌株不会对上述土壤的理化性质有不良改变。添加粪肥和秸秆能够提高土壤中有机质含量,但是会抑制土壤中土霉素的降解。因此为解决这个矛盾,在生产实践中建议去除抗生素残留和改良土壤分时段进行。对土壤中的16S rRNA和18S rRNA基因丰度分析发现,降解菌OTC-16、粪肥和秸秆的添加均能显著增加三种土壤中细菌的数量,且粪肥的作用效果更明显;秸秆本身对土壤中细菌的增加作用不明显,但与降解菌混合施用后,在碱性土壤中细菌数量激增。降解菌OTC-16的添加对三种土壤中真菌的数量几乎没有影响,而粪肥和秸秆却能显著提高酸性和中性土壤中真菌的数量。（3）对土霉素降解菌OTC-16的全基因组测序表明,其基因组总长度为3 797 724bp;含有一个大小为3 643 989 bp的环状染色体和两个质粒（一为线形,一为环状,大小分别为123 894 bp和29 841 bp）。通过基因注释,共获得3 561个基因,其中耐药基因有23个,大部分分布在质粒上。通过耐药基因（ARDB）数据库注释,我们得知,OTC-16基因组中存在多种耐药基因TetV、Tet33、sul1、ant2ia、vanre、vanrc、cmle6、cmle8、catb3、cara。其中TetV和Tet33属于外排泵基因,而Tet33至今报道较少。耐药谱试验表明OTC-16菌株能够耐受土霉素、四环素、磺胺单甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑等15种抗生素。与经生物信息学手段预测的耐药基因基本具有一致性,实验初步揭示了菌株的耐药机制。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 文献综述
  •   1.1 抗生素使用对环境的影响
  •     1.1.1 农药残留的污染现状及毒害
  •     1.1.2 抗生素的使用现状
  •   1.2 土霉素的危害
  •     1.2.1 土霉素的理化性质
  •     1.2.2 土霉素的使用现状
  •     1.2.3 土霉素的生态毒性
  •   1.3 国内外研究进展
  •     1.3.1 非生物降解
  •     1.3.2 生物降解
  •     1.3.3 四环素类抗生素降解途径及降解产物
  •   1.4 研究目的、意义及内容
  •     1.4.1 研究目的及意义
  •     1.4.2 研究内容
  •     1.4.3 技术路线
  •     1.4.4 课题来源
  •     1.4.5 创新点
  • 2 土霉素高效降解菌OTC-16的鉴定及降解特性研究
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 供试菌株
  •     2.1.2 培养基及试剂
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 菌株形态及生理生化鉴定
  •     2.2.2 16S rRNA鉴定及菌株遗传学分析
  •     2.2.3 抗生素残留浓度测定及降解率计算
  •     2.2.4 OTC-16菌株的生长曲线、降解曲线及环境耐受性
  •     2.2.5 OTC-16菌株对其他四环素类抗生素的降解
  •     2.2.6 OTC-16菌株对土霉素降解机制的研究
  •     2.2.7 菌株OTC-16降解土霉素的环境适应性
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 菌株鉴定
  •     2.3.2 OTC-16菌株的生长曲线、降解曲线及环境耐受性
  •     2.3.3 OTC-16菌株对其他四环素类抗生素的降解作用
  •     2.3.4 OTC-16菌株对土霉素降解机制的研究
  •     2.3.5 菌株OTC-16的土霉素降解环境适应性
  •   2.4 结论
  • 3 土壤模拟试验评估OTC-16菌株在不同土壤中应用效果
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 试验材料与试剂
  •     3.1.2 试验方法
  •     3.1.3 土壤中土霉素的萃取及土霉素残留测定
  •     3.1.4 土壤中16S rRNA和18S rRNA的 qPCR检测
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 不同酸碱度土壤理化性质的变化
  •     3.2.2 不同酸碱度土壤对土壤中土霉素降解的影响
  •     3.2.3 添加外源添加物对土壤中土霉素降解的影响
  •     3.2.4 不同外源添加物对土壤中16S rRNA和18S rRNA基因丰度的影响
  •   3.3 结论
  • 4 土霉素降解菌OTC-16全基因组测序及耐药性研究
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 菌种复苏及扩大培养
  •     4.1.2 测序公司及平台
  •     4.1.3菌株的耐药谱实验
  •   4.2 基因组组装结果与分析
  •     4.2.1 基因组组装
  •     4.2.2 GC-Depth评估
  •     4.2.3 基因组组分
  •   4.3 基因组序列功能注释
  •     4.3.1 COG数据库注释
  •     4.3.2 GO数据库注释
  •     4.3.3 KEGG数据库注释
  •   4.4 OTC-16耐药基因
  •     4.4.1 挖掘耐药基因
  •     4.4.2 OTC-16耐药谱试验
  •   4.5 结论
  • 5 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 附录
  •   附录1
  • 个人简介
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 史艳可

    导师: 张昕

    关键词: 土霉素,降解菌,降解特性,土壤,耐药基因

    来源: 浙江农林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

    单位: 浙江农林大学

    基金: 国家自然科学基金常规面上项目《土霉素高效降解菌ZAF-05的降解途径及分子机制研究 31670110》,国家自然科学基金项目《畜禽粪便中兽用抗生素污染驱动下菜田土壤微生物响应特征研究 31672234》

    分类号: X172;X53

    总页数: 79

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