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基于foldon介导阿魏酸酯酶的寡聚化对催化性能的影响

2020-12-08阅读(282)

基于foldon介导阿魏酸酯酶的寡聚化对催化性能的影响

论文摘要

阿魏酸酯酶（feruloyl esterase,FAE,EC 3.1.1.73）是羧酸酯酶的一个亚类,它能水解植物细胞壁中阿魏酸与多糖之间连接的酯键,使得木质纤维素原料变得疏松,从而将阿魏酸释放出来。FAE在食品、饲料、医药、造纸、化妆品、生物合成等领域有广泛的应用前景。目前,FAE的催化性能仍有较大提升空间,因此FAE的改造意义深远。本文基于foldon可自发形成寡聚化结构的特性,通过末端融合短肽foldon对FAE进行改造,并对重组FAE活性、酶学性质、寡聚化结构进行探究。主要研究结果如下:（1）从Uniprot数据库中筛选出FAE O42807,根据毕赤酵母密码子偏好性表达将其氨基酸序列转换成fae基因序列,化学合成fae、fae-foldon基因序列,并连接至质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-fae、pPIC9K-fae-foldon。将表达质粒电转化至毕赤酵母GS115中,经PCR验证表明,成功获得基因工程菌GS1115/pPIC9K-fae、GS1115/pPIC9K-fae-foldon。（2）设计含有His标签的引物,将其克隆至表达载体pPIC9K-fae及pPIC9K-fae-foldon,成功构建表达载体pPIC9K-His-fae、pPIC9K-His-fae-foldon,电转化至毕赤酵母GS115中,诱导培养后,发酵液经Ni层析柱收集洗脱液,GS115/pPIC9K-His-fae洗脱液经SDS-PEGE分析显示在40 kD处有单一蛋白条带（命名为mon-FAE2）,GS115/pPIC9K-His-fae-foldon洗脱液经SDS-PEGE分析显示有3条蛋白条带,分别为45 kD处的蛋白条带（命名为pro-olig-FAE2）、110kD处的蛋白条带（命名为tri-FAE2）及240 kD处的蛋白条带（命名为six-FAE2）,经测定mon-FAE2的FAE发酵液的酶活力为251.09±7.61 U/L,比活力为0.36±0.011 U/mg;multi-FAE2（mon-FAE2、tri-FAE2及six-FAE2的混合物）的FAE酶活力为440.78±12.7 U/L,比活力为1.63±0.045 U/mg。（3）为了减少FAE寡聚化时的空间位阻作用,在fae和foldon基因之间插入一段大小为1.63 kD的linker序列,成功构建表达载体pPIC9K-His-fae-linker-foldon,电转化至毕赤酵母GS115中,诱导表达后发酵液经Ni层析柱收集洗脱液,洗脱液经SDS-PAGE分析显示也有3条蛋白条带,分别为45 kD处蛋白条带（命名为pro-olig-FAE3）、110 kD处的蛋白条带（命名为tri-FAE3）及240 kD处蛋白条带（命名为six-FAE3）,经测定six-FAE3的FAE发酵液的酶活力为334.14±11.24 U/L,比活力为1.74±0.063 U/mg。（4）重组FAE理化性质为:三种结构的FAE最适反应温度均为50℃,mon-FAE2、multi-FAE2及six-FAE3在50℃的半衰期分别为99.6 min、129 min及222min。mon-FAE2的最适反应pH为6.0,且在pH为6.0时稳定性较好,multi-FAE2及six-FAE3的最适pH为5.0,且在pH为5.0时稳定性较好。对于mon-FAE2,Mn2+、Mg2+对其有促进作用,K+、Ca2+、Fe3+及Cu2+对其有一定的抑制作用,而Zn2+对其有显著的抑制作用,对于multi-FAE2及six-FAE3,Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe3+及Cu2+对其有促进作用,K+对其有一定的抑制作用。multi-FAE2较mon-FAE2的比活力提高3.53倍,Km值减小77.36%,kcat/Km值提高7.57倍。six-FAE3较mon-FAE2的比活力提高3.83倍,Km常数减小75.16%,kcat/Km提高8.67倍。（5）25℃时在透射电子显微镜下可观察到multi-FAE2及six-FAE3形成了寡聚化结构的蛋白聚集体。动态光散射结果表明随着温度的升高mon-FAE2的平均粒径保持不变,tri-FAE2及tri-FAE3的随着温度的升高逐渐解聚,直至65℃,tri-FAE2及tri-FAE3平均粒径大小与mon-FAE2平均粒径大小几乎一致,说明其已解聚为单体。本论文的实验结果为FAE分子水平的改造提供基础理论研究,该改造酶的方法简单高效,无需事先详细了解酶的3D结构,有很好的应用前景。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 阿魏酸酯酶的概述
  •     1.1.1 FAE的微生物来源
  •     1.1.2 FAE的分类
  •     1.1.3 FAE的结构与作用机理
  •     1.1.4 FAE酶学特性的研究
  •   1.2 FAE的表达
  •     1.2.1 FAE基因在E.coli中表达
  •     1.2.2 FAE基因在P.pasroris中表达
  •   1.3 FAE的应用
  •     1.3.1 FAE在植物生物质降解中的作用
  •     1.3.2 FAE在饲料工业中的应用
  •     1.3.3 FAE在调味品和酒精饮料行业中的应用
  •     1.3.4 FAE在制浆造纸工业中的应用
  •   1.4 FAE分子改造研究
  •   1.5 寡聚化结构域foldon
  •     1.5.1 Foldon概述
  •     1.5.2 Foldon的研究现状
  •   1.6 课题目的与意义
  •   1.7 课题创新点
  • 第2章 工程菌GS115/p PIC9K-fae-foldon的构建与表达
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株、质粒和工具酶
  •     2.1.2 主要实验仪器
  •     2.1.3 主要实验药品及试剂
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 培养基配方
  •     2.2.2 主要溶液配制
  •     2.2.3 目的基因的获得
  •     2.2.4 重组质粒的构建
  •     2.2.5 质粒电转化至P.pastoris GS
  •     2.2.6 阳性转化子的筛选
  •     2.2.7 重组工程菌表达检测
  •   2.3 实验结果与分析
  •     2.3.1 目的基因的构建
  •     2.3.2 重组质粒的双酶切验证
  •     2.3.3 重组质粒线性化结果
  •     2.3.4 重组转化子PCR鉴定结果
  •     2.3.5 重组菌表达产物的SDS-PAGE分析
  •     2.3.6 重组菌表达量的测定
  •   2.4 小结与讨论
  • 第3章 工程菌GS115/p PIC9K-His-fae-foldon的构建表达及酶学性质的研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株、质粒和工具酶
  •     3.1.2 主要实验仪器
  •     3.1.3 主要实验药品及试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 培养基的配制
  •     3.2.2 主要溶液的配制
  •     3.2.3 目的基因的获得
  •     3.2.4 重组质粒的构建
  •     3.2.5 重组质粒电转化P.pastoris GS
  •     3.2.6 阳性转化子的筛选
  •     3.2.7 基因工程菌表达检测
  •     3.2.8 MALDI-TOF鉴定
  •     3.2.9 重组酶酶学性质的测定
  •   3.3 实验结果与分析
  •     3.3.1 重组质粒的双酶切验证
  •     3.3.2 重组质粒线性化结果
  •     3.3.3 重组转化子PCR鉴定结果
  •     3.3.4 重组菌表达产物的SDS-PAGE分析
  •     3.3.5 重组菌表达量的测定
  •     3.3.6 纯化后的重组蛋白SDS-PAGE分析
  •     3.3.7 six-FAE2 MALDI-TOF鉴定结果
  •     3.3.8 温度对寡聚化FAE的影响SDS-PAGE分析
  •     3.3.9 重组酶酶学性质的测定
  •     3.3.10 重组酶的活性
  •   3.4 小结
  • 第4章 工程菌GS115/pPIC9K-His-fae-linker-foldon的构建表达、酶学性质的研究及寡聚化结构的探讨
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌株、质粒和工具酶
  •     4.1.2 主要实验仪器
  •     4.1.3 主要实验药品及试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 培养基的配制
  •     4.2.2 主要溶液的配制
  •     4.2.3 目的基因的获得
  •     4.2.4 重组质粒的构建
  •     4.2.5 质粒电转化至P.pastoris GS
  •     4.2.6 阳性转化子的筛选
  •     4.2.7 基因工程菌表达检测
  •     4.2.8 重组酶酶学性质的测定
  •     4.2.9 重组酶粒径的测定
  •     4.2.10 重组酶透射电子显微镜分析
  •   4.3 实验结果与分析
  •     4.3.1 目的基因的构建
  •     4.3.2 重组质粒的双酶切验证
  •     4.3.3 重组质粒线性化结果
  •     4.3.4 重组转化子PCR鉴定结果
  •     4.3.5 重组菌表达产物的SDS-PAGE分析
  •     4.3.6 重组菌表达量的测定
  •     4.3.7 纯化后的重组蛋白SDS-PAGE分析
  •     4.3.8 温度对寡聚化FAE的影响SDS-PAGE分析
  •     4.3.9 six-FAE3 酶学性质的测定
  •     4.3.10 重组酶的活性
  •     4.3.11 温度对重组酶粒径的影响
  •     4.3.12 透射电子显微镜观察重组酶结构
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 第5章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录 A FAE的氨基酸序列及基因序列
  • 附录 B foldon的氨基酸序列及基因序列
  • 附录 C linker-foldon的氨基酸序列及基因序列
  • 附录 D pPIC9K-His-fae-linker-foldon的基因序列
  • 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张雷

    导师: 李夏兰

    关键词: 阿魏酸酯酶,催化性能,酶分子改造

    来源: 华侨大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 华侨大学

    分类号: Q816

    总页数: 96

    文件大小: 8674K

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