鸭疫里默氏杆菌gldN和tbdR3基因缺失株的构建及其生物学特性分析

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是出现在鸭、鹅和火鸡等多种禽类的一种重要病原菌,其感染给养鸭业带来严重的经济损失。为了有效的防治鸭疫里默氏杆菌,我们从分子水平对其生物学机制进行研究。IX分泌系统（T9SS）,又称为Por分泌系统,是近年来鉴定的、目前仅发现于拟杆菌门中细菌的分泌系统。GenBank上已公布全基因组序列的所有8株鸭疫里默氏杆菌都携带13个编码T9SS核心组分的基因,提示此细菌有完整的IX型分泌系统。因此,T9SS作为鸭疫里默氏杆菌唯一已知的分泌系统,在该细菌与宿主的相互作用及细菌致病过程中作用就尤其值得关注。本研究将通过构建Yb2株gldN基因缺失株来分析其相关的功能。本研究先将gldN基因上下游同源臂连入自杀质粒313,通过接合转导的方法导入鸭疫里默氏杆菌Yb2株,构建获得gldN基因缺失突变株Yb2△gldN;然后将野生株Yb2株的gldN基因ORF连入大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭表达质粒pRES1,再通过接合转导的方法将重组质粒pRES1-gldN导入缺失株Yb2△gldN中,获得了其回复株cYb2△gldN。然后比较了野生株Yb2、缺失株Yb2△gldN和回复株cYb2△gldN的部分生物学特性。结果表明,缺失株Yb2△gldN在TSB中的生长速度与野生株Yb2株相比无显著性差异;蛋白酶水解试验表明,细菌在培养24小时后,缺失株Yb2△gldN菌落周围未发现水解蛋白产生的透明圈,而野生株Yb2及回复株菌落周围均出现透明圈,且大小相近;与野生株相比,缺失株Yb2△gldN对Vero细胞的粘附入侵能力显著性降低;雏鸭致病性试验的结果表明,缺失株Yb2△gldN对8日龄雏鸭的的半数致死量（LD50）较野生株升高了约54倍,且感染雏鸭的血液、肝脏和脑组织中的细菌载量均显著低于野生株,而回复株可在一定程度上回复gldN基因缺失导致的致病性和细菌载量的降低。以上结果表明gldN基因与鸭疫里默氏杆菌的致病性相关。另外,本实验室的前期研究表明,CH3株的375#转座子插入突变株不能凝集血清1型的阳性血清且不致死雏鸭,反向PCR的结果表明转座子插入了CH3株基因组上的TonB依赖的外膜蛋白受体（tbdR3）上,本研究将构建此基因的定向缺失株来鉴定此基因编码的蛋白是否是鸭疫里默氏杆菌的凝集相关抗原。用BLAST和PCR检测分析了不同血清型的鸭疫里默氏杆菌菌株携带情况,结果表明,血清1型的CH3、NJ-2和CQ3株、血清10型HXb2株、未确定血清型JY-6株携带tbdR3基因;而血清1型WJ4、YL4和YXb12株不携带tbdR3基因。表明tbdR3不是血清1型鸭疫里默氏杆菌特有的及保守的基因。运用上述自杀质粒同源重组的方法构建了血清1型鸭疫里默氏杆菌CH3株、NJ-2株和CQ3株的tbdR3缺失突变株CH3△tbdR3、NJ2△tbdR3和CQ3△tbdR3,以及其相应的回复株cCH3△tbdR3、cNJ2△tbdR3和cCQ3△tbdR3。对各缺失株生物学特性分析发现,缺失株CH3△tbdR3、CQ3△tbdR3、NJ2△tbdR3的生长速度与相应的野生株相比均无显著性差异;血清凝集实验的结果表明这些野生株、缺失株和回复株都能与兔抗血清1型RA的阳性血清凝集;对Vero细胞的粘附入侵试验发现,除了NJ2及其缺失株回复株对粘附入侵能力较弱外,缺失突变株CH3△tbdR3、CQ3△tbdR3对Vero细胞的粘附入侵能力都比其野生株强;对雏鸭致病性研究结果表明,tbdR3基因的缺失株CH3△tbdR3,回复株cCH3△tbdR3以及其野生株CH3均不能致死雏鸭。本研究有助于解析鸭疫里默氏杆菌分子致病机制和相应的基因功能等。

论文目录

摘要

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第一章引言

1.1 鸭疫里默氏杆菌研究进展

1.1.1 病原学

1.1.2 流行病学

1.1.3 鸭疫里默氏杆菌的防治

1.1.4 致病因子的研究进展

1.2 分泌系统研究进展

1.2.1 已知分泌系统研究进展

1.2.2 IX分泌系统的研究进展

第二章鸭疫里默氏杆菌GLDN基因缺失株的构建及其生物学特性研究

2.1 材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 工具酶及试剂

2.1.3 试剂的配制

2.1.4 抗生素的配制

2.1.5 主要的仪器

2.1.6 引物设计

2.2 方法

2.2.1 感受态细胞的制备

2.2.2 Yb2 株全基因组的提取

2.2.3 gldN基因缺失株的构建

2.2.4 Yb2△gldN缺失株回复株的构建

2.2.5 gldN基因突变株的生物学特性研究

2.3 结果

2.3.1 gldN基因突变株的构建

2.3.2 缺失株Yb2△gldN回复株的构建

2.3.3 gldN基因缺失株生长曲线的测定

2.3.4 gldN基因缺失株酶水解实验

2.3.5 gldN基因缺失株粘附入侵能力实验

2.3.6 gldN基因缺失株LD50 的测定

2.4 讨论

第三章鸭疫里默氏杆菌TBDR3 基因缺失株的构建及其生物学特性研究

3.1 材料

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 工具酶及试剂

3.1.3 试剂的配制

3.1.4 引物的设计

3.2 方法

3.2.1 菌株的复壮

3.2.2 CH3、NJ-2、CQ3 基因组的提取

3.2.3 tbdR3 基因缺失株的构建

3.2.4 tbdR3 基因缺失株回复株的构建

3.2.5 tbdR3 基因缺失株的生物学特性研究

3.3 结果

3.3.1 鸭疫里默氏杆菌tbdR3 基因缺失株的构建

3.3.2 tbdR3 基因回复株的构建

3.3.3 tbdR3 基因缺失株凝集活性的测定

3.3.4 tbdR3 基因缺失株生长曲线的测定

3.3.5 tbdR3 基因缺失株粘附入侵能力实验

3.3.6 tbdR3 基因缺失株LD50 的测定

3.4 讨论

第四章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨永胜

导师: 胡青海

关键词: 鸭疫里默氏杆菌,基因缺失,致病性

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.61

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鸭疫里默氏杆菌gldN和tbdR3基因缺失株的构建及其生物学特性分析

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