导读:本文包含了胸腺基质细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:胸腺,细胞,基质,免疫,胸腺肽,凋亡,过氧化氢。
胸腺基质细胞论文文献综述
刘菁华,郝朋,李轩[1]（2019）在《胸腺肽β4对H_2O_2诱导的兔角膜基质细胞氧化应激损伤及继发细胞凋亡的抑制作用》一文中研究指出目的探讨胸腺肽β4(Tβ4)对H_2O_2诱导的兔角膜基质细胞氧化应激损伤及继发的细胞凋亡的抑制作用。方法采用组织块培养法获得原代兔角膜基质细胞,选取传代的兔角膜基质细胞,根据实验目的将细胞分为3组:正常组、H_2O_2组以及治疗组。H_2O_2组细胞用200μmol·L~(-1)的H_2O_2处理4 h,随后更换为不含FBS的DMEM/F-12培养液继续培养细胞48 h。治疗组细胞则是在H_2O_2处理后换用含终浓度为1μg·mL~(-1)Tβ4的无FBS的DMEM/F-12培养液继续培养48 h。同时把按常规方法培养的兔角膜基质细胞设立为正常组。采用CCK-8法检测各组细胞活性;应用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐探针检测细胞活性氧水平;实时荧光定量PCR检测细胞中过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶mRNA的相对表达量;采用TUNEL法检测细胞凋亡率。ELISA法检测细胞中Caspase-3蛋白的表达。结果组织块培养法培养的兔角膜基质细胞呈多角形,规则排列呈束状。正常组细胞活性为(100.00±0.00)%、H_2O_2组(66.41±9.28)%、治疗组(82.54±7.72)%;H_2O_2组细胞活性明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞活性明显高于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组细胞活性氧水平为(4.12±0.93)%、H_2O_2组(77.84±6.98)%、治疗组(59.48±8.92)%;与正常组相比,H_2O_2组细胞呈现明显的强阳性着染;H_2O_2组细胞的活性氧水平明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞的活性氧水平明显低于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。H_2O_2组细胞过氧化氢酶及锰超氧化物歧化酶mRNA的相对表达量较正常组均明显下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05);治疗组细胞过氧化氢酶及锰超氧化物歧化酶mRNA的相对表达量较H_2O_2组均显着升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。正常组细胞凋亡率为(6.81±1.48)%、H_2O_2组(76.14±6.12)%、治疗组(39.04±7.47)%;H_2O_2组细胞凋亡率明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞凋亡率明显低于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组细胞内Caspase-3蛋白的质量浓度为(0.46±0.09)ng·mL~(-1)、H_2O_2组(0.95±0.08)ng·mL~(-1)、治疗组(0.56±0.17)ng·mL~(-1);H_2O_2组细胞内Caspase-3蛋白的质量浓度较正常组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);治疗组细胞内Caspase-3蛋白的质量浓度明显低于H_2O_2组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 H_2O_2可诱导兔角膜基质细胞发生氧化应激损伤并继发细胞凋亡,而Tβ4对细胞的氧化应激损伤及细胞凋亡有抑制作用,其作用机制可能与Tβ4对细胞内Caspase-3、过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶表达的调节有关。(本文来源于《眼科新进展》期刊2019年03期）
王亚君[2]（2019）在《Notch信号通路在胸腺基质细胞向脂肪细胞转分化过程中的作用及机制研究》一文中研究指出目的:胸腺是机体重要的免疫器官,是孵育T淋巴细胞成熟的场所,来自骨髓的淋巴造血祖细胞(lymphohematopoietic progenitor cell,LPC)经过血液循环进入胸腺,与胸腺微环境相互作用并逐步向成熟的T淋巴细胞发育,最终经胸腺移行到外周的免疫器官并发挥免疫调节功能。胸腺在青春期时重量达到最大,随后便开始发生增龄性萎缩,是机体最早发生衰老的器官,胸腺老化主要表现为明显的萎缩,以腺体变小,重量减低,细胞结构破坏和脂肪细胞的积累为特征。胸腺增龄性萎缩会引起免疫系统衰老和应答免疫系统功能低下,进而导致自身免疫性疾病的发生、增加机体罹患癌症及感染性疾病的危险。近些年的研究表明,许多老年人常见的疾病,如糖尿病、心血管疾病等也可能与胸腺功能减退导致的免疫功能下降相关。胸腺基质细胞是胸腺微环境的主要组成部分,包含胸腺上皮细胞(thymus epithelial cell,TEC)、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞(deutrtic cell,DC)等,有研究表明,胸腺内的脂肪细胞主要是由成纤维细胞分化发育而来,然而胸腺内的成纤维细胞向脂肪细胞分化发育的机制却并不清楚。因此研究胸腺脂肪化的分子机制,为进一步探究胸腺的发育和萎缩的分子机制,对提高机体免疫力、延缓免疫系统衰老至关重要。研究方法:1、原代胸腺基质细胞的培养及鉴定:选取出生3天内的小鼠胸腺,利用酶消化方法提取原代的小鼠胸腺基质细胞(thymic stromal cell,TSC),流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测细胞的表型。使用过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激动剂罗格列酮,诱导体外培养的TSCs分化成为脂肪细胞,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理的细胞作为对照,油红O染色检测脂滴的形成情况,Real-time PCR检测成脂相关基因PPARγ、FABP4(fatty acid binding protein 4)的mRNA表达水平。2、TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达lncRNA和mRNA的筛选:DMSO组及罗格列酮诱导组各取叁组样本,采用高通量测序技术(High-throughput Sequencing),以筛选的阈值为qvalue<0.05(若qvalue<0.05筛选差异基因过少则使用pvalue<0.05进行差异筛选)作为筛选TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达的lncRNA和mRNA标准,并对筛选后差异表达的lncRNA和mRNA进行非监督层次聚类分析、GO分析(gene ontology,GO)和KEGG分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes),使用Real-time PCR验证所筛选出的与成脂相关基因的表达变化。3、Notch信号通路在TSCs向脂肪细胞分化过程中的作用:使用Real-time PCR检测在罗格列酮将TSCs诱导分化成为脂肪细胞的过程中Notch信号通路受体(Notch1~4)、配体(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)及下游靶基因(Hes1、Hey1)的表达变化,随后过表达或抑制Notch1,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。4、Notch信号通路与自噬共同调节TSCs的脂肪化:Western blot检测罗格列酮诱导TSCs后0、1、3、5、7天时自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达水平。Western blot检测不同浓度的Notch信号通路抑制剂DAPT(0、1、2、5、10μm)处理TSCs后自噬相关蛋白LC3、p62及自噬相关通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达水平。在罗格列酮诱导TSCs的过程中同时使用Notch信号通路抑制剂DAPT及自噬抑制剂3-MA,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成情况,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。结果:1、原代TSCs的提取与鉴定:提取的原代TSCs大多数呈成纤维细胞样,流式细胞术结果显示约97%的细胞呈CD45~-S100A4~+表型,细胞免疫荧光结果也显示多数的细胞呈S100A4~+表型,说明多数的TSCs为成纤维细胞;2、罗格列酮诱导原代TSCs向脂肪细胞分化:分别用DMSO和10μm罗格列酮对TSCs进行处理,(1)油红O染色结果DMSO对照组中并无脂滴形成,而罗格列酮处理组有大量的脂滴出现;(2)Real-time PCR检测脂肪形成相关基因PPARγ与FABP4的mRNA水平,发现罗格列酮诱导组中,两个基因的表达较对照组明显增高;3、筛选TSCs向脂肪细胞转分化过程中差异表达的lncRNA及mRNA:(1)高通量测序一共筛选出1737个差异表达的mRNA(965个上调和772个下调)、45个差异表达的lncRNA(29个上调和16个下调)和31个差异表达的不确定编码潜能的转录本(transcripts of uncertain coding potential,TUCP)(14个上调和17个下调);(2)利用非监督层次聚类的方法对差异表达基因进行分析,分别使用差异表达的lncRNA、TUCP的靶基因和mRNA产生热图,它们清楚地被分离成Rosi和对照簇,同组样本聚在同一簇中;(3)GO显着性富集分析结果显示筛选得到的差异基因无论是mRNA、lncRNA还是TUCP都主要是在细胞代谢、有机物质代谢、氮化合物代谢等过程中显着富集;(4)筛选得到的差异mRNA在PPARγ、胰岛素、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)及泛素化介导的蛋白水解相关的信号通路发生显着富集,筛选到的差异lncRNA主要在丝裂原活化蛋白激酶(Mtogen-activated protein kinase,MAPK)、泛素化蛋白水解、过氧化物等信号通路发生显着富集,筛选到的差异TUCP在癌症、神经营养因子等信号通路发生显着富集;4、Notch信号通路在TSCs脂肪化中的作用:(1)Real-time PCR检测结果显示在TSCs向脂肪细胞分化过程中Notch信号通路的受体Notch1、配体Jagged1及靶基因Hey1的表达下降,而配体DLL1的表达升高;(2)构建携带Notch1基因的腺病毒,并转入TSCs中,Western Blot结果显示Notch1过表达后,胞浆内Notch1及胞核内Notch1活化片段N1ICD的蛋白水平表达升高,Real-time PCR结果显示Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达升高;(3)对过表达Notch1基因的TSCs进行罗格列酮诱导,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成受到抑制。Real-time PCR检测结果显示成脂相关基因FABP4的mRNA表达水平出现下降;(4)DAPT和si-Notch1作用于TSCs,胞浆内Notch1及胞核中N1ICD的蛋白水平下降,同时Notch信号通路的下游靶基因Hey1的mRNA水平也出现下降;(5)DAPT和si-Notch1抑制Notch信号通路的同时添加罗格列酮诱导TSCs向脂肪细胞分化,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成增多,成脂相关因子PPARγ及FABP4的mRNA表达水平在抑制Notch信号通路后表达出现上升;5:Notch信号通路与自噬共同调节TSCs向脂肪细胞分化:(1)分别在罗格列酮处理TSCs后的第0、1、3、5、7天收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3、Becline1蛋白水平无明显变化,p62的蛋白表达水平降低;(2)用不同浓度的DAPT(0、1、2、5、10μm)对TSCs进行处理,48h后收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3-II/LC3-I随DAPT浓度的增高而呈现逐渐增长的趋势,p62蛋白水平出现了降低,p-AKT/AKT与p-mTOR/mTOR的蛋白表达水平降低;(3)添加自噬的抑制剂3-MA,同时添加或不添加Notch信号通路抑制剂DAPT,油红O染色和AdipoRed染色结果显示使用3-MA抑制自噬后脂肪滴的形成减少,同时还可以部分逆转DAPT导致的脂肪滴形成的增加,在DAPT处理TSCs的同时添加了3-MA,PPARγ及FABP4的表达较单独使用DAPT组下降。结论:1、在罗格列酮诱导的TSCs向脂肪细胞分化过程中有1737个mRNA(965个上调和772个下调)、45个lncRNA(29个上调和16个下调)和31个TUCP(14个上调和17个下调)表达发生明显的改变;2、调节Notch信号通路水平可以影响TSCs向脂肪细胞分化的过程;3、抑制Notch信号通路可通过提高自噬水平来促进TSCs向脂肪细胞的分化。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-01-01）
洪剑,王磊,王玉华,许望翔,葛常辉[3]（2011）在《Notch配体阳性的成纤维基质细胞体外诱导胸腺细胞发育和凋亡的影响》一文中研究指出目的观察表达Notch配体的基质细胞在体外诱导对小鼠胸腺T淋巴细胞表面抗原表达和细胞凋亡的影响。方法应用Notch配体(Delta1和Jagged1)阳性的L细胞,与胸腺T淋巴细胞或经过分选纯化的CD4+CD8+双阳性T淋巴细胞进行体外共培养,观察了Notch配体阳性细胞对T淋巴细胞表面CD4和CD8抗原的表达变化以及T淋巴细胞向单阳性淋巴细胞转化的影响,同时应用Annexin-V抗体观察了细胞凋亡的变化。结果经过与Delta1和Jagged1配体阳性细胞共孵育后,CD4+CD8+双阳性T淋巴细胞转化率降低5.7%和7.6%,其中向CD4+单阳性淋巴细胞的转化明显受到抑制,分别下降了12.8%和6.7%,而CD8+单阳性淋巴细胞的比例没有明显改变;淋巴细胞凋亡也明显降低了30%。结论 Notch和配体相互作用可能参与并抑制T淋巴细胞的晚期成熟分化。(本文来源于《中华临床医师杂志(电子版)》期刊2011年09期）
蒋定文,郭明秋,陈立茵,沈先荣,陈伟[4]（2010）在《胸腺基质细胞对热应激小鼠胸腺细胞亚群变化及HSP70表达的影响》一文中研究指出目的探讨胸腺基质细胞(TSC)对热应激小鼠胸腺细胞的调节作用。方法应用光镜、电镜、流式细胞术等观察初代培养的TSC对热应激胸腺细胞发育的调节作用。结果 TSC可大量粘附和吞噬胸腺细胞,使热应激胸腺细胞数量明显减少,但尚存的胸腺细胞中活细胞比例却明显增加,凋亡率明显减少。TSC可促进热应激胸腺细胞HSP70表达增加,使热应激胸腺细胞的DP及SP细胞,尤其是DP细胞数量明显减少。结论 TSC可清除大量的热应激胸腺细胞,TSC促进热应激胸腺细胞HSP表达增高可能具有双重意义:既可保护胸腺细胞,又可促进TSC识别和吞噬已受损的或凋亡的胸腺细胞。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2010年03期）
李新华,张开明,尹国华[5]（2008）在《胸腺基质细胞支持下骨髓CD34~+细胞向T细胞体外定向分化》一文中研究指出目的:研究人骨髓CD34+细胞体外向T细胞定向分化的方法,为研究造血细胞淋系造血活性及T细胞发育和分化提供技术平台。方法:免疫磁珠法分离骨髓CD34+细胞,在骨髓基质细胞条件培养液构建的微环境下,在胸腺基质细胞的支持下,使其体外向T细胞定向分化,收集培养的非贴壁细胞,免疫荧光染色后经流式细胞术检测培养不同时间CD1-CD3+细胞、CD3+CD4+CD8-细胞及CD3+CD4-CD8+细胞比例。结果:培养1周时,培养细胞中以不成熟的CD1+CD3-细胞、CD1+CD3+细胞为主,可检测到少量CD1-CD3+细胞,随培养时间延长,不成熟细胞比例逐渐减少,而成熟的CD1-CD3+细胞比例逐渐增加;在CD3+细胞中,培养初期以不成熟的双阳性细胞CD4+CD8+为主,而成熟的单阳性CD4+CD8-细胞及CD4-CD8+细胞占极小比例,随培养时间延长,双阳性细胞比例逐渐减少,而成熟的单阳性细胞比例逐渐增高;而无胸腺基质细胞支持的CD34+细胞仅在培养初期检测到成熟细胞存在,而培养后4周基本检测不到成熟T细胞的存在。结论:在骨髓基质细胞及胸腺基质细胞的支持下,骨髓CD34+细胞可体外发育为成熟的CD1-CD3+细胞及单阳性T细胞,其中胸腺基质细胞的支持对于造血细胞向T细胞的体外定向分化极其重要。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2008年09期）
张开明,李新华,尹国华[6]（2006）在《胸腺基质细胞支持下骨髓CD34~+细胞向T细胞体外定向分化》一文中研究指出本文研究了人骨髓CD34+细胞体外向T细胞定向分化的程序,为进一步研究银屑病患者骨髓CD34+细胞定向分化的T细胞活性方法提供理论依据。采集13例正常人骨髓,密度梯度离心法分离骨髓单一核细胞,Tris-NH4Cl液裂解残留红细胞,免疫磁珠法分离骨髓CD3(本文来源于《中华微生物学和免疫学杂志》期刊2006年05期）
王锡华[7]（2005）在《空间距离在胸腺基质细胞培训胸腺细胞中的关键作用》一文中研究指出背景及目的:胸腺是培训胸腺细胞发育的首要场所,来源于骨髓的前T细胞进入胸腺环境中,从胸腺被膜下区,经胸腺皮质向皮质皮髓交界区、髓质移动,经一系列复杂的培训过程,包括增殖、受体基因重排、MHC限制的阳性选择、排除自身反应性和缺陷细胞的阴性选择、细胞表面分子和功能上的成熟等,确保了外周成熟T细胞可识别外源性抗原肽和自身MHC复合物(自身MHC限制性),并消除自身反应性T细胞(自身耐受)。这个过程中每一步都是在胸腺的微环境中进行,胸腺微环境主要由胸腺基质细胞和细胞外基质组成,其中胸腺基质细胞是胸腺微环境中最重要的成分。胸腺基质细胞在胸腺中以叁维立体构成网状支架结构,胸腺细胞与基质细胞在不同区域的相互作用对精密有序地完成了阳性选择和阴性选择起重要的作用。胸腺基质细胞在空间、时间上为胸腺细胞的培训提供了最适合的微环境,对胸腺细胞分化以及功能性亚群的形成有决定性的作用。胸腺不仅在建立和塑造有功能的T细胞库中发挥作用,而且对诱导和维持自身耐受和移植耐受起关键作用。经胸腺途径诱导免疫耐受已进行了广泛研究,主要的机理是通过胸腺的选择作用,消除自身、同种、异种供体反应性T细胞,从而达到较稳定的免疫耐受。最近发现在胸腺基质细胞广泛地表达外周组织器官的组织特异性抗原,所以胸腺基质细胞被认为是外周组织器官的自身抗原库的镜子,在自身耐受和维持免疫自身稳定起着关键性作用。异种胸腺移植不仅可以重建有功能的细胞免疫功能,而且可以诱导供者特异性免疫耐受,但其面临的主要问题是宿主T细胞在异种胸腺内成熟后不能产生对宿主抗原足够的自身耐受,而发生了多器官的自身免疫损害,如甲状腺炎、泪腺炎、卵巢炎以及胃炎等,而同系或同种胸腺移植的受者未发生自身免疫综合征。我们以前将同系胸腺与异种胸腺充分混合后再进行移植,既能诱导供体特异性的免疫耐受,又能防止自身免疫损害的发生。然而胸腺细胞在混合胸腺中是如何被训练的并不清楚;也不知道从骨髓来源的前T细胞进入混合胸腺后,是一个克隆的T细胞经历混合胸腺中的一个胸腺培训,还是要经历两个不同胸腺的共同培训?因此我们设计了将不同种类的两种胸腺分别移植在一个机体内的不同部位,并进行T细胞示踪(本文来源于《第叁军医大学》期刊2005-05-01）
陈琳,白慈贤,张锐,李艳华,高艳红[8]（2005）在《人胚胎胸腺基质细胞的体外分离培养与鉴定》一文中研究指出目的:体外分离培养胎儿胸腺基质细胞,即上皮网状细胞,为研究T淋巴细胞的分化增殖及相关药物筛选奠定基础。方法:从水囊引产的胎儿胸腺中分离组织细胞,经筛选培养获得胸腺上皮网状细胞。结果:细胞染色体正常,为46条染色体,包括1对性染色体。倒置显微镜下观察,细胞呈扁平状,多边形,胞体较大,核圆形或椭圆形,核仁明显,胞质内含明显的颗粒和小泡。透射电镜显示细胞间有桥粒相连,并可见张力丝。用免疫组化法检测上皮细胞特异性表达标志(角蛋白)为阳性。结论:本法获得细胞为胸腺网状上皮细胞,为进一步工作打下基础。(本文来源于《军事医学科学院院刊》期刊2005年02期）
余青,张凤蕴,刘倩,钱晓萍,陈慰峰[9]（2003）在《IL-7基因在不同类型的小鼠胸腺基质细胞系的表达》一文中研究指出T细胞在发育过程中要经历胸腺选择过程,关于胸腺选择的机理,Schwartz等提出双信号学说,即除TER-MHC分子相互作用提供第一信号外,胸腺基质细胞(1SC)尚需提供起辅佐作用的第二信号。其中, 白细胞介素7(IL-7)对胸腺内T细胞发育的影响日益受到关注。分泌IL-7的小鼠胸腺基质细胞多为皮质型基质细胞,因此认为阳性选择由皮质型基质细胞介导;国内外未见髓质型上皮细胞克隆分泌IL-7的报道。本文研究了本室建立的9株小鼠胸腺基质细胞(MTSC)系分泌IL-7的能力,首次证实某些髓质型基质细胞可自发分泌IL-7,提示髓质型基质细胞亦可能参与介导阳性选择。(本文来源于《庆祝黑龙江省免疫学会成立十周年（1993—2003）论文集》期刊2003-12-01）
蒋定文,郭明秋,陈立茵,沈先荣[10]（2002）在《胸腺基质细胞促进CD4CD8双阳性胸腺细胞排除或成熟》一文中研究指出胸腺基质细胞 (Ｔｈｙｍｉｃｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ ,ＴＳＣ)是胸腺微环境最重要的组成部分 ,对胸腺细胞的分化发育具有重要作用。ＴＳＣ可促进胸腺细胞的成熟分化 ,减少胸腺细胞凋亡[1] ,也可促进ＣＤ4 + ＣＤ8+ 双阳性 (ＤＰ)胸腺细胞凋亡及克隆(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2002年11期）
胸腺基质细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:胸腺是机体重要的免疫器官,是孵育T淋巴细胞成熟的场所,来自骨髓的淋巴造血祖细胞(lymphohematopoietic progenitor cell,LPC)经过血液循环进入胸腺,与胸腺微环境相互作用并逐步向成熟的T淋巴细胞发育,最终经胸腺移行到外周的免疫器官并发挥免疫调节功能。胸腺在青春期时重量达到最大,随后便开始发生增龄性萎缩,是机体最早发生衰老的器官,胸腺老化主要表现为明显的萎缩,以腺体变小,重量减低,细胞结构破坏和脂肪细胞的积累为特征。胸腺增龄性萎缩会引起免疫系统衰老和应答免疫系统功能低下,进而导致自身免疫性疾病的发生、增加机体罹患癌症及感染性疾病的危险。近些年的研究表明,许多老年人常见的疾病,如糖尿病、心血管疾病等也可能与胸腺功能减退导致的免疫功能下降相关。胸腺基质细胞是胸腺微环境的主要组成部分,包含胸腺上皮细胞(thymus epithelial cell,TEC)、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞(deutrtic cell,DC)等,有研究表明,胸腺内的脂肪细胞主要是由成纤维细胞分化发育而来,然而胸腺内的成纤维细胞向脂肪细胞分化发育的机制却并不清楚。因此研究胸腺脂肪化的分子机制,为进一步探究胸腺的发育和萎缩的分子机制,对提高机体免疫力、延缓免疫系统衰老至关重要。研究方法:1、原代胸腺基质细胞的培养及鉴定:选取出生3天内的小鼠胸腺,利用酶消化方法提取原代的小鼠胸腺基质细胞(thymic stromal cell,TSC),流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测细胞的表型。使用过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激动剂罗格列酮,诱导体外培养的TSCs分化成为脂肪细胞,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理的细胞作为对照,油红O染色检测脂滴的形成情况,Real-time PCR检测成脂相关基因PPARγ、FABP4(fatty acid binding protein 4)的mRNA表达水平。2、TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达lncRNA和mRNA的筛选:DMSO组及罗格列酮诱导组各取叁组样本,采用高通量测序技术(High-throughput Sequencing),以筛选的阈值为qvalue<0.05(若qvalue<0.05筛选差异基因过少则使用pvalue<0.05进行差异筛选)作为筛选TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达的lncRNA和mRNA标准,并对筛选后差异表达的lncRNA和mRNA进行非监督层次聚类分析、GO分析(gene ontology,GO)和KEGG分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes),使用Real-time PCR验证所筛选出的与成脂相关基因的表达变化。3、Notch信号通路在TSCs向脂肪细胞分化过程中的作用:使用Real-time PCR检测在罗格列酮将TSCs诱导分化成为脂肪细胞的过程中Notch信号通路受体(Notch1~4)、配体(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)及下游靶基因(Hes1、Hey1)的表达变化,随后过表达或抑制Notch1,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。4、Notch信号通路与自噬共同调节TSCs的脂肪化:Western blot检测罗格列酮诱导TSCs后0、1、3、5、7天时自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达水平。Western blot检测不同浓度的Notch信号通路抑制剂DAPT(0、1、2、5、10μm)处理TSCs后自噬相关蛋白LC3、p62及自噬相关通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达水平。在罗格列酮诱导TSCs的过程中同时使用Notch信号通路抑制剂DAPT及自噬抑制剂3-MA,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成情况,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。结果:1、原代TSCs的提取与鉴定:提取的原代TSCs大多数呈成纤维细胞样,流式细胞术结果显示约97%的细胞呈CD45~-S100A4~+表型,细胞免疫荧光结果也显示多数的细胞呈S100A4~+表型,说明多数的TSCs为成纤维细胞;2、罗格列酮诱导原代TSCs向脂肪细胞分化:分别用DMSO和10μm罗格列酮对TSCs进行处理,(1)油红O染色结果DMSO对照组中并无脂滴形成,而罗格列酮处理组有大量的脂滴出现;(2)Real-time PCR检测脂肪形成相关基因PPARγ与FABP4的mRNA水平,发现罗格列酮诱导组中,两个基因的表达较对照组明显增高;3、筛选TSCs向脂肪细胞转分化过程中差异表达的lncRNA及mRNA:(1)高通量测序一共筛选出1737个差异表达的mRNA(965个上调和772个下调)、45个差异表达的lncRNA(29个上调和16个下调)和31个差异表达的不确定编码潜能的转录本(transcripts of uncertain coding potential,TUCP)(14个上调和17个下调);(2)利用非监督层次聚类的方法对差异表达基因进行分析,分别使用差异表达的lncRNA、TUCP的靶基因和mRNA产生热图,它们清楚地被分离成Rosi和对照簇,同组样本聚在同一簇中;(3)GO显着性富集分析结果显示筛选得到的差异基因无论是mRNA、lncRNA还是TUCP都主要是在细胞代谢、有机物质代谢、氮化合物代谢等过程中显着富集;(4)筛选得到的差异mRNA在PPARγ、胰岛素、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)及泛素化介导的蛋白水解相关的信号通路发生显着富集,筛选到的差异lncRNA主要在丝裂原活化蛋白激酶(Mtogen-activated protein kinase,MAPK)、泛素化蛋白水解、过氧化物等信号通路发生显着富集,筛选到的差异TUCP在癌症、神经营养因子等信号通路发生显着富集;4、Notch信号通路在TSCs脂肪化中的作用:(1)Real-time PCR检测结果显示在TSCs向脂肪细胞分化过程中Notch信号通路的受体Notch1、配体Jagged1及靶基因Hey1的表达下降,而配体DLL1的表达升高;(2)构建携带Notch1基因的腺病毒,并转入TSCs中,Western Blot结果显示Notch1过表达后,胞浆内Notch1及胞核内Notch1活化片段N1ICD的蛋白水平表达升高,Real-time PCR结果显示Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达升高;(3)对过表达Notch1基因的TSCs进行罗格列酮诱导,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成受到抑制。Real-time PCR检测结果显示成脂相关基因FABP4的mRNA表达水平出现下降;(4)DAPT和si-Notch1作用于TSCs,胞浆内Notch1及胞核中N1ICD的蛋白水平下降,同时Notch信号通路的下游靶基因Hey1的mRNA水平也出现下降;(5)DAPT和si-Notch1抑制Notch信号通路的同时添加罗格列酮诱导TSCs向脂肪细胞分化,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成增多,成脂相关因子PPARγ及FABP4的mRNA表达水平在抑制Notch信号通路后表达出现上升;5:Notch信号通路与自噬共同调节TSCs向脂肪细胞分化:(1)分别在罗格列酮处理TSCs后的第0、1、3、5、7天收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3、Becline1蛋白水平无明显变化,p62的蛋白表达水平降低;(2)用不同浓度的DAPT(0、1、2、5、10μm)对TSCs进行处理,48h后收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3-II/LC3-I随DAPT浓度的增高而呈现逐渐增长的趋势,p62蛋白水平出现了降低,p-AKT/AKT与p-mTOR/mTOR的蛋白表达水平降低;(3)添加自噬的抑制剂3-MA,同时添加或不添加Notch信号通路抑制剂DAPT,油红O染色和AdipoRed染色结果显示使用3-MA抑制自噬后脂肪滴的形成减少,同时还可以部分逆转DAPT导致的脂肪滴形成的增加,在DAPT处理TSCs的同时添加了3-MA,PPARγ及FABP4的表达较单独使用DAPT组下降。结论:1、在罗格列酮诱导的TSCs向脂肪细胞分化过程中有1737个mRNA(965个上调和772个下调)、45个lncRNA(29个上调和16个下调)和31个TUCP(14个上调和17个下调)表达发生明显的改变;2、调节Notch信号通路水平可以影响TSCs向脂肪细胞分化的过程;3、抑制Notch信号通路可通过提高自噬水平来促进TSCs向脂肪细胞的分化。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胸腺基质细胞论文参考文献
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