骆叶[1]2007年在《小檗碱抑制肿瘤细胞Cyclin D1相关信号通路的研究》文中研究指明目前,肿瘤的发病率和死亡率在中国乃至世界仍居高不下,它不仅给患者本人及其家庭带来巨大的痛苦,同时也对整个社会的发展与进步造成极大的威胁。因此,寻求安全、有效、低毒的抗肿瘤药物一直受到国内外医药界专家学者的重视,而从天然化合物中开发此类药物也成为研究热点。所有癌细胞的一个特异性表型异常是细胞周期调控失调,细胞周期的调控与多种细胞内信号通路有关,阻断细胞内信号通路从而抑制细胞周期正调控相关蛋白表达是抑制肿瘤细胞异常增殖的关键。本研究在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制,为阐明小檗碱阻滞肿瘤细胞周期进展、抑制肿瘤细胞增殖的作用机理提供实验依据,并为小檗碱抗肿瘤的临床应用提供理论依据。第一部分:研究小檗碱对人高转移性肺癌PG细胞周期进展和Cyclin D1表达的影响。1.培养人高转移性肺癌PG细胞,采用MTT法检测小檗碱对PG细胞增殖的作用。与对照组相比,经不同浓度(10μg/ml, 20μg/ml, 40μg/ml)的小檗碱处理24小时和48小时,PG细胞生长明显受到抑制。2.流式细胞仪检测小檗碱对PG细胞周期进展的影响,结果表明,小檗碱可使G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期细胞减少,与对照组相比有显着差异(P <0.01);小檗碱高低剂量组间有明显差异(P <0.05)。3.RT-PCR结果显示,经不同浓度小檗碱处理后24小时,PG细胞Cyclin D1的mRNA水平较对照组明显降低。小檗碱对PG细胞Cyclin D1的表达有抑制作用。第二部分:研究小檗碱对PG细胞Cyclin D1相关信号通路的作用。在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制。1.双荧光素酶报告基因结果显示,小檗碱对PG细胞AP-1, Wnt信号通路活性有明显抑制作用,而对NF-κB信号通路影响不明显。进一步实验表明,经PDB+Ionomysin处理的PG细胞AP-1信号通路被激活,小檗碱能有效抑制这种激活,其作用呈剂量依赖性。2. Western Blot检测表明,经不同浓度小檗碱处理后,PG细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun蛋白含量明显降低,降低的水平与小檗碱浓度相关。3. EMSA结果显示,不同浓度的小檗碱均能抑制PG细胞核提取物与带有野生型AP-1位点的寡核苷酸结合;经小檗碱处理后PG细胞核提取物与Cyclin D1上游启动子区带有AP-1位点的寡核苷酸结合减少。实验结果提示:1.小檗碱通过抑制周期进展关键蛋白Cyclin D1,阻滞PG细胞周期进展,从而抑制PG细胞增殖。2.小檗碱对Cyclin D1相关信号通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用,对NF-κB通路活性影响不明显。小檗碱对异常激活的AP-1信号通路活性仍有显着的抑制作用。3.小檗碱能降低细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun含量,并抑制Cyclin D1基因启动子区与AP-1转录因子的结合,从而抑制Cyclin D1基因的转录水平,降低Cyclin D1的表达。这是小檗碱抑制Cyclin D1表达、进而阻滞肿瘤细胞周期的机制之一。
却天石[2]2016年在《ZEB2通过miR-637靶向Akt1及HMGA1促进胶质瘤细胞生长、侵袭及迁移的分子机制》文中研究说明研究背景与目的胶质瘤是中枢神经系统的第一大肿瘤,多年以来的治疗手段都是以扩大切除加合理的放化疗为主。虽然近年来治疗手段不断进步,但是疗效的改善仍旧十分有限。文献报道术后应用替莫唑胺联合放疗的方法,与单独放疗相比患者的中位生存期仅从12.1个月提高到14.6个月,两年生存率从10.4%提高到26.5%。而近几年出现的新型靶向治疗药物,如靶向血管内皮生长因子(VEGF)药物贝伐单抗、抗整合素抑制剂Cilengitide等,对患者的总体预后也无改善。胶质瘤的难治性很重要的一个原因是其恶性程度高,呈现出浸润性生长并与周围脑组织分界不清。肿瘤的高度恶性表现为胶质瘤生长快,浸润性生长主要是胶质瘤细胞具有高侵袭性,能向周边脑组织浸润,从导致手术不能完全切除进而复发。因此,研究胶质瘤的高增殖、高侵袭性是一个重要的方向。E盒结合锌指蛋白2 (Zinc finger E-box Binding homeobox 2,简称ZEB2,又名Smad-Interacting Protein 1,即SIP1)属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白家族的成员,包含两个可以与5'-CACCT序列结合的锌指结构簇。故而ZEB2可以通过与5'-CACCT序列结合,从而作为转录因子与下游靶基因的启动子作用,发挥转录抑制功能。许多研究表明ZEB2在肿瘤的发生发展过程中发挥了核心的作用,ZEB2不但可以通过调控Cyclin D1、Rb等基因从而加速肿瘤细胞的增殖,同时也能影响上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)相关蛋白进而增强肿瘤的侵袭和转移能力。但是,ZEB2在胶质瘤中的报道较少,并且在肿瘤中对于ZEB2所参与的信号通路和详细分子机制的研究也较少。2010年Xia等的研究发现,ZEB2在胶质瘤细胞中表达上调,抑制其表达后可以显着抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,上调的ZEB2可以抑制E-Cadherin表达以及促进Fibronectin和Vimentin的表达。而宋烨等在Xia的结果基础上,采用荧光定量PCR、Western blot和免疫组化的方法证明了ZEB2在胶质瘤组织中的表达较正常脑组织明显上调,且与胶质瘤的恶性程度呈正相关。随后,他们通过瞬时沉默ZEB2在胶质瘤细胞株U25 1、U87的表达而后进行了细胞功能实验。结果表明,干扰胶质瘤细胞中的ZEB2表达后,细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力显着下降,细胞周期G1期向S期转化障碍,以及早期凋亡及晚期凋亡的比例明显增多。进一步的Western blot结果也证实了上述结论。微小INA (microRNA,简称miRNA)是一类内源性非编码RNA,其生物学的主要作用是调控基因转录,而且以负性调控为主。近年来,许多研究发现微小分子非编码RNA(miRNAs)的表达改变与多种癌症的发生和发展密切相关,其中包括胶质瘤。许多miRNA通过靶向调控下游关键分子抑制其转录,从而对肿瘤的增殖、侵袭、迁移以及放化疗抵抗发挥抑制作用。越来越多地实验结果表明,miRNA作为癌症的候选标记物和治疗靶点具有潜在的价值。许多文献报道了ZEB2与部分miRNAs的作用密切相关。同时,ZEB2作为转录因子可以通过结合miRNAs上游启动子区域从而促进或抑制其转录。基于此,我们对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测。在检测到的80多个差异表达miRNAs中,我们采用荧光定量PCR对其中表达差异最明显且上调的miR-637进行了验证。结果显示,干扰ZEB2的表达后,miR-637的表达显着上调。同时,通过NCBI数据库获取miR-637上游启动子区域序列以及将ZEB2结合的启动子5'-CACCT区域与miR-637上游的启动子区域进行比对,我们推测ZEB2作为转录因子可能通过直接结合miR-637的启动子区域进而抑制其转录表达。本文的主要内容是着重探讨了ZEB2在胶质瘤中是否能够通过靶向调控miR-637进而介导了细胞的增殖、侵袭和迁移,而miR-637又是如何进一步对胶质瘤细胞的功能进行调节,以及调控的具体分子机制。这为我们理解胶质瘤的快速增殖和高度侵袭提供了一定的理论基础,也为寻找胶质瘤潜在的治疗靶基因提供了一定的帮助。研究内容与方法1.ZEB2在胶质瘤细胞中功能和机制的进一步研究(1)设计并构建4个稳定干扰ZEB2慢病毒载体并进行细胞转染,运用荧光定量PCR和Western blot检测转染效率,选取干扰效率最高的片段进行后续实验；(2)运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响,运用平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力；(3)运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测稳定干扰ZEB2可以抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(4)采用裸鼠皮下成瘤实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞的增殖；(5) Western Blot检测干扰ZEB2后细胞中增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移(1)采用miRNAs芯片检测干扰ZEB2表达的U251细胞中表达变化的miRNA,并用荧光定量PCR验证和寻找最有意义的miRNA进行后续研究；生物信息学分析ZEB2可以结合miR-637的启动子区域序列：(2)双荧光素酶报告基因检测ZEB2与miR-637启动子的结合并能抑制其转录；凝胶电泳迁移率实验检测体外条件下ZEB2是否能直接结合miR-637启动子区域；利用染色质免疫共沉淀技术在体内条件下进一步验证ZEB2与miR-637启动子区域的结合；(3)设计并构建miR-637稳定过表达慢病毒载体并用荧光定量PCR进行验证；(4)MTT实验、Edu实验、平板克隆实验和裸鼠皮下成瘤检测miR-637对胶质瘤细胞的增殖能力影响；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637对胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力的影响；(5)MTT实验、Edu实验验证ZEB2通过直接调控miR-637进而促进胶质瘤细胞的增殖；划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证ZEB2通过直接调控miR-637进而促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移；3.MiR-637直接靶向调节Akt1及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能(1)生物信息学预测Akt1和HMGA1可能为miR-637的直接靶基因,并采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达miR-637可以下调Akt1和HMGA1的表达；(2)双荧光素酶报告基因验证miR-637可以靶向结合Akt1和HMGA1的3’-UTR区域进而抑制它们的表达；(3)Edu实验检测miR-637通过靶向Akt1进而抑制胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637通过靶向Akt1进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(4)Edu实验检测HMGA1促进胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证HMGA1促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移；(5)Edu实验检测miR-637通过靶向HMGA1进而抑制胶质瘤细胞的增殖；Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637通过靶向HMGA1进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移；4.MiR-637靶向Akt1和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制(1) Western blot检测过表达miR-637后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(2) Western blot检测瞬时干扰Akt1后以及在过表达miR-637细胞中过表达Akt1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(3) Western blot检测干扰HMGA1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；(4) Western blot检测在过表达miR-637细胞中过表达HMGA1后增殖相关蛋白、EMT相关蛋白和PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等通路的表达变化；5. ZEB2-miR-637-Aktl/HMGAl信号通路在临床组织标本中的表达和分析(1)荧光定量PCR检测45例胶质瘤样本和15例正常脑组织中ZEB2、miR-637、Aktl和HMGA1的mRNA表达水平；(2) Western blot检测7例胶质瘤组织和7例相对应的瘤旁正常脑组织中ZEB2、和HMGA1的蛋白表达水平；(3)免疫组化检钡ZEB2、Aktl和HMGA1在70例胶质瘤临床石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的蛋白表达水平和表达定位：并分析表达高低与临床病理资料之间的关系；(4)原位杂交检测miR-637在70例胶质瘤临床石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的表达水平和表达定位；并分析表达高低与临床病理资料之间的关系；(5)统计分析在胶质瘤临床样本中ZEB2与miR-637、miR-637与Akt1以及miR-637与HMGA1之间的表达相关性。结果1.ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移对4个ZEB2的干扰慢病毒载体进行筛选,结果显示U251中shZEB2的A片段干扰效率最高(19.4%),U87中C片段干扰效率最高(25.0%),故后续实验U251细胞采用A片段、U87采用C片段进行。随后运用噻唑蓝比色(MTT)实验、Edu实验和裸鼠皮下成瘤实验检测ZEB2对胶质瘤细胞增殖功能的影响,平板克隆实验验证ZEB2促进胶质瘤细胞克隆形成的能力。MTT实验结果显示,与对照Mock组相比,shZEB2细胞组的存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；Edu实验显示干扰ZEB2表达后处于S期的细胞百分比显着降低(P均为0.001)；裸鼠皮下成瘤实验结果表明干扰U87细胞中ZEB2的表达后肿瘤体积和重量较对照组明显减小(P<0.001)；平板克隆实验结果表明干扰ZEB2表达后形成克隆数目明显减少(P均为0.001)。即ZEB2在胶质瘤中促进细胞的增殖和克隆形成能力。进一步运用划痕实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验检测ZEB2对胶质瘤细胞的侵袭和迁移的作用。划痕实验结果表明,shZEB2细胞组的划痕间隙随时间延长而减小(P<0.001)：Transwell和Boyden实验结果显示,与对照组相比,U251和U87干扰组的穿膜细胞数显着减少(P=0.001和0.003,P=0.002和0.001)。即ZEB2可以促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。采用Western blot检测了下调胶质瘤细胞U251和U87中的ZEB2蛋白表达后,与细胞增殖、侵袭和迁移相关蛋白的变化情况。结果显示,干扰U251和U87中ZEB2的表达后,PI3K/Akt通路中的p-PI3K、Akt、p-Akt发生下调,与增殖相关的CCND1下调而p21上调,与侵袭和迁移相关的Vimenti、p-catenin、N-Cadherin下调。而其它蛋白女HMGA1、E2F1、PTEN、Bcl-2、NF-kappaB、Sox2等均有不同程度的上调和下调。2.ZEB2通过抑制miR-637转录进而促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移对干扰ZEB2表达的U251细胞进行了CombiMatrix人类miRNAs芯片检测一共发现到了80多个差异表达miRNAs,其中上调的niRNAs有40多个,下调基因miRNAs有30多个。在差异表达miRNAs中,选取其中表达差异最明显且上调的miR-637并采用荧光定量PCR验证。结果显示,干扰ZEB2的表达后,miR-637的表达显着上调(P=0.02和P=0.005)。随后的双荧光素酶报告基因结果表明,干扰ZEB2可以减少其与miR-637启动子的结合(P=0.002),上调ZEB2可以加强其与miR-637启动子的结合(P=0.004)。凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)结果显示过表达ZEB2促进其与miR-637启动子的结合。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)结果表明ZEB2作为转录因子可以直接结合miR-637启动子区域的0-300bp位点。构建稳定过表达miR-637慢病毒载体并转染细胞,荧光定量PCR验证表明miR-637在细胞中被稳定过表达超过400倍和350倍(P均小于0.001)。随后进行细胞功能实验。MTT结果显示较对照组相比,过表达miR-637的细胞存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；Edu实验结果表明过表达miR-637后U251和U87细胞较对照组的S期细胞明显减少(P<0.05)；平板克隆形成实验表明在胶质瘤细胞U251和U87中上调miR-637的表达可以显着抑制细胞克隆形成的能力(P<0.05)；皮下成瘤实验表明过表达组肿瘤的体积和重量较对照组明显较小(1.36±0.32g vs.2.06+0.45g,P<0.05),且Ki-67表达阳性率明显较对照组高(P=0.002); Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验结果均表明,过表达miR-637后抑制U251和U87的穿膜,而在过表达miR-637的细胞中加入miR-637抑制剂后穿膜细胞数显着回升(P均小于0.05)。以上结果说明miR-637在胶质瘤中促进细胞的增殖、侵袭和迁移。进一步在稳定过表达ZEB2 (ZEB2 OE)的细胞中瞬时转染miR-637 mimics后采用MTT、Edu、Transwell、Boyden和划痕实验来检测细胞功能的变化。MTT的实验结果显示与对照ZEB2 OE组相比,ZEB2 OE+miR-637 OE细胞组的存活能力随时间推移而减弱(P<0.001)；而Edu实验表明在ZEB2过表达的细胞中上调miR-637后,U251和U87处于S期细胞明显减少(P<0.05)；Transwell小室体外迁移实验和Boyden小室体外侵袭实验的结果说明在过表达ZEB2的U251和U87中过表达miR-637后,U251和U87的穿膜细胞数明显减少(P均小于0.05)。即说明miR-637对ZEB2促细胞增殖、侵袭和迁移的能力有拮抗作用3.MiR-637直接靶向调节Aktl及HMGA1进而影响胶质瘤细胞的功能在3个miRNA靶基因预测网站上对miR-637可能的靶基因进行了预测,同时结合miR-637的Western blot结果,选取了Akt1和HMGA1这两个可能的靶基因。荧光定量PCR和Western blot结果表明,在胶质瘤细胞U251和U87中过表达miR-637促进Akt 1和HMGA1的表达下调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,在存在靶基因3’-UTR区域的组中加入miR-637 mimics可以抑制载体荧光的表达,而加入inhibitors促进荧光强度上升。同时,突变靶基因的3’-UTR区域使得荧光强度不发生改变。即miR-637可以特异性结合靶基因Akt1和HMGA1的3’-UTR区域,通过抑制mRNA的表达从而对它们负性调控。随后采用Edu实验、Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验验证miR-637可以通过影响Akt1进而调控胶质瘤细胞的功能。Edu实验表明过表达miR-637和瞬时干扰Akt1所产生的作用相同,均使得S期细胞较少；而在过表达miR-637的细胞中加入过表达Akt1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的S期细胞减少(P<0.05)。而Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验显示,过表达miR-637和瞬时干扰Aktl所产生的作用相同,均使得穿膜细胞数减少；而在过表达miR-637的细胞中加入过表达Akt1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的穿膜细胞数减少。以上结果表明,miR-637可以通过结合Akt1的3’-UTR区域抑制其表达,进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。采用细胞功能实验对HMGA1在胶质瘤中的功能进行了鉴定。Edu实验表明,干扰细胞HMGA1的表达后S期细胞数百分比显着降低(P< 0.001); Transwell小室迁移实验和Boyden小室侵袭实验表明,沉默U251细胞的HMGA1表达可以使穿膜细胞数显着降低(P=0.004和0.007,P=0.004和P=0.011)。之后细胞功能实验验证miR-637可以通过影响HMGA1进而调控胶质瘤细胞的功能。Edu实验、均表明,在过表达miR-637的U251中加入过表达HMGA1质粒,可以逆转过表达miR-637引起的S期细胞减少,4.MiR-637靶向Aktl和HMGA1进而调节胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制首先对过表达miR-637的细胞采用Western blot检测下游增殖相关蛋白、EMT相关蛋白等指标。结果表明,对miR-637进行过表达后细胞中PI3K/Akt信号通路的关键蛋白Akt1、磷酸化Akt (p-Akt)和磷酸化PI3K (p-PI3K)显着下调,Wnt通路的关键蛋白P-catenin也显着下调。同时,Foxol上调,而磷酸化Foxol (p-Foxol)下调。而且,与EMT相关的N-Cadherin无变化,及细胞周期相关的Cyclin D1、Cyclin E1、p15下调,而p27/Kip、p21上调。此外,hTERT上调,NF-kappaB下调。随后在稳定过表达miR-637的U251和U87细胞中加入过表达Akt1的质粒载体以及相应的对照空白质粒,与NC细胞、Lv-miR-637细胞、瞬时干扰Akt1细胞(siAkt1)共同进行Western blot检测。结果发现,瞬时干扰Akt1的表达,使得p-Akt1、β-catenin、p-Foxol和Cyclin D1的表达显着下调,而Foxol的表达上调。并且,在稳定过表达miR-637的细胞中过表达Akt1,可以使p-Akt1、 β-catenin、p-Foxol和Cyclin D1的表达明显回复,Foxol的表达明显下降。其次,运用Western blot对瞬时干扰HMGA1的细胞进行了EMT、细胞周期相关蛋白及信号通路的检测。干扰HMGA1的表达后,HMGA1蛋白水平下降明显,Akt和p-Akt以及p-P13K蛋白有下调。同时,间充质标志物N-Cadherin、β-catenin、 Vimentin显着下调。而细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1下调,但p15、p16、 CDK6上调。此外,c-Myc和NF-kappaB基因也显着下调。随后在稳定过表达miR-637的细胞中加入过表达HMGA1的质粒载体,与LEV细胞、Lv-miR-637细胞共同进行Western blot检测。结果可知,在过表达miR-637的细胞中回复HMGA1的表达可以使得Cyclin D1、β-catenin、NF-kappaB和Vimentin的表达回升,而p15表达水平则下降。5. ZEB2-miR-637-Aktl/HMGAl信号通路在临床组织标本中的表达和分析荧光定量PCR检测45例新鲜胶质瘤组织标本和15例正常脑组织中ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1的mRNA表达水平。结果显示,与正常脑组织相比,胶质瘤组织样本中ZEB2、Akt1、HMGA1的mRNA表达水平均上调(P<0.001)而miR-637表达水平显着下调(P<0.001)。而Western blot检测了7例胶质瘤组织和与其相对应的7例肿瘤旁正常脑组织中ZEB2和HMGA1的蛋白表达,结果显示,较对应的瘤旁正常脑组织相比,胶质瘤组织中ZEB2和HMGA1的蛋白水平均明显较高。随后,运用免疫组化和原位杂交检测ZEB2、iR-637、Akt1和HMGA1在70例胶质瘤石蜡切片和20例正常脑组织石蜡切片中的表达定位和表达水平。结果显示,在正常脑组织中,ZEB2的表达主要位于细胞核,少部分见于胞浆；Akt1在细胞核和细胞浆均有表达；HMGA1主要位于细胞核中,细胞浆有表达但相对较少。同时,叁者在胶质瘤组织中均为细胞核和细胞浆同时表达,且表达量明显较正常脑组织高。而miR-637在正常脑组织中主要表达于细胞浆中,核内罕见,在胶质瘤组织中表达于细胞浆和细胞核,且胶质瘤组织中miR-637的表达显着下调。此外,统计分析发现性别、年龄(≤≥50和<50)、组织类型与ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1的表达均无明显关系,而与WHO分级存在显着相关性(ZEB2、Akt1、HMGA1为正相关,miR-637为负相关)。最后对ZEB2、miR-637、Akt1和HMGA1之间表达相关性进行了分析。结果表明,ZEB2和miR-637之间存在负相关关系(r=-0.358,P=0.002), miR-637与Aktl之间存在负相关关系(r=-0.345, P=0.003), miR-637与HMGA1之间存在负相关关系(r=-0.399,P=0.001)。结论ZEB2作为转录因子可以与miR-637上游启动子区域的位点结合并抑制其转录,进而减少miR-637与Akt1和HMGA1的3’-UTR区域靶向结合,从而分别通过上调CyclinD1和p-Foxo1并下调Foxo1.以及上调Cyclin D1并抑制p15来促进细胞周期的进展。同时,又分别通过上调p-Akt1、β-catenin以及上调β-catenin、 NF-kappaB和Vimentin的表达来促进细胞的侵袭和迁移。最后,ZEB2、Akt1和HMGA1在胶质瘤临床样本中高表达,且与WHO分级呈正相关；而miR-637在胶质瘤临床样本中低表达且与WHO分级呈负相关。同时,ZEB2与miR-637的表达以及miR-637与Akt1、HMGA1的表达相互之间均呈负相关。
陈楚杰[3]2017年在《细胞周期相关蛋白在人结肠癌组织中的表达及其临床意义的探讨》文中进行了进一步梳理目的:检测结肠癌患者组织中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白E(cyclin E)以及NIK-IKK结合蛋白(NIBP)的表达,探讨其与临床、病理特征之间的关系,并分析叁者在结肠癌组织中表达的相关性。为结肠癌的早期诊断和预后提供一个可靠的分子生物学指标。方法:收集从2015年2月到2015年12月之间广西医科大学第一附属医院结直肠外科经外科手术切除及消化内科肠镜活检的部分标本130例,正常结肠黏膜、结肠癌各65例,所有的患者均未接受放化疗。采用免疫组织化学SP法分别检测并分析NIBP、cyclin E和cyclinD1的表达和相关性,并分析上述蛋白的表达与结肠癌患者肿瘤的浸润深度、TNM临床分期、淋巴结转移和远处转移相关性。结果:(1)NIBP在结肠癌组织中高表达阳性率为60.00%(39/65),明显高于正常结肠粘膜组织中的阳性表达率[18.46%(12/65),P<0.05],差异具有统计学意义;Cyclin E在结肠癌组织中高表达阳性率为56.92%(37/65),显着高于正常结肠粘膜组织中的阳性表达率[3.08%(2/65),P<0.05],差异具有统计学意义;CyclinD1在结肠癌组织中高表达阳性率为89.23%(58/65),显着高于正常结肠粘膜组织中的阳性表达率[43.08%(28/65),P<0.05],差异具有统计学意义。(2)结肠癌组织中CyclinE、NIBP和Cyclin D1的表达与肿瘤浸润深度、TNM临床分期、淋巴结转移和远处转移明显相关(p<0.05)。(3)结肠癌组织中NIBP和Cyclin D1表达之间呈正相(r=0.32,P<0.05),NIBP和CyclinE表达之间呈正相关(r=0.43,P<0.05),CyclinD1和CyclinE表达之间呈正相关(r=0.23,P<0.05)。结论:(1)NIBP、Cyclin E、Cyclin D1在结肠癌中高表达,叁者可能参与了结肠癌的发生发展;(2)叁者在结肠癌中的高表达都可促进肿瘤细胞的浸润与转移,其表达越高,浸润深度越深,淋巴结及远处转移可能性越大。(3)NIBP可能促进CyclinE和Cyclin D1的高表达而导致细胞周期调控异常,叁者可能共同参与了结肠癌的发生发展。
鄢博[4]2016年在《mTORC1通路调节PTHrP来调控软骨生长、增殖、分化》文中进行了进一步梳理一、研究背景与目的软骨是人和脊椎动物特有的胚胎性骨骼,一种无血管组织。可分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨,为一种略带弹性的坚韧组织。软骨是由软骨细胞、纤维和软骨基质构成。在胎儿和年幼期,软骨组织分布较广,后来逐渐被骨组织代替。成年人软骨存在于骨的关节面、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处。同时软骨的发生是胚胎发育的重要环节,软骨的正常发育最终生成了所有的长骨,它的正常发育不仅对形成正常形态和长度的骨骼极为重要,其发育对附着于其上的神经肌肉的正常发育也是至关重要。由于动物体内的长骨都是通过软骨内成骨过程而产生的,所以软骨内成骨的过程显得十分重要。长骨的发生会经过一系列的过程。首先是间充质细胞聚集然后分化出骨原细胞,后者分化出软骨细胞,软骨细胞不停的向四周分泌以Ⅱ型胶原为主的软骨基质,软骨细胞继而被包埋在软骨基质中,形成软骨组织即软骨雏形。软骨雏形中段外围首先出现骨质的形成,首先是软骨膜深层形成血管,其周边的骨原细胞分化成为成骨细胞,成骨细胞就开始生成并沉淀类骨质,自身因为被类骨质包埋而成为成骨细胞。软骨雏形中段外围首先出现骨质沉淀,形成骨领即最初的长骨皮质,软骨雏形中段随后出现血管的侵入,成骨细胞的分化以及破骨细胞的侵入,使得初级骨化中心得以形成；类似的是长骨两端也继而出现同样的生理过程,次级骨化中心最终得以出现。初级骨化中心和次级骨化中心之间的就是生长板。生长板中软骨细胞呈规律的柱状排列,分为静息期软骨细胞、增殖期软骨细胞、肥大期软骨细胞。肥大软骨细胞最终分化为终末肥大软骨细胞,其分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)分解软骨基质,血管生长因子(VEGF)诱导血管的长入,带来成骨细胞和破骨细胞,最终在共同作用下生成新生骨质。而后天的长骨长度,很大程度上就取决于生长板中软骨细胞的规律增殖分化。调节生长板软骨细胞规律增殖分化的最重要通路是印猬蛋白-甲状旁腺激素相关肽(IHH-PTHrP)信号轴。生长板软骨细胞中,前肥大期软骨细胞分泌IHH,其直接作用于前肥大细胞周边的软骨膜,促使其中的软骨膜细胞向成骨细胞分化。同时,其作用于增殖期软骨细胞,直接促进其增殖,使得软骨柱延长。再者,IHH可以刺激静息期软骨细胞分泌PTHrP, PTHrP作用于增殖期软骨细胞及前肥大软骨细胞,抑制其向肥大软骨细胞分化,保持增殖状态。因而在生长板中IHH-PTHrP分子的共同作用下,软骨细胞得以有规律的增殖、分化。mTOR是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mechanistic target of rapamycin, mTOR)是整合细胞内外各种信号调节细胞生长与代谢的中心信号分子。其mTOR复合物1(mTORCl)通路的活性也是调节细胞生长、代谢、增殖、凋亡的重要因素。软骨组织作为区别于其他组织的独立组织,其发生、发育过程是在一个在低氧的状态下间充质细胞向软骨细胞分化、增殖、分化的生理过程。生长板的软骨细胞处在一个低营养,低血氧浓度的状态,它们是如何在这样的情况下分泌胶原、增殖分化,完成相关的生理功能的尚有待研究。近年来,针对软骨细胞增殖、分化的调控机制研究发现：软骨增殖分化过程与Wnt, mTOR等多条细胞分子信号通路相关。近年来已有若干研究将焦点聚集在mTOR信号通路调控软骨细胞增殖分化的机制上,并发现mTOR特异性抑制剂,能抑制软骨细胞的增殖与分化。亦有研究证实雷帕霉素能够抑制接受治疗的幼儿长骨的生长发育。有报道称mTOR通路活性在软骨发育中出现了改变。但是目前多项研究尚不深入,mTOR扮演着何种调控角色尚不明确,mTOR调控软骨生长发育的时间点及其效应如何尚未见报道。而mTOR通路是如何影响软骨细胞的规律增殖分化进而影响了长骨的生长尚有待研究。二、目的本课题主要研究了以下内容：1、软骨细胞增殖分化过程中mTORC1通路活性的变化。2、雷帕霉素对软骨细胞增殖分化的影响。3、软骨细胞mTORC1通路过度活化对于小鼠软骨内成骨的影响。4、mTORC1通路如何调控PTHrP来控制软骨细胞增殖分化。叁、材料方法1、体内软骨细胞增殖分化时mTORC1通路活性的变化情况。利用免疫荧光观察mTORC1通路活性指标蛋白磷酸化核糖体S6蛋白(pS6)在小鼠E14.5天肱骨,以及P7、P18天胫骨中的表达情况。利用Western blots来分析培养的原代软骨细胞在诱导分化的过程中pS6蛋白的变化情况。利用免疫荧光观察mTORC1上游抑制蛋白TSC1来研究mTORC1通路活性变化情况。2、雷帕霉素对软骨细胞增殖分化的影响。绘制不同浓度雷帕霉素处理过后的软骨细胞的增殖曲线。雷帕霉素处理过后原代软骨细胞,通过qPCR来分析软骨分化相关指标Co110al、MMP13、IHH mRNA的变化情况。给予孕鼠腹腔注射雷帕霉素叁天后,取材观察P0天小鼠的胫骨发育情况,分析切片的苏木素-伊红染色(HE染色)、pS6的免疫荧光、MMP13的原位杂交,来分析雷帕霉素是如何对软骨细胞分化造成影响。具体分析HE切片上显示的增殖区,肥大区长度来判断雷帕霉素是如何影响到增殖和肥大进程的。3、软骨细胞过度激活的mTORC1通路的软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠的软骨细胞增殖、分化情况。利用Cre-Loxp系统,我们构建出软骨细胞特异性敲除TSC1基因的小鼠(TSC1CKO)。通过western blots分析TSC1CKO小鼠软骨细胞mTORC1通路激活情况。通过免疫荧光分析P0天TSC1CKO小鼠和对照小鼠肱骨的pS6变化情况。测量TSC1CKO小鼠和TSC1flox/flox小鼠的身长的差异以及肱骨、股骨、胫骨的差异。分析P0、2W、4W、8W、12W小鼠胫骨切片HE染色的组织学差异。4、过度激活的mTORC1通路的TSC1CKO小鼠软骨细胞增殖情况。TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠肋骨切片的HE染色。给予P0天TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠注射BrdU,2h后取材并切片行BrdU免疫荧光,观察TSC1基因敲除对于小鼠软骨增殖的影响。取TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的胫骨及肋软骨,研磨后提取蛋白,行western blots分析增殖相关的细胞周期蛋白B1(CyclinB1)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、核增殖抗原PCNA的变化。利用免疫组织化学来分析Cyclin B1在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨的表达情况。使用CCK8细胞增殖检测试剂盒来检测TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨原代细胞的增殖情况。5、TSC1CKO小鼠表现出肥大分化减慢,终末肥大分化受到抑制。利用原位杂交显示Col10al的mRNA在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板上的表达情况。HE切片分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的肥大分化情况。利用BrdU Chase实验追踪增殖期软骨细胞肥大分化情况。利用western blots分析4周龄TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的肥大分化相关蛋白Runx2、sterix、Col2al、Col10al,细胞周期相关蛋白p21KIP1、p27KIP1、 p57KIP2,以及终末肥大分化相关蛋白MMP13、OPN的表达。取E18.5的小鼠胫骨,行冰冻切片Von Kossa染色,观察TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的终末肥大软骨细胞的数量及成骨情况。6、雷帕霉素可以逆转TSC1CKO小鼠的表型。于出生后第3周开始给予TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠灌服雷帕霉素,绘制其生存曲线,观察雷帕霉素对TSC1CKO、鼠死亡率的影响。取12周龄TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠,行茜素红-阿尔新蓝染色,观察小鼠的骨骼发育情况及骨化情况。对4周龄的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠给予2周雷帕霉素处理后,切片行HE染色观察其胫骨生长板增殖区及肥大区的变化。取TSC1CKO小鼠,TSC1flox/flox小鼠及雷帕霉素处理过后的TSC1CKO小鼠胫骨生长板组织,利用Western blots分析雷帕霉素对细胞周期蛋白以及增殖蛋白例如PCNA、Cyclin D1,肥大分化相关蛋白及终末分化相关蛋白例如Col2al、Coll0al、Runx2、Osterix、MMP13、OPN的影响。7、TSC1CKO小鼠出现相关表型的机制研究。利用qPCR分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的IHH, PTHrP、Gli1、Patched1的mRNA表达水平。利用western blots分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的生长板组织,研究IHH-PTHrP轴中相关蛋白的变化情况。利用免疫组织化学分析PTHrP在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的表达情况。利用免疫组织化学分析接受了雷帕霉素一周后,PTHrP在P14天的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的表达情况。给予雷帕霉素处理过后,利用western blots检测TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板组织的PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表达情况。转染Gli2质粒或者Gli2突变体S234E或者siRNA后观察PTHrP的变化情况,以及经过雷帕霉素处理过后的情况。给予IGF-1模拟生理性mTORC1激活后,观察雷帕霉素处理对软骨细胞Patchedl、Gli1、PTHrP的影响。转染核糖体S6激酶1(S6K1)过表达质粒,利用荧光素酶实验(luciferase assay)观察S6K1对PTHrP及Patchedl表达的影响。给予培养的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox软骨细胞Patchedl抑制剂GDC-0449及Gli1/2抑制剂GANT-61,观察其对细胞增殖的影响。给予培养的TSC1CKO小鼠软骨细胞GDC-0449及雷帕霉素,提取蛋白,检测Gli1、PTHrP、 Patchedl蛋白的变化。利用染色质免疫共沉淀(CHIP)实验,检测Gli2与PTHrP的相互作用在TSC1CKO小鼠软骨细胞的变化情况。8、mTORC1通路下游蛋白S6K1与Gli2相互作用的研究。利用免疫共沉淀方法,检测S6K1和Gli2、Gli1的相互作用。利用免疫共沉淀办法,检测TSC1CKO及TSC1flox/flox小鼠中磷酸化Gli2即p-Gli2的情况,以及雷帕霉素对其的影响。提取TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨细胞以及经过雷帕霉素处理的软骨细胞的细胞核、细胞质组分,Western Blots检测Gli1、 Gli2、SuFu蛋白的核浆分布情况。转染S6K1过表达质粒至小鼠成软骨细胞即ATDC5细胞给予雷帕霉素处理后,提取其细胞核、细胞质组分,Western Blots检测Gli1、Gli2、SuFu蛋白的核浆分布情况。给予ATDC5细胞胰岛素样生长因子1(IGF-1因子)处理,模拟体内生理刺激后,给予雷帕霉素处理,提取其细胞核、细胞质组分,Western Blots检测Gli1、Gli2、SuFu蛋白的核浆分布情况。利用免疫共沉淀,检测TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨细胞内SuFu与Gli1、Gli2的相互作用情况。将Gli2质粒、Gli2突变体激活型S234E质粒以及Gli2突变体抑制型S234A质粒转染ATDC5细胞,利用免疫共沉淀,检测以上处理对Gli2与SuFu相互作用的影响。将Gli2质粒、Gli2突变体激活型S234E质粒以及Gli2突变体抑制型S234A质粒转染ATDC5细胞,提取蛋白,使用Western blots检测PTHrP、Gli1、Gli2蛋白表达情况。将S6K1过表达质粒转染ATDC5细胞,提取蛋白,Western blots检测PTHrP、Gli1、Gli2蛋白表达情况。将培养的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨细胞给予雷帕霉素处理,行免疫荧光,观察PTHrP在其中的表达情况以及Gli2在其中的核浆分布情况。四、结果1、软骨分化过程中mTORCl通路活性发生变化。通过E14.5天的小鼠肱骨切片免疫荧光染色,我们发现mTORC1通路活性标志pS6蛋白在增殖区(PZ)及前肥大区(PHZ)表达最高,而在肥大区(HZ)基本缺失。同样的现象,在出生后的小鼠即P7天、P18天的小鼠胫骨切片上得到证实。普通软骨培养基以及ITS软骨诱导培养基的原代软骨细胞,ITS诱导培养基能够诱导原代软骨向肥大软骨细胞分化,随着分化的进行,其表达的TSC1逐渐增多,而pS6表达逐渐减少。体内外实验证明随着软骨分化的进行,增殖区及前肥大区软骨细胞有高的mTORC1活性,而肥大区软骨细胞mTORC1活性较低。qPCR也证实了ITS培养基的原代软骨细胞肥大分化增多,出现终末肥大分化的标志蛋白MMP13。同时,免疫荧光染色也显示了mTORC1活性的变化是由于分化过程中TSC1蛋白的变化所导致的。2、抑制mTORC1活性可以促进软骨细胞终末分化10nnM浓度的雷帕霉素可以抑制软骨细胞增殖。qPCR显示雷帕霉素处理可以促进软骨细胞退出增殖周期,进入肥大分化及终末分化,表现为分化相关的IHH, Co110al的mRNA表达增高以及终末分化指标的MMPl3的mRNA表达增高。HE切片分析显示,给予雷帕霉素后,增殖区缩短。原位杂交显示给予雷帕霉素后,小鼠胫骨生长板的MMP13表达增多。Western blots也证实雷帕霉素处理后MMP13表达增多。3、软骨细胞内过度激活的mTORC1通路会导致小鼠软骨发育不良。构建出的TSC1CKO小鼠表现出软骨细胞内TSC1表达缺失,pS6表达显着增高。免疫荧光显示,TSC1flox/flox小鼠肱骨高表达的pS6蛋白局限于增殖区PZ、前肥大区PHZ,肥大区HZ pS6蛋白缺失,静息区RZ有较低的pS6活性；TSC1CKO小鼠肱骨的pS6蛋白在静息区RZ、增殖区PZ、前肥大区PHZ、肥大区HZ都有高表达。结果显示TSC1CKO小鼠的所有时期的软骨细胞都有强的mTORC1活性。大体照片显示TSC1CKO小鼠的体长以及肱骨、胫骨、股骨长度均小于TSC1flox/flox小鼠。HE切片分析显示,出生P0天TSC1CKO小鼠的胫骨肥大区软骨高度明显短与同窝对照。出生2W后TSC1CKO小鼠肥大区高度和同窝对照基本一致,4W、8W、12W的TSC1CKO、鼠,其胫骨肥大区高度都明显多于同窝对照小鼠。4、过度激活的mTORCl通路使TSC1CKO小鼠软骨细胞增殖增加。HE切片分析显示,TSC1CKO小鼠的肋软骨细胞中有更多的处在分裂相的软骨细胞。BrdU免疫荧光显示,TSC1CKO小鼠的胫骨静息区、增殖区软骨细胞中的BrdU阳性细胞都明显多于TSC1flox/flox小鼠,同时在TSC1CKO小鼠的肥大期软骨中,也发现有BrdU阳性细胞。结果说明TSC1CKO小鼠的软骨细胞增殖增加,甚至在本应退出细胞周期的肥大软骨细胞中也发现了增殖现象。Western blots显示TSC1CKO软骨细胞的PCNA、Cyclin D1、Cyclin B1表达增高。免疫组织化学显示,Cyclin B1表达水平增高,在肥大期软骨内也发现有Cyclin B1高表达。软骨细胞的增殖曲线显示,TSC1CKO的软骨细胞增殖增加。5、过度激活的mTORC1通路抑制软骨细胞的成熟分化。原位杂交显示4周龄的TSC1CKO小鼠的Col10al的表达区域高度明显高于同窝对照。Western blots结果显示TSC1CKO小鼠的肥大分化相关基因Runx2、 Col10al、Osterix、p21KIP1、p27KIP1、p57KIP2均表达降低,而终末分化相关基因OPN、MMP13表达亦是降低。BrdU chase assay显示,TSC1CKO小鼠的增殖期软骨细胞向肥大分化速度变慢。免疫组化显示TSC1CKO小鼠胫骨生长板的p57KIP2表达水平较同窝对照低。冰冻切片的Von Kossa显示TSC1CKO小鼠的终末肥大软骨细胞减少。6、雷帕霉素可以抑制TSC1敲除小鼠的软骨发育不良表型的发生。给予雷帕霉素灌胃后,TSC1CKO小鼠的死亡率减少。骨架染色显示TSC1CKO小鼠的体型较小,肋软骨不能骨化,给予雷帕霉素灌胃的TSC1CKO小鼠肋软骨开始骨化。HE切片分析显示,TSC1CKO小鼠的肥大期软骨区高度较大,给予雷帕霉素后,TSC1CKO小鼠的肥大期软骨区变窄。Western blots显示,TSC1CKO小鼠细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、PCNA增加,而分化相关的蛋白Col10al、Runx2、MMP13、OPN表达均降低。7、mTORC1通路的活性是PTHrP的分泌过程所需要的。qPCR显示,TSC1CKO小鼠软骨组织IHH mRNA表达同对照组没有差异,而PTHrP、Gli1、Patched1表达均较对照组明显升高。Western blots显示Gli1、 PTHrP、Patchedl表达量增高明显,而且雷帕霉素可以降低这些蛋白的表达。免疫组化显示,TSC1CKO小鼠软骨组织中PTHrP表达明显升高,且给予雷帕霉素后,PTHrP表达降低。20nnM浓度的雷帕霉素能够抑制TSC1CKO小鼠软骨细胞的增殖。转染Gli2、S234E质粒以及给予雷帕霉素处理后,Western blots显示Gli2及其激活型突变S234E可以增强PTHrP蛋白表达水平。给予IGF-1因子模拟生理性刺激显示PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表达水平均明显增加。Luciferase assay显示过表达S6K1可以增加PTHrP及Patchedl的表达,而给予雷帕霉素可以抑制S6K1的效应；过表达S6K1+Gli2可以增加PTHrP表达,而同时转染Gli2siRNA可以抵消这种效应。给予TSC1flox/flox小鼠软骨细胞GDC-0449以及GANT-61,两者均可抑制其增殖；而在TSC1CKO小鼠软骨细胞上,GDC-0449不能抑制其增殖。Western blots显示相比GDC-0449,雷帕霉素仍可抑制Gli1、 PTHrP.Patchedl的表达.CHIP实验证明,Gli2和PTHrP启动子的结合,TSC1CKO小鼠软骨细胞中增强,而雷帕霉素可以抑制这种效应。8、mTORC1/S6K1通路通过影响Gli2来调控PTHrP分泌。免疫共沉淀显示,S6K1同Gli1及Gli2有相互作用,而这种作用在TSC1CKO小鼠软骨细胞中增强,同时雷帕霉素可以抑制S6K1同Gli1及Gli2的结合。另一项免疫共沉淀显示,磷酸化的Gli2在TSC1CKO小鼠软骨细胞中增多,而雷帕霉素可以抑制Gli2的磷酸化。Western blots显示Gli1、Gli2在TSC1CKO小鼠软骨细胞中,更多比例的分布在细胞核,表明TSC1CKO小鼠的Gli1、Gli2入核增多,而雷帕霉素亦可以阻止其入核；转染S6K1的ATDC5细胞以及给予IGF-1因子刺激的相关实验也证实此现象。同时我们看到,免疫共沉淀显示SuFu与Gli1、Gli2的结合在TSC1CKO上减少,表明TSC1敲除影响了SuFu和Gli1、 Gli2的结合。转染Gli2、S234A、S234E的相关实验证明,磷酸化位点的有无对于SuFu和Gli2的结合有影响。转染Gli2、S234A、S234E质粒的实验显示,激活型S234E能够增强PTHrP及Gli1表达,而S234A可以一定程度上抑制PTHrP及Gii1表达。转染S6K1过表达质粒的实验证明PTHrP、Gli1的表达均上升。免疫荧光也证实TSC1CKO小鼠软骨细胞的PTHrP增多,而雷帕霉素可以抑制其表达。免疫荧光实验也观察到,TSC1CKO小鼠软骨细胞的Gli2入核增多。五、结论本文利用基因敲除小鼠与细胞模型,探讨了TSC1/mTORC1/S6K1信号通路在软骨发生中的作用及PTHrP分泌调控机制,得出以下主要结论：1、软骨细胞规律的增殖肥大分化过程中,伴随着mTORC1通路活性的变化：静息期软骨细胞维持一定的mTORCl活性,增殖期及前肥大期软骨细胞mTORC1活性增高,随后分化进行时肥大期软骨细胞mTORC1活性缺失。2、mTORC1抑制剂雷帕霉素可以促进软骨细胞肥大分化,特别是终末肥大分化。3、软骨细胞内过度激活的mTORC1使得小鼠出现侏儒表型。主要原因是,软骨细胞增殖增加,肥大分化减少,终末肥大分化延迟,成骨延迟。而雷帕霉素可以一定程度上逆转这个现象。4、过度激活的mTORC1通路主要通过调控PTHrP来影响软骨细胞规律分化。激活的mTORC1导致PTHrP表达增多。增多的PTHrP使得肥大分化变慢,终末肥大分化及成骨延迟。5、过度激活的mTORC1通路是通过S6K1和Gli2的相互作用使PTHrP表达增多。S6K1使Gli2的S234位点磷酸化增多,抑制SuFu同Gli2的结合,从而使得Gli2入核增多,使得PTHrP表达增多。至此,本研究不仅证明mTORC1通路活性是伴随软骨细胞增殖分化而变化的,而且证明了适当的、精确调控的mTORC1通路活性对于软骨细胞正常的增殖分化来说是至关重要的。而且我们阐明了mTORC1是如何调控PTHrP分泌来控制软骨细胞的规律分化这一新机制。本研究为了解软骨细胞发育分化提供新的观点,为临床上各类软骨发育不良及各类侏儒症的诊治提供了新的思路。
王彦玲[5]2017年在《E2F1/TopoⅡβ信号途径在SH-SY5Y细胞神经元分化中的作用》文中提出在哺乳动物个体发育中,神经系统的发育是一个非常复杂的过程。其中,神经元分化对于神经系统的形成是非常重要的。神经元分化过程中,信号分子与细胞增殖、细胞周期、细胞分化紧密协调,调控神经细胞的发育与成熟。探讨神经元分化调控的分子机制对于神经发育、神经再生、神经系统退行性疾病,以及脑肿瘤的发生发展和治疗有重要意义。拓扑异构酶IIβ(Topoisomerase IIβ,Topo IIβ)是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。腺病毒E2转录结合因子-1(E2F1)是一个重要的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化进程中,发挥着重要作用。西洛他唑(cilostazol,CLZ)是抗血小板类药物,对神经元损伤有保护作用,而且最近有研究报道CLZ可干扰E2F1与其靶基因的结合,促进神经元分化,但其确切作用机制尚不明确。因此,本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型,通过外源性上调E2F1的表达,检测细胞分化过程中E2F1和Topo IIβ的表达变化,进而探讨神经元分化的分子机制,为临床神经系统疾病的研究与治疗提供一些依据。本研究共分叁部分。第一部分E2F1对维甲酸诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响目的:研究转录因子E2F1转染SH-SY5Y细胞后,观察其对细胞生长状况的影响,以及与维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导神经元分化之间的关系。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养,置37℃、饱和湿度、5%CO_2环境下培养,待细胞进入对数生长期后进行实验操作。2 E2F1质粒转染:E2F1过表达质粒用Lipofectamine 2000转染SH-SY5Y细胞,倒置荧光显微镜、q RT-PCR以及Western blot观察转染效率。3诱导分化:E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,加入维甲酸(RA)10μmol/L诱导分化3d。4细胞生长状况检测:MTT检测转染前后细胞生长指数,并绘制生长曲线,倒置显微镜观察转染前后细胞分化形态。5细胞周期检测:收集各组细胞,流式细胞术检测G0/G1、S和G2/M期细胞百分比。6各组细胞神经元分化的鉴定:神经元突起生长的检测;MAP2表达的免疫荧光及蛋白印迹检测。7统计学方法:实验结果以x±s表示,单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为有显着性意义。结果:1 SH-SY5Y细胞呈贴壁、簇状生长,胞体小而圆,大多数为不规则形,少数呈梭形,有较短的神经突起。2倒置荧光显微镜、q RT-PCR以及Western blot检测转染效率E2F1过表达质粒带有绿色荧光,Lipofectamine 2000转染E2F1过表达质粒进入SH-SY5Y细胞1d、2d、3d后,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,从而判断转染效率在80%以上。转染后提取E2F1总RNA及总蛋白,采用q RT-PCR以及Western blot技术检测,在E2F1过表达细胞中E2F1的m RNA及蛋白水平都有显着增高,与未转染组和空载体组相比,有显着性差异(P<0.05)。说明过表达E2F1质粒已经成功转染进入SH-SY5Y细胞。3细胞生长状况SH-SY5Y细胞转染E2F1过表达质粒后,MTT结果显示:与对照组(Con)相比,E2F1过表达组(over)细胞生长最快,二者有显着性差异(P<0.05)。转染后加入10μmol/L RA诱导分化,诱导组(Con+RA)与对照组(Con)相比,细胞生长速度明显降低,而E2F1过表达组加入RA后(over+RA),生长速度没有明显降低,与对照组没有显着性差异。4细胞分化形态学变化E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞,加入或不加10μmol/L RA诱导分化,3 d后倒置显微镜下观察:RA未处理组中,过表达组(over)细胞形态与对照组(Con)相比,无明显区别;在RA处理组中,与未诱导组相比,RA诱导分化组细胞数目减少,胞体聚集生长,神经突起长度明显增长。对单个细胞平均神经突起长度测量,结果显示:Con+RA组与Con组相比,有显着性差异(P<0.05);而over+RA组的SH-SY5Y细胞突起长度增加不明显。5转染E2F1过表达质粒对细胞周期分布的影响E2F1过表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,流式结果显示:E2F1过表达组(over)G0/G1期细胞比对照组(Con)减少了7.354%,S期增加了5.071%,与对照组(Con)相比,二者有显着性差异(P<0.05),而空载体组(over C)与对照组(Con)相比没有显着性差异。转染后RA诱导细胞分化3 d,Con+RA组与Con组细胞相比,G0/G1期细胞明显增多,比Con组增加了23.597%,S期细胞明显降低,减少了28.410%,表明发生了G0/G1期阻滞(P<0.05);over+RA组与Con组细胞相比,G0/G1期细胞增加了8.224%,S期减少了9.942%(P<0.05)。提示RA可诱导细胞周期阻滞,过表达E2F1可促进细胞周期进程。6神经元分化的鉴定采用神经元分化标志分子,微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)鉴定神经元分化。免疫荧光染色结果表明,E2F1过表达组(over)与对照组(Con)相比,MAP2的表达较弱;10μmol/L RA处理SH-SY5Y细胞后,MAP2不仅在细胞质中的表达增加,而且在神经元的突起中表达也明显增加,Con+RA组与Con组细胞相比,有明显增加。而over+RA组MAP2表达量较低,与Con组相比,没有明显区别。Western blot检测MAP2表达,显示的结果与免疫荧光结果一致。结论:SH-SY5Y细胞经10μmol/L RA诱导可使细胞脱离细胞周期,并向神经元分化;E2F1过表达可促进SH-SY5Y细胞增殖,降低神经元分化;研究结果表明,细胞内E2F1水平可影响神经元分化,其具体机制尚需进一步研究。第二部分E2F1通过负调控Topo IIβ表达抑制SH-SY5Y细胞向神经元分化目的:检测E2F1和Topo IIβ表达对SH-SY5Y细胞向神经元分化的影响。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞以DMEM培养基培养,置37℃、饱和湿度、5%CO_2培养箱内培养。2免疫荧光、q RT-PCR以及Western blot检测E2F1过表达质粒转染细胞后对Topo IIβ表达变化的影响。3 q RT-PCR和Western blot技术检测细胞周期相关蛋白p27、cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA及蛋白表达变化的影响。4染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)检测E2F1在Topo IIβ基因启动子区的募集与结合。5统计学方法:同第一部分。结果:1转染E2F1过表达质粒对细胞中Topo IIβ表达变化的影响免疫荧光染色结果显示:Topo IIβ的表达在细胞核中,E2F1过表达组(over)与对照组(Con)相比,Topo IIβ的表达较弱,而空载体组(over C)与对照组(Con)相比没有显着性差异。10μmol/L RA诱导SH-SY5Y细胞后,Con+RA,over C+RA组与Con组细胞相比,Topo IIβ表达明显增加,而over+RA组Topo IIβ表达量低于Con组。q RT-PCR以及Western blot检测的结果与免疫荧光结果一致。2 q RT-PCR检测p27、cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA表达与对照组细胞相比,E2F1过表达组(over)的p27 m RNA表达量明显降低(P<0.05),而cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA的表达高于对照组(P<0.05)。空载体组(over C)与对照组(Con)相比没有显着性差异。RA诱导后,Con+RA、over C+RA组与Con组细胞相比,p27 m RNA表达明显增加(P<0.05),而over+RA组表达量低于Con组(P<0.05);对于cyclin D1、CDK4、E2F1 m RNA的表达,Con+RA组低于Con组(P<0.05),而over+RA组高于Con组(P<0.05)。3 Western blot检测p27、cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达与Con相比,over中p27蛋白的表达量明显降低(P<0.05),而cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达高于Con(P<0.05),over C与Con相比没有显着性差异。RA诱导后,Con+RA、over C+RA与Con细胞相比,p27蛋白表达明显增加(P<0.05),而over+RA组的表达量低于Con组(P<0.05);对于cyclin D1、CDK4、p-Rb、E2F1蛋白的表达,Con+RA组低于Con组(P<0.05),而over+RA组高于Con组(P<0.05)。4 E2F1在转录水平负反馈调节Topo IIβ的表达Ch IP检测显示,Topo IIβ基因启动子区有E2F1的结合位点,E2F1过表达组中,结合在Topo IIβ上的E2F1表达水平较对照组明显升高了(P<0.05)。RA诱导后,随着诱导分化时间的延长,特异性结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1逐渐减少,Con+RA组的表达量低于Con组(P<0.05),over+RA组高于Con组(P<0.05)。说明结合在Topo IIβ基因启动子区的E2F1与细胞的分化状态成反比,高表达的E2F1在RA诱导SH-SY5Y细胞分化过程中,通过抑制Topo IIβ的表达,抑制了细胞的分化。结论:RA诱导可降低SH-SY5Y细胞中E2F1的表达,诱导神经元分化,其作用与Topo IIβ的表达上调有关;细胞内E2F1水平增高可促进细胞周期相关蛋白的表达,抑制神经元分化;E2F1可作用于Topo IIβ基因启动子,在神经元分化进程中调控Topo IIβ表达;高表达的E2F1增强了其在Topo IIβ基因启动子区的募集,抑制Topo IIβ的表达,进而抑制神经元分化。第叁部分西洛他唑通过E2F1/Topo IIβ途径诱导神经元分化目的:探讨CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,Topo IIβ的表达变化,以及E2F1/Topo IIβ途径对神经元分化的影响及其机制。方法:1细胞培养:SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清,100 U/m L青霉素,100μg/m L链霉素的DMEM培养基,置37℃、5%CO_2培养箱内培养。2 MTT检测CLZ对SH-SY5Y细胞的作用浓度。3细胞分化百分率检测:不同浓度的CLZ作用于人SH-SY5Y细胞,分别在0~5 d观察、测量各组细胞突起长度的变化。以单个细胞总突起长度大于100μm作为细胞分化标准,计算细胞分化百分率。4细胞分化形态学观察:30μmol/L CLZ作用于人SH-SY5Y细胞0~3d,观察CLZ处理前后细胞形态学变化,检测分化情况。5神经元分化的鉴定:免疫荧光及Western blot技术检测神经元分化标志蛋白MAP2的表达。6 Topo IIβ的表达:分别用免疫荧光、q RT-PCR技术以及Western blot检测Topo IIβ在CLZ处理前后的表达变化。7 q RT-PCR技术以及Western blot检测p27、E2F1、PCNA在m RNA和蛋白水平的表达变化。8 Ch IP检测E2F1在Topo IIβ以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因启动子区的结合。9统计学方法:同第一部分。结果:1 MTT结果显示:不同浓度的CLZ(10、20、50、100、200、400μmol/L)作用于SH-SY5Y细胞1、2、3、4、5 d后可抑制细胞的增殖,随着CLZ浓度的增加和培养时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增大,与对照组相比,具有统计学意义(P<0.05)。提示CLZ对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。应用半数抑制浓度(IC50)计算软件计算CLZ对SH-SY5Y细胞的IC50:第1~5 d分别为:167.472±6.289、76.334±2.549、36.629±3.148、31.382±2.148、28.146±1.485μmol/L。2细胞分化百分率CLZ诱导细胞向神经元分化过程中,10、20、50μmol/L CLZ在1~3 d细胞分化百分率逐渐增加,第3 d达到最高,结合MTT计算的CLZ对SH-SY5Y细胞第1~5 d的IC50结果,因此选用30μmol/L CLZ诱导细胞分化3 d,进行以下实验。3细胞分化形态学变化与对照组相比,CLZ诱导组细胞逐渐出现增殖速度下降,细胞数目减少,突起伸出,且突起数量和长度逐渐增加。诱导第3 d,细胞具有多个细长突起,且突起的长度明显增长,交织成网状,具备成熟神经元的形态特点,与对照组细胞相比有显着性差异(P<0.05)。4神经元分化的鉴定免疫荧光检测MAP2表达情况,结果显示:30μmol/L CLZ诱导细胞向神经元分化3 d后,突起长度明显增加,与对照组细胞相比有明显差异(P<0.05)。Western blot同样显示MAP2蛋白表达增高,与对照组细胞相比有显着性差异(P<0.05),说明30μmol/L CLZ可以诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。5 Topo IIβ的表达检测免疫荧光检测Topo IIβ表达情况,结果显示:CLZ诱导组细胞核染色明显加深,q RT-PCR、Western blot均显示Topo IIβ表达增高,与对照组细胞相比有明显差异(P<0.05)。6 p27、E2F1和PCNA的表达变化CLZ诱导细胞向神经元分化过程中p27在m RNA和蛋白水平均高于对照组细胞,有明显差异(P<0.05),而E2F1、PCNA均低于对照组细胞,有显着性差异(P<0.05),说明30μmol/L CLZ可以诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。7 CLZ影响E2F1在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的结合Ch IP检测显示,CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,结合在Topo IIβ和PCNA基因启动子区的E2F1蛋白受到明显抑制(P<0.05)。提示:E2F1/Topo IIβ途径参与了CLZ诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化,CLZ促进了Topo IIβ的转录表达,抑制了细胞的增殖,促进了细胞的分化。结论:本部分研究以E2F1正向调控的靶基因PCNA作为对照,探讨了CLZ对E2F1和Topo IIβ表达的影响。结果提示,CLZ可通过抑制E2F1与Topo IIβ基因结合作用,诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化;从而进一步证明E2F1/Topo IIβ信号途径参与了神经元的分化,并为有关神经发育的研究,相关药物开发及有关神经系统疾病的治疗,提供了新的分子靶点。
赵伟[6]2016年在《miR-556-5p负调控PPP2R2A促进前列腺癌细胞增殖的实验研究》文中研究指明背景目前,发达国家男性最常见的癌症是前列腺癌,前列腺癌是全世界男性恶性肿瘤相关死亡的主要原因。我国近些年来,由于人们生活方式、饮食习惯的改变和人口老龄化等原因,前列腺癌的发病率逐年上升。由于前列腺癌无特异性早期症状及肿瘤筛查相对滞后等原因,我国很多前列腺癌患者在明确诊断时往往已是肿瘤晚期。目前临床上主要应用前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)及前列腺穿刺活检(prostate biopsy)的病理学对前列腺癌诊断、监测进展及预后判断。Gleason评分是前列腺腺癌组织学分级的方法,被广泛用于诊断、评估患者预后及指导治疗方案的选择。但是目前这些用于诊断及预后判断方法的准确率和有效性仍不很高,需要新的和更特异性的生物标志物用于临床。局限性前列腺癌的标准治疗包括根治性手术和根治性放疗,虽然早期前列腺癌通常可以治愈,但在发现时往往有20%～30%患者的肿瘤已侵犯到前列腺外,对于该类患者,目前临床上常用放疗及雄激素去势治疗(Androgen-deprivation therapy, ADT)改善患者总生存期,尽管大多数患者起初对内分泌治疗有效,但经过中位时间14～30个月后,几乎所有患者都将逐渐由雄激素敏感性前列腺癌转变成去势抵抗性前列腺癌(Castrate-resistant Prostate Cancer, CRPC)前列腺癌一旦进展到CRPC,尤其是转移性CRPC (metastatic CRPC, mCRPC)则预后极差,CRPC是前列腺癌患者死亡的主要原因。尽管近几年新开发的一些抗肿瘤药物,如多西他赛、醋酸阿比特龙、卡巴他赛、恩扎鲁胺和sipuleucel-T等,在一些CRPC患者中显示出一定临床疗效。然而,对患者总生存率改善不尽人意。因此,迫切需要了解前列腺癌发生发展的潜在分子机制,以帮助发现可用于早期诊断、预后判断的生物标记物,以及发现更有效的治疗方法。小分子核糖核酸MicroRNAs(简写成miRNAs)是广泛存在于多细胞有机体如植物、动物及人类中的一类内源性非蛋白质编码的RNA小分子(包含约22个核苷酸),miRNAs通过序列互补识别并结合靶基因信使RNA(mRNA),促使靶基因mRNA的降解或翻译抑制,参与转录后基因表达的调控。miRNAs调节多种细胞功能,包括调节细胞生长、细胞和组织分化(与癌症发生相关的细胞过程)、凋亡以及抗应激等。目前,在所有物种中已确认超过10,000个miRNAs,人类基因中已发现超过1300个miRNAs。人类miRNAs多数位于基因间区或已知的转录内含子内,大约有1%-5%的基因是miRNAs,它们参与调节大约60%的蛋白质编码基因。即使一个单一的miRNAs异常表达,也可能会影响到大量的细胞过程,据预测每个miRNAs有可能影响到上百个蛋白质的表达,从而破坏体内平衡状态。有趣的是,一个基因编码序列可由几个miRNAs调控,而一个miRNAs可调控多个靶基因mRNA。越来越多的证据表明,miRNAs表达失调和功能的改变与人类肿瘤不受控制的生长有关,它们参与调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等生物过程。在人类许多恶性肿瘤中,都观察到存在miRNAs表达失调。同样在前列腺癌细胞,也发现一些miRNAs较前列腺良性组织发生了改变,例如miR-16、miR-23b、miR-143、 miR-145、let-7、miR-99、miR-125、miR-221、miR-29和miR-30等在前列腺癌表达下调,而miR-21、miR-20a、miR-32、miR-184、miR-198和miR-370等则在前列腺癌表达上调。抑癌miRNAs缺少或致癌miRNAs的表达增加最终促进肿瘤细胞增殖、浸润和转移。研究发现,作为miRNAs之一的miR-556同样参与了肿瘤的发生发展,2006年在关于人结直肠癌细胞miRNAs表达谱的研究中首次描述了miR-556,其后的第二年,Landgraf等在对恶性肿瘤miRNAs分析中miR-556作为致癌miRNAs被描述,随后在其他恶性肿瘤如宫颈癌和黑色素瘤等亦描述了miR-556。目前对于很多miRNAs,尤其是miR-556在前列腺癌中的作用尚不清楚,更加全面深入的研究这些miRNAs及其调控的基因,对进一步了解前列腺癌发生发展机制,发现新的早期诊断及预后判断的肿瘤标记物,以及开发新的靶向治疗药物具有重要意义。目的前列腺癌进展到CRCP后预后很差,目前尚无有效的治疗方法,急需发现能够早期诊断及判断预后的生物标志物,以及新的治疗靶点。目前,microRNAs与前列腺癌发生发展的相关性尚不清楚,需要进一步研究以更好地了解miRNAs在前列腺癌的基因调控网络。本课题通过检测作为miRNAs之一的miR-556-5p在前列腺癌的表达及对肿瘤细胞生物学行为的影响,旨在研究miR-556-5p在前列腺癌发生发展中的作用,通过进一步探讨miR-556-5p的作用机制,从而有望为前列腺癌早期诊断、预后判断提供新的生物标记物,并提供潜在的治疗靶点和治疗策略。方法为研究miR-556-5p在前列腺癌发生发展中的作用及机制,本课题分叁部分进行。第一部分：为了检测miR-556-5p在前列腺癌的表达情况,我们在临床收集前列腺癌组织和对应的癌旁非肿瘤组织,并培养人类前列腺癌细胞系M12、 Tsu-Prl、PC3、DU145、22RV1和LNCAP以及非肿瘤前列腺上皮细胞系RWPE-1,应用实时定量PCR技术检测miR-556-5p表达水平,分析miR-556-5p在临床前列腺肿瘤组织及前列腺癌细胞系中的表达有无失调。第二部分：为了研究miR-556-5p在前列腺癌细胞中的作用,我们通过上调和下调前列腺癌PC3细胞miR-556-5p的水平,应用MTT测定、细胞集落形成实验和锚定非依赖性生长测定等方法,观察miR-556-5p对PC3细胞生物学行为的影响。第叁部分：为进一步探讨miR-556-5p在前列腺癌中的作用机制,我们应用生物信息学算法预测miR-556-5p可能的靶基因,然后通过蛋白印迹技术(western blotting)和荧光素酶检测法(luciferase assay)验证,其后进一步研究靶基因在前列腺癌中的作用。结果miR-556-5p在前列腺癌组织和前列腺癌细胞系中表达上调。与相邻非肿瘤组织和非肿瘤上皮前列腺细胞系相比,在8例前列腺癌患者标本及6个前列腺癌细胞系中,miR-556-5p均明显高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-556-5p促进前列腺癌细胞增殖。miR-556-5p表达失调增加了PC3细胞的生长率,细胞集落形成实验显示miR-556-5p的上调促进了PC3细胞的集落形成能力,锚定非依赖性生长测定显示PC3细胞的独立生长能力和miR-556-5p水平相关(P<0.05),而下调miR-556-5p则显示出相反的作用(P<0.05)。PPP2R2A是miR-556-5p直接调控的下游靶基因。我们用TargetScan算法发现PPP2R2A mRNA 3’-非编码区(3’-UTR)与miR-556-5p“种子”序列互补。为证实miR-556-5p是否通过直接结合3’-UTR区域抑制PPP2R2A的表达,我们应用蛋白印迹技术和荧光素酶检测法,野生型PPP2R2A的3’-UTR克隆进荧光素酶基因,荧光素酶基因转染PC3细胞,PC3细胞同时分别被miR-556-5p mimics、 miR-556-5p inhibitor及miRNA negative controls (NC)共转染。蛋白印迹结果显示上调miR-556-5p的PC3细胞的PPP2R2A蛋白水平显着降低(P<0.05),而下调miR-556-5p则促进PPP2R2A蛋白的表达。上调PC3细胞miR-556-5p后,PPP2R2A 3'-UTR荧光素酶的活性显着降低(P<0.05),而下调miR-556-5p则出现相反的结果(P<0.05)。此外,与miRNA NC共转染细胞相比,突变型miR-556-5p共转染细胞的荧光素酶活性无明显改变(P>0.05)。这些研究结果表明miR-556-5p通过直接结合到PPP2R2A 3'-UTR对PPP2R2A进行负调控。本课题通过进一步研究miR-556-5p对PPP2R2A下游基因p27、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的影响发现,在上调miR-556-5p表达的PC3细胞中p27 mRNA及蛋白表达均下调,而cyclin D1则表达上调。反之,在下调miR-556-5p的PC3细胞中,p27 mRNA及蛋白表达上调,而cyclin D1表达下调。结果表明PPP2R2A下游基因p27、cyclin D1参与了miR-556-5p对前列腺癌PC3细胞增殖的调控过程。本课题在下调miR-556-5p的PC3细胞,下调PPP2R2A的表达,观察PPP2R2A下调后对肿瘤细胞集落形成能力和锚定非依赖性生长能力的影响,结果显示下调PPP2R2A可以逆转因miR-556-5p下调所致的PC3细胞增殖抑制作用,即在miR-556-5p促进前列腺癌PC3细胞增殖的过程中,PPP2R2A下调是必须的。结论我们的研究显示miR-556-5p在临床前列腺癌组织和前列腺癌细胞系中表达上调,miR-556-5p这种表达失调导致PPP2R2A表达下调,使p27表达下调及周期蛋白D1表达上调,从而最终促进前列腺癌细胞增殖。总之,我们的研究表明,miR-556-5p作为前列腺的一种致癌miRNAs,通过抑制PPP2R2A表达,在前列腺癌的发生和发展中起重要作用。意义本研究表明miR-556-5p在前列腺癌中表达上调,是一种致癌miRNAs,而且首次发现PPP2R2A是miR-556-5p的直接调控靶基因,miR-556-5p通过负性调控PPP2R2A,促进前列腺癌细胞增殖。因此,本研究将有助于更好地了解前列腺癌的发病机制,miR-556-5p有可能作为前列腺癌的一个早期诊断、预后判断的生物标记物,以及新的治疗靶点。miR-556-5p最令人兴奋的临床应用前景是可能有助于前列腺癌患者的精准治疗。
贺骏, 阮秋蓉, 杨秀萍, 聂秀[7]2006年在《Pin1和Cyclin D1在人类5种常见肿瘤中的表达及其意义》文中指出目的研究人类的肽基脯氨酰异构酶(Pin1)在人类几种重要的肿瘤(肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和胃癌)中的表达及与细胞周期蛋白CyclinD1的关系,并探讨它们在肿瘤的发病机制、诊断和治疗中的意义。方法随机收集33例正常组织和171例癌组织(包括37例肺癌、35例前列腺癌、31例乳腺癌、36例宫颈癌和32例胃癌)。采取免疫组织化学Envision法显示Pin1和CyclinD1的表达。结果Pin1和CyclinD1在正常组织中不表达或者低表达,而在各种癌组织中有普遍性的高表达,在肺癌组织、前列腺癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织和宫颈癌组织中,Pin1的表达率分别为48·7%、65·7%、48·4%、15·6%和69·4%,CyclinD1的表达率分别为56·8%、60·0%、54·8%、40·6%和58·3%。Pin1和CyclinD1在癌组织中的表达明显高于正常组织中的表达(P<0·05)。Pin1和CyclinD1蛋白在肺癌、前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌中表达呈显着正相关(P<0·05)。而Pin1和CyclinD1蛋白在胃癌中的表达相关性不显着(P>0·05)。结论Pin1和CyclinD1在多种肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用,如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和胃癌,Pin1与细胞周期代谢或调控有关。Pin1在某些肿瘤(如肺癌、前列腺癌等)中可作为肿瘤标记的参考指标。
王亚营[8]2018年在《牦牛Cyclin D1、E1基因克隆及IGF-I、TGF-β1对Cyclin D1在睾丸支持细胞表达的影响》文中提出Cyclin D1和Cyclin E1均为细胞G1/S期关键蛋白。本研究旨在克隆牦牛(Bos grunniens)Cyclin D1和Cyclin E1基因的CDS序列,分析其生物学特性,并研究胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I,IGF-I)和转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)对Cyclin D1在睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)中表达的影响。采用RT-PCR技术克隆牦牛Cyclin D1和Cyclin E1基因,采用免疫荧光染色技术对其蛋白在SCs中的表达进行了定位分析。采用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测不同浓度的IGF-I(0(对照组)、25、50、100、150 ng?m L~(-1))和不同时间(0(对照组)、5、12、18、24 h)、不同浓度(0、250、500、750、1000 pg?mL~(-1))的TGF-β1对Cyclin D1基因和蛋白表达的影响。结果如下:(1)牦牛Cyclin D1和Cyclin E1基因与其它物种的同源性均较高,GenBank登录号分别为KY 420723和KY437813。其蛋白在SCs胞核中均高表达,为核蛋白。(2)IGF-I浓度为25和150 ng?mL~(-1)作用组Cyclin D1 mRNA表达量与对照组(0 ng?m L~(-1))差异不显着(P>0.05),50和100 ng?m L~(-1)作用组Cyclin D1 mRNA表达量显着高于其他各组(P<0.05);100 ng?mL~(-1)作用组Cyclin D1蛋白表达量与对照组差异不显着(P>0.05),25、50和150 ng?mL~(-1)作用组Cyclin D1蛋白表达量显着高于对照组(P<0.05);IGF-I浓度为50 ng?m L~(-1)时,Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均为最高,分别为对照组的1.65和1.20倍。(3)TGF-β1作用于SCs 5、12和24 h时,Cyclin D1 mRNA的表达量显着高于对照组(P<0.05),作用到18 h时,其表达量显着低于其它组(P<0.05);不同时间处理组的Cyclin D1蛋白表达量都显着高于对照组(P<0.05)。TGF-β1各浓度处理组中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均显着高于对照组(P<0.05)。TGF-β1以时间和剂量依赖的方式促进Cyclin D1的表达,最佳时间和浓度分别为12 h和750 pg?m L~(-1)。结果表明,Cyclin D1和Cyclin E1在进化过程中高度保守,其蛋白质定位于细胞核;IGF-I和TGF-β1可以通过促进Cyclin D1的表达来调控SCs的生长。本研究为调控SCs的发育提供了实验依据。
李学超[9]2016年在《齐墩果酸在人前列腺癌细胞中的抗癌疗效及其作用机制》文中提出第一部分齐墩果酸在人前列腺癌细胞中的体外抗癌疗效目的：探讨齐墩果酸(OA)对人前列腺癌(PCa)细胞的体外抗癌疗效。方法：用不同浓度的OA处理人PCa PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞。采用CCK-8法检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的存活能力与增殖能力的影响。采用平板克隆形成实验检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的克隆形成能力的影响。采用流式细胞术检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的凋亡与周期分布的影响。采用Transwell法检测OA对PC-3、DU145细胞和LNCaP细胞的迁移侵袭能力的影响。采用caspase活性检测试剂盒检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中caspase-、caspase-9和caspase-3活性的影响。采用线粒体膜电位检测试剂盒检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的线粒体膜电位丢失的影响。采用western blotting法检测OA对PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中裂解的PARP、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、CDK4、cyclin D1、细胞色素c、PI3K、Akt、p-AktSe4473、 p-BadSer136、p-GSK-3β5er9、FOX01和p-FOXO1的蛋白表达的影响。结果：CCK-8法结果显示,OA明显抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的存活能力与增殖能力,且具有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞术结果显示,OA明显诱导了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的凋亡及G0/G1期阻滞,且具有剂量依赖性。平板克隆形成实验结果显示,OA明显抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的克隆形成能力,且具有剂量依赖性。Transwell实验结果显示,OA明显抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞的迁移侵袭能力,且具有剂量依赖性。OA增加了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中caspase8、caspase-9和caspase-3的活性及裂解的PARP水平,且具有剂量依赖性。Western blotting结果显示,OA增加了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中促凋亡蛋白Bax表达,降低了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL以及CDK4和cyclin D1的蛋白表达,且具有剂量依赖性。OA促进了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞线粒体膜电位丢失以及线粒体cyt c向胞质的释放,且具有剂量依赖性。Western blotting法结果显示,OA剂量依赖性地抑制了PC-3细胞、DU145细胞和LNCaP细胞中P13K、p=AktSer473、p-BadSer136和p-GSK-3pSe9的蛋白表达水平,而并未改变FOXO1和p=FOXO1的蛋白表达水平。结论：OA能够剂量依赖性地抑制人PCa细胞的体外存活能力、增殖能力及迁移侵袭能力：OA能够活化线粒体通路,抑制周期相关蛋白表达和PI3K/Akt通路活性。第二部分齐墩果酸通过PI3K/Akt通路抑制人前列腺癌细胞的体外存活与增殖目的：探讨齐墩果酸(OA)抑制人前列腺癌细胞的体外存活与增殖能力的作用机制。方法：采用质粒转染法在人前列腺癌PC-3细胞和DU145细胞中上调Akt基因的表达。采用qRT-PCR法和western blotting法验证Akt基因转染效率。采用CCK-8法检测上调Akt基因表达对OA抑制PC-3细胞和DU145细胞的存活能力与增殖能力的影响。采用平板克隆形成实验检测上调Akt基因表达对OA抑制PC-3细胞和DU145细胞的克隆形成能力的影响。采用流式细胞术检测上调Akt基因表达对OA增强PC-3细胞和DU145细胞的凋亡与周期阻滞的影响。采用caspase活性检测试剂盒检测上调Akt基因表达对OA增加PC-3细胞和DU145细胞的caspase-9和caspase-3活性的影响。采用线粒体膜电位检测试剂盒检测上调Akt基因表达对OA增加PC-3细胞和DU145细胞的线粒体膜电位丢失的影响。采用western blotting法检测上调Akt基因表达对OA抑制PC-3细胞和DU145细胞的p-AktSer473、p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达的影响。结果：qRT-PCR法和western blotting法结果显示,采用质粒转染法成功上调PC-3细胞和DU145细胞的Akt基因表达,且Akt蛋白活性也明显增加。CCK-8法结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的存活能力的抑制效应。流式细胞术结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的凋亡的促进效应。CCK-8法结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的增殖能力的抑制效应。平板克隆形成实验结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的克隆形成能力的抑制效应。流式细胞术结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的G0/G1期阻滞的促进效应。上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的caspase-9和caspase-3活性的活化效应。上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的线粒体膜电位丢失的促进效应。Western blotting法结果显示,上调Akt基因表达明显逆转了OA对PC-3细胞和DU145细胞的p-BadSer136、Bcl-2、 p-GSK-3βSer9和cyclin D1蛋白表达的抑制效应。结论：OA通过PI3K/Akt通路来抑制人前列腺癌细胞的体外存活能力与增殖能力。第叁部分齐墩果酸通过PI3K/Akt通路抑制人前列腺癌PC-3细胞的体内成瘤目的：探讨齐墩果酸(OA)抑制人前列腺癌PC-3细胞体内成瘤的作用机制。方法：四周龄大BALB/c雄裸鼠随机分为四组：NC组、NC+OA组、Akt组和Akt+OA组,每组5只裸鼠。3×106个有或无Akt质粒转染的PC-3细胞注射于相应组的每只裸鼠的右前腋窝皮下。每天150mg/kg的OA注射于相应组的裸鼠腹腔。从第六天,每3天测量肿瘤大小,第21天,处死裸鼠,分离肿瘤并称重。qRT-PCR法检测PC-3细胞成瘤组织中Akt基因的转录水平。Western blotting法检测PC-3细胞成瘤组织中Akt蛋白的表达水平。免疫组织化学法检测PC-3细胞成瘤组织中Akt、p-AktSer473、Ki-67、 p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βS349和cyclin D1的蛋白表达水平。结果：NC+OA组的PC-3细胞体内成瘤组织生长慢于NC组,NC+OA组分离的肿瘤的重量小于NC组,说明OA可以抑制PC-3细胞的体内成瘤能力。Akt+OA组的Akt质粒转染的PC-3细胞体内成瘤组织生长快于NC+OA组,Akt+OA组于第21天分离的肿瘤的重量大于NC+OA组,说明上调Akt基因表达逆转了OA对PC-3细胞体内成瘤的抑制效应。qRT-PCR和Western blotting结果显示,Akt组和Akt+OA组肿瘤组织的Akt蛋白表达高于NC组和NC+OA组,表明Akt蛋白表达成功上调。免疫组织化学法结果显示,与NC组的肿瘤组织比较,NC+OA组肿瘤组织的Ki-67、p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达受到抑制：与NC+OA组的肿瘤组织比较,Akt+OA组的肿瘤组织的Ki-67、p-BadSer136、Bcl-2、p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达增强,说明上调Akt基因表达逆转了OA对PC-3细胞成瘤组织中的Ki-67、p-BadSer136、Bcl-2、 p-GSK-3βSer9和cyclin D1的蛋白表达的抑制效应。结论：OA能够通过PI3K/Akt通路抑制人前列腺癌PC-3细胞的体内成瘤能力。
曾汉荣, 杨虹女, 李文星, 涂欣, 李志华[10]2016年在《HPV16E7、Cyclin D1和pRb的异常表达对喉癌的影响及其机制》文中提出目的:探讨人乳头状瘤病毒16E7蛋白(HPV16E7)、细胞周期调节蛋白D1(Cyclin D1)和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的异常表达对喉癌的影响及其机制。方法:取喉癌组织标本(喉癌组)、喉声带息肉组织标本(息肉组)和喉癌前病变组织标本(癌前组)各69例。采用过氧化物酶标记的链酶卵蛋白素染色免疫组织化学技术和Western Blot技术检测各组喉组织标本中HPV16E7、Cyclin D1和pRb的表达水平。结果:喉癌组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达出现于细胞核,为大量黄褐色粗大颗粒,其阳性表达率分别为44.93%和52.17%,明显强于息肉组(分别为2.90%和8.70%)和癌前组(分别为10.14%和18.84%)(P均<0.01)。pRb的阳性表达发生于细胞核,为少而小的黄色颗粒,其阳性表达率为10.14%,显着小于息肉组的92.75%和癌前组的59.42%(P均<0.01)。癌前组HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率较息肉组提高,pRb阳性表达率较息肉组明显下降(P均<0.005)。在喉癌肿瘤临床分期中,HPV16E7阳性表达率在Ⅰ-Ⅳ期中随着分期增加呈上升趋势,与临床Ⅲ期比较,HPV16E7在Ⅳ期的阳性表达率显着加重(P<0.025);Cyclin D1阳性表达率逐渐增多,pRb阳性表达率逐渐减少(P均<0.005)。在喉癌组织病理分级中,HPV16E7、Cyclin D1和pRb的阳性表达率随着分化程度减弱,HPV16E7和Cyclin D1阳性表达率分别为Ⅲ级>Ⅱ级>Ⅰ级,pRb阳性表达率为Ⅲ级<Ⅱ级<Ⅰ级(P均<0.005)。喉癌组中HPV16E7和Cyclin D1蛋白量均强烈增加,pRb蛋白定量显着减小;HPV16E7阳性表达率的增加与Cyclin D1阳性表达率增加呈显着的正相关(r=0.48,P<0.001),与pRb阳性表达率下降呈严重的负相关(r=-0.41,P<0.005);而Cyclin D1的阳性表达率增加与pRb阳性表达率下降也呈明显的负相关(r=-0.44,P<0.002)。结论:喉癌肿瘤的发生和发展与HPV严重感染宿主细胞造成HPV16E7过度表达,并刺激Cyclin D1恶性增加和pRb严重降低密切相关。通过对HPV16E7、Cyclin D1和pRb的检测有利于提高临床早期诊断和防治喉癌的发生和发展,对患者喉癌恶性程度和生存预后评判均具有重要的临床意义。
参考文献：
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[10]. HPV16E7、Cyclin D1和pRb的异常表达对喉癌的影响及其机制[J]. 曾汉荣, 杨虹女, 李文星, 涂欣, 李志华. 武汉大学学报(医学版). 2016
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