高盐环境原核生物多样性及一株嗜盐古菌的多相分类学研究

论文摘要

嗜盐微生物,包括嗜盐古菌和嗜盐细菌,是生活于高盐环境的极端微生物。由于其特殊的生理代谢特征,它们在生产生物可降解塑料和处理工业高盐有机废水等方面具有较高的应用前景。不同形态的高盐环境,因生境不同,嗜盐微生物的组成存在较大差异。在盐湖、晒盐场和盐矿这三种典型的高盐环境中,固态盐矿的流动性差,基因交流被阻断,为物种形成提供有利条件。因此,盐矿是嗜盐微生物的物种和基因库,但相关研究相对较为缺乏,并且对于三种高盐生境物种多样性的比较研究更是鲜有报道。本研究通过纯培养和免培养两种策略,揭示了盐湖（茶卡盐湖）、海边晒盐场（海南岛晒盐场和连云港晒盐场）和盐矿（定远盐矿、云南香盐和元永井盐矿）的原核生物多样性组成;探索了环境流动性、地理隔离和埋深对高盐环境中嗜盐微生物多样性的影响。通过纯培养手段,从三种高盐环境共8个样品中分离出可培养嗜盐菌共657株,25个属。其中嗜盐古菌共441株,占67.12%,均属于为Halobacteria纲,分别为Halorubrum,Natronoarchaeum,Natrinema,Haloterrigena,Halopenitus,Halobacterium,Halococcus,Halolamina,Haloarcula,Halobaculum,Halovivax,Haloferax,Natronomonas和Natrinema等14个属。嗜盐细菌共216株,占32.88%,分别为Pseudomonas,Chromohalobacter,Aliifodinibius,Aquisalimonas,Halospina,Halobacillus,Halomonas,Virgibacillus,Rhodovibrio,Halovibrio和Oceanobacillus等11个属。嗜盐微生物分布广泛,嗜盐古菌是上述高盐环境样品中的优势类群。在三种类型的样品中,盐矿样品中分离到的菌株数量最多,占分离总数的85.24%,共22个属。采用基于免培养的克隆文库与高通量测序技术,分析了环境流动性、地理隔离和埋深三个角度对高盐环境微生物物种多样性组成的影响。研究结果表明:（1）从流动性差异看,盐湖、晒盐场和盐矿依次降低,Simpson指数分别为:0.6150、0.0206和0.0774;Shannon指数分别为:0.9757、4.3608和3.5724。说明盐湖中微生物多样性最低,但优势物种最明显;盐矿样品与晒盐场盐土样品中嗜盐微生物多样性高,但优势物种不明显;其中晒盐场盐土样品中嗜盐微生物多样性指数最高。（2）从地理隔离来看,云南盐矿样品XY和YYJ均位于云南省,相距较近;定远盐矿样品Z24位于安徽省,与其他两个样品相距较远。XY和YYJ样品得到OTU数为分别为478和493个,优势物种均属于Proteobacteria,Lentisphaerae和Epsilonbacteraeota门,且二者相同的OTU数均达到该生境下OTU总数的近二分之一;Z24样品中有OTU 2356个,明显高于云南盐矿,优势物种属于Proteobacteria,Firmicutes和Bacteroidetes门;XY、YYJ和Z24样品Simpson指数分别为:0.0537、0.0589和0.0075;Shannon指数指数分别为:4.0829、4.0753和6.6506。此外,定远盐矿属于高Fe、Mg和Mn,低Ca和SO42-且盐度高、泥沙石杂质少的环境;而云南盐矿相反,且XY和YYJ差异不大。说明定远盐矿中的物种更加丰富,与云南盐矿的两个样品差异明显较远;云南的两个样品原核生物组成较为相似。此外,离子组成和浓度以及地理隔离对高盐环境的物种多样性组成产生重要影响。（3）从埋深的角度看,定远盐矿的Z241、Z246和Z248样品埋深分别为404-409 m、367-371 m和305-310 m;OTU数分别为1328、1303和1304个,优势物种均为Firmicutes,Proteobacteria和Bacteroidetes门;Shannon指数均为6.1左右。说明埋深对定远盐矿中嗜盐微生物在门级水平的组成影响不明显。盐矿生境的异质性明显,基因交流被阻断,有利于物种的形成。在对云南盐矿进行纯培养分离的过程中,发现了1株分离嗜盐古菌可能新种,并对其进行了多相分类学鉴定。根据生理生化特征差异、极性脂种类、16S rRNA基因和rpoB’基因序列相似度和系统发育分析、DNA G+C含量以及近缘物种DNA-DNA杂交结果,提出菌株ZY8代表了盐红菌属的一个新种。因它能在以谷氨酸盐为唯一碳源和能源的基本培养基中较好生长,故将菌株ZY8所代表的新种命名为Halorubrum glutamatedens,菌株ZY8T为该物种的标准菌株（=CGMCC1.16026T=NBRC 112866T）。本研究通过纯培养分离积累了一大批嗜盐微生物菌种资源;通过流动性、地理隔离和埋深三个角度分析了它们对高盐生境中嗜盐微生物种群分布的影响规律;成功鉴定了一株盐矿来源的嗜盐古菌盐红菌属新种。这增加了对高盐环境物种多样性组成的认识,为更好地开发利用高盐环境微生物资源奠定重要基础。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 高盐环境的生物资源分布

1.2 嗜盐微生物的简介

1.2.1 嗜盐微生物的定义

1.2.2 嗜盐菌的发现及早期研究历史

1.2.3 嗜盐菌的耐盐机制

1.2.4 嗜盐微生物的应用

1.3 嗜盐菌系统分类学研究

1.3.1 嗜盐古菌系统分类地位的确立及发展

1.3.2 嗜盐菌分类学研究方法

1.4 高盐环境嗜盐微生物多样性组成的研究

1.4.1 当前多样性研究的常见方法

1.4.2 几种高盐环境中多样性组成的研究现状

1.5 云南盐矿的研究概述

1.5.1 云南盐矿的特点

1.5.2 云南盐矿嗜盐微生物组成研究概况

1.6 定远盐矿的概况

1.7 本研究主要内容及意义

1.7.1 研究内容

1.7.2 研究意义

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品

2.1.2 培养基

2.1.3 引物

2.1.4 菌株

2.1.5 常用质粒与试剂

2.2 研究方法

2.2.1 盐矿理化性质的测定方法

2.2.2 菌株分离及16S rRNA初步鉴定

2.2.3 菌株的保藏

2.2.4 环境中总DNA的提取

2.2.5 DNA片段克隆及检测

2.2.6 Illumina HiSeq测序分析方法

2.2.7 系统发育分析

2.2.8 嗜盐古菌多相分类学鉴定

第三章生境、埋深以及地理隔离对物种多样性组成的影响

3.1 样品的采集及理化性质

3.1.1 样品的采集

3.1.2 部分样品理化性质的测定

3.2 可培养菌株的培养及纯化

3.2.1 样品的前期处理

3.2.2 嗜盐微生物的培养与分离

3.2.3 分离菌株的16S rRNA鉴定

3.3 免培养样品的制备

3.3.1 总DNA的提取

3.3.2 总DNA质量检测

3.4 三种高盐环境的流动性差异对嗜盐微生物多样性组成的影响

3.4.1 可培养数据分析

3.4.2 免培养数据分析（克隆文库）

3.4.3 小结

3.5 地理隔离对微生物物种多样性组成的影响

3.5.1 可培养数据分析

3.5.2 免培养数据分析（Illumina HiSeq测序分析）

3.5.3 小结

3.6 不同埋深对微生物物种多样性组成的影响

3.6.1 样品性质分析

3.6.2 测序数据质量评估

3.6.3 OTU分析

3.6.4 物种注释及分类学分析

3.6.5 小结

3.7 讨论与总结

第四章一株嗜盐古菌新物种的多相分类学鉴定

4.1 初步确定分类学地位

4.2 形态学特征

4.3 系统发育分析

4.3.1 同源性比对

4.3.2 系统发育树的建立

4.4 生理生化特征

4.5 极性脂分析

4.6 DNA G+C mol%含量和DNA杂交分析

4.6.1 总DNA的提取及质检

4.6.2 高效液相法测定DNA G+C mol%含量

4.6.3 DNA杂交分析

4.7 命名与总结

第五章总结与展望

5.1 总结

5.1.1 高盐环境中的多样性组成

5.1.2 一株嗜盐古菌的多相分类学研究

5.2 问题与展望

参考文献

论文发表及获奖情况

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 许瑶

导师: 柯丽霞,陈绍兴

关键词: 盐湖,晒盐场,盐矿,嗜盐古菌,物种多样性,克隆文库,多相分类学鉴定

来源: 安徽师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽师范大学

分类号: Q938;Q939

总页数: 124

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