罗田[1]2003年在《对虾抗病相关基因的克隆、表达及其功能研究》文中指出对虾是重要的水产养殖品种之一，但自九十年代以来在全球范围一直被病害(主要是病毒病)所困扰，到目前为止仍未找到很有效的方法来防治。对虾无特异性免疫系统，它主要依靠其体内的众多免疫因子来抵抗疾病的侵袭。本论文的目的是克隆对虾抗病因子并探讨其功能和作用机理，以期对对虾的病害防治有所帮助。 通过荧光mRNA差异显示技术(DD-PCR)，对正常斑节对虾和抗病斑节对虾进行分析，获得了9个差异cDNA片段。将它们重扩增后标记为探针，与两种虾的RNA进行杂交鉴定，其中有两个呈阳性，显示确有差异。经测序和同源性分析，有一个(命名为DDB，约450bp)被初步证明为与抗病相关的基因片段。 用λZAP Express载体分别构建了正常虾和抗病虾肝胰腺的cDNA表达文库，经鉴定其各项指标(包括滴度、库容量、重组率和插入片段长度等)后表明，这两个文库都是合格的，可用于对虾基因的克隆和研究。 通过从抗病虾文库DNA中直接扩增、筛cDNA库和5’-RACE叁种方法相结合，获得了差异基因DDB的全长cDNA(包括5’和3’-UTR，共约800bp)，并预测了一个ORF(510bp，编码氨基酸170个)。同时发现其ORF和3’-UTR基本保守，而5’-UTR则具有可变性。 将此差异基因的ORF插入原核表达载体pThioHisC中，获得了高效重组融合表达，其表达产物量超过细胞总蛋白的10％。利用Ni亲和层析柱将表达产物进行了纯化，纯化效率达95％以上，再利用分步透析进行了纯化蛋白的成功复性。同时纯化了一个空载pThioHisC表达的对照蛋白。最后通过细胞实验，证实了差异基因的重组表达产物具有抗病毒作用，而又对细胞无毒。 将重组差异蛋白免疫小鼠，制备其抗体。通过蛋白A亲和柱从抗血清中纯化出IgG，再将其偶联至CNBr活化的Sepharose，制备成抗体亲和层析柱。然后通过亲和层析从对虾中分离出了天然差异蛋白，并经Western杂交证实。同时分离出了天然差异蛋白的一种可能的结合因子，证明了这个结合因子是一种凝集素，它与细菌表面成分LPS有很强的结合能力。对这个结合因子进行了串联质谱分析，获得了它的部分氨基酸序列。 利用免疫电镜技术对差异蛋白在对虾体内的分布进行了初步定位。发现它主要分散于细胞质中，但并非结合于某一细胞器上，而核内基本未发现其存在。在WSBV病毒颗粒上未发现其存在，说明此差异蛋白并非与病毒直接结合。 此差异基因是从对虾中获得的第一个具有抗病毒功能的基因。它在对虾体内的表达和调控以及差异蛋白的抗病机制有待继续研究.
逄锦菲[2]2013年在《“黄海2号”中国对虾高通量SNP筛选及其与抗WSSV性状的关联分析》文中进行了进一步梳理中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国重要的经济虾类，WSSV制约我国对虾养殖业的发展。传统对虾选择育种模式与分子标记辅助育种技术相结合有利于中国对虾抗病品种的选育。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNP）被认为是很有应用前景的分子标记技术。本研究在中国对虾转录组454高通量测序的基础上，依据预测的SNP位点设计引物，利用非标记探针HRM（HighResolution Melting）技术，对单核苷酸突变进行验证开发。利用开发的132个SNP标记（实验室前期开发39个+本论文开发93个），对2008-2012年中国对虾抗WSSV性状测试实验中获得的抗性群体和敏感群体进行了遗传多样性分析，并对各位点基因型与抗WSSV性状进行了关联分析，获得了与抗WSSV性状相关的9个SNP标记。使用RT-PCR结合RACE技术对抗WSSV相关SNP位点Contig1401-67TA所在基因——中国对虾醛缩酶基因（aldolase）进行了成功克隆，并获得了该基因cDNA全长序列。具体内容如下：一、中国对虾多态性SNP位点开发中国对虾转录组454高通量测序、contig的拼装和SNP位点的预测由国家人类基因组南方研究中心完成。依据预测的SNP位点，从造成错义突变（mis-sence）的SNP位点中挑选了530个位点，共设计合成引物378组，筛选得到候选SNP位点301个并设计非标记探针，通过非标记探针HRM分型方法，在96尾2012年人工选育的“黄海2号”中国对虾群体中进行检测和验证，结果共有93个SNP位点显示多态性。每个SNP位点的观测等位基因数（Na）均为2个，有效等位基因数（Ne）分布范围1.0105~2.000，观测杂合度（Ho）的分布范围为0.000~0.9792，期望杂合度（He）的范围为0.0104~0.5026，次要等位基因频率（MAF）分布范围0.0052~0.5000。多态信息含量分析显示93个位点的PIC，其平均值为0.2182，低于标准值0.5。Shannon信息指数分布范围为0.0326~0.6931，平均值为0.3330。研究结果表明，通过HRM技术对中国对虾候选SNP位点进行验证开发是一种有效的方法，开发获得中国对虾SNP位点可用于后续实验研究。二、中国对虾抗WSSV相关SNP位点的筛选及关联分析利用132个SNP位点对“黄海2号”中国对虾抗性群体和敏感群体进行HRM基因分型分析，并对基因型分布频率进行卡方检验。结果显示，有9个SNP位点的10个基因型在抗性群体和敏感群体中分布频率差异显着(P﹤0.05)，其中C1401-67TA的A/A型、C7695-204AG的A/G型、C283-145AG的G/G型、C12355-592CT的C/C型在两群体中差异极显着(P﹤0.01)，C6625-56CT的C/T型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C364-89AT的A/A型和C12355-592CT的C/T型差异显着(P﹤0.05)。进一步分析显示，位点C1401-67TA的A/A型、C6625-56CT的C/T型、C364-89AT的A/A型和C12355-592CT的C/T型与抗病正相关，C7695-204AG的A/G型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C283-145AG的G/G型和C12355-592CT的T/T型与抗病负相关。借助NCBI网站BlastX程序对获得的与抗病性状相关的9个Contig进行分析，推测其潜在功能。除了Contig12698，其余8个Contig均匹配到了序列相似度较高的功能基因（E值<10-10），分别是果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fructose-1,6-bisphosphatealdolase），脱氧胞苷酸脱氨酶（deoxycytidylate deaMase），u5小核核糖核蛋白200解旋酶样蛋白（u5small nuclear ribonucleoprotein200kda helicase-like protein），甘氨酸脱羧酶（glycine decarboxylase），多态缩多氨酸（DEAD-box polypeptide39），半胱氨酸天冬酶（effector caspase），肽转运蛋白家族1-like（predicted：peptidetransporter family1-like），40S核糖体蛋白S2（40S ribosomal protein S2）。叁、中国对虾SNP类型特征及分布特点在中国对虾转录组454高通量测序的基础上，依据测序获得的7万余个可能的SNP位点和经过HRM验证获得的多态性SNP位点，分析中国对虾碱基突变的类型及其与周围碱基的相关性。结果表明，C/T突变类型最多，G/C突变类型最少，并且存在“转换偏差”为2.0>0.5；随着突变位点直接相邻位置上A&T碱基个数的增加，该突变位点的转换偏差逐渐降低；突变位点发生突变前后碱基组成存在(G+C)/(A+T)偏差。四、中国对虾抗病相关基因克隆及全长序列分析使用RT-PCR结合RACE技术对抗WSSV相关SNP位点Contig1401-67TA所在基因——中国对虾醛缩酶基因（aldolase）进行了成功克隆，并获得了该基因cDNA全长序列。序列分析结果表明，该cDNA全长2127bp，包含一个1098bp的开放阅读框，编码365个氨基酸。通过对中国对虾醛缩酶基因核苷酸序列和氨基酸序列分析、蛋白质结构和功能的预测与分析，进一步证实了本研究所获得中国对虾醛缩酶基因序列的正确性。经同源比对和进化树分析，中国对虾醛缩酶基因编码的氨基酸与节肢动物的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列相似性达85%以上，确定其是果糖-1,6-二磷酸醛缩酶。基因时空表达分析，感染WSSV后，肝胰腺中醛缩酶的表达量先上升后下降，结果显示中国对虾醛缩酶基因在抗WSSV感染过程中可能具有一定应激功能。
陈丹丹[3]2004年在《日本对虾一个抗病相关基因的克隆表达与功能研究》文中进行了进一步梳理本实验室利用抑制性差减杂交(SSH)的方法,成功地从日本对虾体内克隆到了许多与微生物胁迫反应以及抗病相关的基因,其中许多的基因是首次在对虾体内发现的。为了全面了解对虾的免疫系统,特别是其抗病机制,我们对一些基因进行功能研究。其中的一个基因可能在微生物胁迫以及抗病上都起着重要的作
赵大显[4]2009年在《中华绒螯蟹表达序列标签（EST）分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究》文中研究说明中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国的重要增养殖对象之一。近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的提高,由细菌、病毒和类立克次体生物等引起的各种病害日趋严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的损失。至今,病害仍然是困扰其养殖业的一个重要因素。除改善环境因素外,提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一难题的一个重要方法。本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的免疫防御机制,以其为这一重要方法提供坚实的理论基础。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建和表达序列标签(EST)的分析,不仅丰富了中华绒螯蟹的基因数据,同时筛选出许多与免疫相关的基因序列。在此基础上,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和实时定量PCR技术进一步对主要的免疫相关基因进行了克隆和表达模式分析,这些研究为了解中华绒螯蟹免疫机制提供了基础资料,同时也为蟹病的防治提供了新思路。主要研究结果如下:1采用常规cDNA文库构建技术,成功构建了滴度为4.50×10~6CFU/mL,库容为3.3×10~6CFU/mL,重组率为73%的中华绒螯蟹血细胞cDNA文库;从文库中随机挑取了3,118个克隆进行5'-端单向测序,经去除低质量和污染序列后,共得到3,041条高质量EST序列,这些序列的平均长度为561bp。经拼接后获得了1,049条unique序列,包括292条重迭群(Contig)和757条单一序列(Singleton)。通过比对发现有488条Unique序列被注释成已知的功能基因,551条Unique序列未被注释任何功能;通过Gene Ontology功能分类发现了26个中华绒螯蟹先天性免疫反应,如参与酚氧化酶系统的丝氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,参与凝集反应的谷胱酰胺转移酶,与抗氧化系统相关的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶以及谷胱甘肽过氧化物酶,抗菌肽类的抗脂多糖因子、甲壳素、以及Osmotin,模式识别分子类的C-型凝集素、甘露糖结合蛋白、脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白、Toll受体蛋白。通过EST表达丰度分析发现,中华绒螯蟹血细胞主要免疫相关基因为Kazal-型蛋白酶抑制剂和C-型凝集素。2模式识别蛋白及其功能的研究是当前甲壳动物免疫学的研究重点之一,许多物种的模式识别蛋白及其功能已经明确。本研究根据EST提供的信息,采用RACE技术成功克隆了中华绒螯蟹一种模式识别蛋白-脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因全长cDNA序列。生物信息学分析发现,该序列全长为1,236bp,包括26 bp的5'-末端非转录区(5'-UTR),1,089 bp的开放阅读框(ORF)和121bp的3'-末端非转录区(3'-UTR),共编码362个氨基酸,包含一个由15个氨基酸组成的信号肽;蛋白序列与中国明对虾(Penaeus chinensis)、细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris),凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和淡水螯虾(Pacifaxtacus leniusculus)LGBP的相似性分别为67%、66%、66%、61%;该基因编码蛋白含有几个保守的区域,如整合素结合区,激酶C磷酸化位点,N—连接的糖基化位点等,另外还发现了一个水解酶位点。实时定量PCR结果显示,LGBP基因mRNA在中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、肌肉、血细胞、胃和肠中均有表达,其中在血细胞中的表达量最高。用嗜水气单胞菌进行急性感染实验发现,LGBP在血细胞中的表达量在感染后1.5 h达到最高水平,与对照组相比存在显着性差异(P＜0.05),而后表现为下降趋势,在感染后12 h恢复到起始水平,说明该基因参与了中华绒螯蟹的抗病过程。3酚氧化酶原激活酶(PPAF)的活化以及PPAF活化酚氧化物酶原是酚氧化物酶系统行使非特异性免疫功能的关键步骤。本研究成功克隆了中华绒螯蟹PPAF基因全长cDNA序列。该序列全长为1,386 bp,其中包括154 bp 5'-UTR,1,134bp ORF和95 bp 3'-UTR,编码378个氨基酸。该编码蛋白含有信号区域、半胱氨酸折迭区域和保守的丝氨酸区域。该。PPAF氨基酸序列与其它无脊椎动物PPAF氨基酸序列相比,具有很高的相似性(55%-75%)。PCR结果分析表明肝胰腺、肌肉、肠道、鳃中均有PPAF的表达。嗜水气单胞菌急性感染后6 h、12 h、48 h,与对照组相比PPAF基因mRNA表达水平均显着增加(P＜0.05)。结果表明PPAF与机体对外来病源的防御作用密切相关。4作为抗氧化酶类,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)在清除体内过多的氧自由基、保护细胞免受氧化损伤等方面起非常重要的作用。本研究在EST序列的基础上,通过RACE技术获取了这叁种酶基因全长cDNA序列。其中,SOD基因cDNA全长为1,339 bp,包括20 bp 5'-UTR,867 bp ORF和452 bp 3'-UTR,共编码288个氨基酸,没有信号肽序列,但含有Mn-SOD的标记保守序列(DVWHHAYY),说明该SOD属于Mn-SOD。序列比对发现,中华绒螯蟹Mn-SOD与凡纳滨对虾(L.vannamei)、班节对虾(Penaeus monodon)、蓝蟹(Callinectes sapidus)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)的Mn-SOD相似性分别为90%、89%、87%、84%和81%。SOD基因在各组织均有表达,其中在血细胞中表达量最高,而其他组织中表达量相对比较低,结果提示中华绒螯蟹SOD基因主要在血细胞中表达。以嗜水气单胞菌急性感染中华绒螯蟹,血细胞SOD基因mRNA的表达在感染后1.5 h达到最高,之后开始下降并在12 h达到最低点,12 h后表达量又开始升高,至48 h时表达量同1.5 h的表达量基本相同。但是1.5 h、12 h、48 h感染组的表达量与对照组之间SOD基因mRNA的表达水平不存在显着性差异(P＞0.05)。GPx基因cDNA全长为1,101 bp,其中包括94 bp 5'-UTR,660 bp ORF和347bp 3'-UTR。该ORF编码219个氨基酸,没有信号肽序列。ORF中没有发现编码硒半胱氨酸的序列(TGA),说明该GPx属于不含Se的GPx。该序列含有典型的过氧化物结构域,烷基过氧化还原蛋白(AhpC)结构域,硫氧还蛋白折迭结构域。序列比对发现,该基因氨基酸序列与锯缘青蟹(Scylla serrata)、地中海海绵(Suberites domuncula)和繁茂膜海绵(Hymeniacidon perlevis)GPx氨基酸序列相似性分别为81%、67%和66%。GPx基因mRNA在各组织均有表达,其中在肝胰腺中表达量最高,而血细胞中表达量相对比较低。结果提示中华绒螯蟹的GPx基因主要在肝胰腺中表达。嗜水气单胞菌感染中华绒螯蟹不同时间后,GPx基因mRNA在血细胞中的表达呈现下调作用。在感染后1.5 h,GPx基因mRNA表达量显着性低于对照组(P＜0.05),随着感染时间的延长,感染组GPx基因mRNA表达量虽然有所提高,但仍显着性低于对照组。结果提示,病菌的感染可能抑制了中华绒螯蟹的GPx的表达。GST基因cDNA全长为958 bp,包含85 bp 5'-UTR,651 bp ORF和222 bp3'-UTR。该ORF编码216个氨基酸,其中含有一个由17个氨基酸组成的信号肽。序列比对发现,该蛋白氨基酸序列与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和致倦库纹(Culex quinquefasciatus)GST相似性为53%、与大劣按蚊(Anopheles dirus)和库蠓(Culicoides variipennis)GST相似性为52%、与疟蚊(Anopheles gambiae)GST相似性为51%。该蛋白氨基酸序列含有一个82个氨基酸组成的G-位点和126个氨基酸组成的H-位点,另外也含有一个蛋白酶磷酸化位点和一个N-连接的糖基化位点。相似性和系统发生分析表明该GST属于delta-GST。通过实时定量PCR分析发现,中华绒螯蟹GST在肝胰腺,肌肉和血细胞中均有表达,而在鳃、胃和肠中未检测到其表达。其中在血细胞中的表达量最高,说明血细胞为其主要的合成部位。中华绒螯蟹受嗜水汽单胞菌感染后,GST在血细胞中的表达量在感染后6 h达到最大,且与对照组存在显着性差异(P＜0.05),而后表现为一个下降趋势,在感染12 h后恢复到起始水平。结果表明,GST基因不仅在解毒方面起重要作用,同时还参与中华绒螯蟹的免疫反应。
许建阳[5]2007年在《日本对虾免疫相关基因QM的功能研究》文中研究指明对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是危害养殖对虾的最主要病原,其致病能力强,传播范围广,给世界对虾养殖业造成了巨大的损失,然而至今仍无有效的防治方法。要进行病害的有效防治,必须了解对虾免疫的机理。本论文首先利用WSSV建立对虾病毒基因功能研究的RNAi技术,在此基础上开展对虾QM蛋白在对虾免疫过程中的作用研究,为建立有效的对虾病害防治方法提供科学依据。采用RNAi方法,选择在WSSV的感染中起重要作用的vp28基因(编码WSSV主要的膜蛋白)作为干扰目的基因,在体外合成siRNA后,利用体外注射的方法进行干扰实验。结果发现vp28基因的转录和表达被序列特异的siRNA干扰抑制,此时用竞争性定量PCR检测发现,对vp28进行干扰后,显着降低对虾体内的病毒粒子拷贝数,同时能延缓对虾的死亡。因此,在WSSV中建立了基因功能研究的RNAi方法。在重复注射3次siRNA后,对虾体内WSSV被完全清除,说明RNAi在对虾体内具有抗病毒效果,这为对虾白斑综合症病毒(WSSV)的防治提供一种新的有效方法。通过RACE等得到对虾QM基因(PjQM),序列分析发现,PjQM具备QM蛋白的基本特征和功能结构域。对该基因进行了原核表达,并纯化得到融合蛋白。RT-PCR和Western blot分析发现,PjQM在对虾各组织中均有转录和表达。Real-time PCR分析发现,在受到病毒刺激后PjQM基因表达上调,说明PjQM参与了对虾的免疫过程。通过GST下拉、质谱鉴定等分析发现,PjQM蛋白与血蓝蛋白、肌球蛋白(myosin)之间存在相互作用,进一步的体外和体内试验证明,PjQM与血蓝蛋白之间确实存在互作。蛋白质互作提示,PjQM可能通过酚氧化酶激活系统等途径参与对虾免疫。采用上述在WSSV基因功能研究中建立的RNAi技术,研究PjQM的功能。Northern blot和Western blot结果显示,PjQM基因的转录和表达被PjQM序列特异的siRNA抑制,此时对虾酚氧化酶(PO)活性显着下降。因此,RNAi试验结果表明,QM可调控对虾酚氧化酶(PO)活性。以上研究结果说明,QM蛋白参与抗病毒免疫的可能途径之一是,QM通过与血蓝蛋白的互作,调控PO的活性。这是首次发现QM在动物免疫反应中起作用。
宋光年[6]2010年在《中国明对虾凋亡基因caspase的克隆、表达及功能的初步分析》文中研究表明对虾是最重要的海水养殖产品之一,但是对虾病害在世界范围内的广泛传播,给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993年对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)暴发以来,中国明对虾的养殖一直一蹶不振,白斑病毒已成为危害对虾养殖的最主要病原。因此,解决这一问题的关键是加强对对虾的非特异性免疫系统的研究,从而在此基础上探索对虾病害防治的新途径。本论文根据其他无脊椎动物中caspase基因的保守氨基酸序列设计简并引物,从中国明对虾血细胞cDNA中克隆到了caspase基因片段,命名为FcCasp。FcCasp的cDNA含有954个核苷酸,编码317个氨基酸, FcCasp蛋白的预测分子量为35592.8 Da,理论等电点为5.37。通过功能域分析发现FcCasp推导的氨基酸序列中含有一个caspase家族典型的QACRG五肽保守序列(定位在190-194位氨基酸)。P20大亚基定位在67-196位氨基酸,P10小亚基定位在218-317位氨基酸。分析了FcCasp在血细胞、淋巴器官、肠和肝胰脏等7个组织中的表达水平。组织表达结果表明FcCasp在血细胞、肝胰脏和淋巴器官中表达水平明显高于其他组织,而淋巴器官和血细胞是对虾免疫系统中最重要的两个组织,由此可以推测中国明对虾中的FcCasp可能与免疫关系密切。本论文还利用实时荧光定量PCR技术,对WSSV病毒刺激后,对虾肝胰脏中FcCasp基因的转录水平进行了研究。用WSSV病毒刺激后,在不同时间提取对虾肝胰腺总RNA,进行Real-time PCR分析,结果发现FcCasp基因在病毒刺激后有上调表达,这说明FcCasp对WSSV病毒刺激产生了应答,提示FcCasp基因可能参与中国明对虾的先天免疫防御,并与细胞凋亡相关。为了进一步了解FcCasp在细胞凋亡中的作用,采用RNAi技术抑制FcCasp基因的表达。结果表明,当FcCasp基因的转录表达受到抑制时,对虾的血细胞凋亡也受到抑制,这说明FcCasp基因直接参与细胞凋亡。
李旭鹏[7]2014年在《中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗白斑综合征病毒（WSSV）候选基因分析》文中进行了进一步梳理中国对虾是我国主要的经济水产养殖品种，二十世纪九十年代白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）暴发以来其产业受到严重影响。近年来随着种苗和养殖水平整体的提高，我国对虾养殖业逐年发展。但时至今日，WSSV依旧是影响对虾养殖业的主要病原之一。从根本上解决对虾养殖业中WSSV等问题的关键是选育出抗病能力强和生长速度快等优良性状兼顾的中国对虾新品种。对于阈性状和低遗传力性状，将传统选育手段和先进的分子生物学技术相结合，能提高选择准确性，加快育种进程。本研究以中国对虾“黄海2号”454转录组测序数据为基础，以RACE、基因克隆、常规测序、HRM、ELISA、real-timePCR等常规生物学技术为平台，进行中国对虾抗WSSV性状候选基因和SNP分析，为中国对虾抗WSSV育种提供理论依据和实践材料。主要研究包括首次获得中国对虾MEK、ERK、Ras和组织蛋白酶B基因序列；开发、分析各基因内SNP位点；进行正常中国对虾和感染WSSV的中国对虾不同组织内各基因表达水平分析；感染中国对虾WSSV复制特点以及抑制中国对虾MEK/ERK信号转导通路对WSSV复制水平影响；挑选454转录组测序中的候选SNP位点；利用HRM技术在抗病组和敏感组内进行基因分型，统计遗传多态性信息和进行抗病关联分析等。具体内容包括：1、报道了中国对虾MEK（FcMEK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KJ135020）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcMEK mRNA在肝胰腺中6h和48h呈现上调表达，12h和24h转录水平下降。FcMEK mRNA在鳃中12h、24h和48h转录水平上升，6h转录水平下降。FcMEK mRNA在肌肉中6h、12h、24h和48h转录水平上升。结果提示FcMEK表达受WSSV感染影响。通过常规测序技术在FcMEK mRNAORF内发现叁个SNP位点，分别位于ORF的第762bp、765bp和972bp处。叁个SNP突变位点都是C/T转换，分别命名为C-762T、C-765T和C-972T。结果表明C-762T和C-765T位点位于同一个单倍型。利用HRM技术进一步对中国对虾抗病组和敏感组内上述叁个SNP位点进行基因分型，C-762T和C-765T突变位点得到可读峰图，提示附近没有内含子存在。抗病组内C-762T和C-765T突变位点Ho为0.604，He为0.424，MAF为0.302。敏感组内C-762T和C-765T突变位点Ho为0.583，He为0.424，MAF为0.302。C-762T和C-765T突变位点在两组内都偏离HWE，但进一步的抗病组和敏感组卡方检验结果表明，两个组间的基因型分布没有显着差异。偏离HWE提示在整个中国对虾“黄海2号”选育群体中该位点有可能受到了选择。2、报道了中国对虾ERK（FcERK）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KC537791）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcERK mRNA在肝胰腺中6h、12h、24h和48h转录水平下降。FcERKmRNA在鳃中6h、12h和24h转录水平上升，48h转录水平下降。FcERK mRNA在肌肉中48h转录水平上升，6至24h呈现小幅波动变化趋势。肝胰腺中FcERK蛋白从3h到24h呈现缓慢升高趋势，至48h下降。3h、12h和48h鳃中FcERK蛋白水平上升，在6h和24h下降。12h和48h肌肉中FcERK蛋白水平上升，3h、6h和24h下降。感染WSSV后FcERK表达水平的变化提示其受到WSSV感染过程影响。在FcERK mRNAORF内发现一个SNP位点，在3’UTR内发现一个SNP位点，都是C/T转换，分别命名为C-544T、C-1133。利用HRM技术对中国对虾抗病组和敏感组内上述两个SNP位点进行基因分型，抗病组内C-544T突变位点Ho为0.146，He为0.154，MAF为0.083。敏感组内C-544T突变位点Ho为0.208，He为0.204，MAF为0.115。抗病组内C-1133T突变位点Ho为0.177，He为0.162，MAF为0.089。敏感组内C-1133T突变位点Ho为0.156，He为0.145，MAF为0.078。两个SNP位点在两组内都符合HWE，且两组间基因型分布没有显着差异，虽然本研究结果提示FcERK可能参与中国对虾抗WSSV过程，但基因内两个突变位点并没有影响FcERK在抗WSSV过程中的作用。上述两个SNP位点的MAF都远大于0.05，适合进行关联分析，作为信号转导通路中的重要激酶，FcERK内SNP位点值得深入研究。3、本研究发现感染WSSV后死亡的中国对虾，后期死亡个体病毒含量高于早期死亡个体，提示对虾抗WSSV性能从一方面体现在耐受病毒数量上，因此以育种目的来讲，除了能耐受更多病毒的感染，抑制病毒复制速度，甚至是杀灭病毒的能力，是对虾能最终存活下来的关键，另外研发新药物来抑制宿主体内病毒复制能力也能提高染病对虾存活率。利用MEK的特异抑制剂U0126抑制中国对虾MEK/ERK通路活性后，检测感染宿主的WSSV复制水平。与对照组相比，添加U0126的实验组中WSSV复制水平受到抑制，24h实验组WSSV复制水平约为对照组的五分之二；48h实验组WSSV复制水平约为对照组的五分之叁。综合本研究中对于FcMEK和FcERK基因在感染WSSV的中国对虾不同组织内表达变化的研究结果，提示WSSV在感染中国对虾时需挟持宿主MEK/ERK通路用于其自身复制。4、报道了中国对虾Ras基因（FcRas）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号KC522602）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcRas mRNA在肝胰腺中6h和48h转录水平上升，12h和24h转录水平下降。FcRas mRNA在鳃和肌肉组织中6h、12h、24h和48h都呈上调表达。感染WSSV后转录水平的明显变化提示FcRas受到WSSV感染的影响。对26只中国对虾FcRas mRNA测序结果中未发现SNP位点，是本文所研究的五个基因中唯一一个没有发现SNP位点的基因，从一个方面也提示Ras基因高度保守性的特点。5、报道了中国对虾组织蛋白酶B（FcCathepsin B）mRNA序列（序列上传至GenBank，登录号为KC537790）并发现该基因表达受WSSV感染的影响。感染WSSV的中国对虾，FcCathepsin B mRNA在肝胰腺中6h和48h转录水平上升，12h和24h转录水平下降。FcCathepsin B mRNA在鳃中6h、12h和24h转录水平上升，48h转录水平下降。FcCathepsin B mRNA在肌肉中6h、12h和48h转录水平上升，24h略微下降。感染WSSV后转录水平的明显变化提示其受到WSSV感染过程影响。在FcCathepsin B ORF内发现叁个SNP，分别位于ORF第42bp、756bp和984bp，叁个SNP位点都是C/T转换，并命名为C-42T、C-756T和C-984T。结果表明该叁个SNP位于同一个单倍型。利用HRM技术进一步对抗病组和敏感组进行SNP基因分型，C-984T突变位点处有可读峰图，提示其周围没有内含子存在。抗病组中C-984T突变位点的Ho为0.375，He为0.344，MAF为0.219。敏感组中C-984T突变位点的Ho为0.417，He为0.355，MAF为0.229。该SNP位点在两组内都符合HWE，且基因型分布没有显着差异，说明该SNP位点并没有影响基因在抗WSSV过程中的作用。上述SNP的MAF远大于0.05，适合进行关联分析。6、利用HRM技术对中国对虾“黄海2号”454转录组测序中的候选SNP位点进行验证和分析，81个SNP位点得以确认，且发现1个抗病相关位点。本研究挑选480个候选SNP位点，设计相应HRM引物480对，经验证其中合格引物243对。设计相应非标计探针，通过HRM实验对中国对虾抗病组和敏感组进行基因分型，共有81个位点确认为SNP，并统计Ho、He、Ne、MAF、I、HWE信息。81个SNP位点在抗病组中有55个位点MAF大于0.05，在敏感组中有56个位点MAF大于0.05，这些SNP位点的多态性较高，适合进行关联分析。81个SNP位点在抗病组中有65个符合HWE，敏感组中有60个符合HWE。在81个SNP位点中，A/C突变4个，A/G突变27个，A/T突变11个，C/G突变9个，C/T突变28个，T/G突变2个，转换/颠换=2.115，符合“transition bias”原理。通过关联分析发现312C1298-154C/T突变位点的C/C基因型在2011年和2012年抗病组和敏感组中都差异分布，提示该位点与抗WSSV性状相关。通过基因克隆技术获得该抗病相关SNP位点所在基因，为磷酸丙酮酸水合酶，命名为FcPH（序列上传至GenBank，登录号KJ649284）。FcPH mRNA ORF长1305bp，编码434氨基酸。利用real-time PCR检测该基因表达水平在感染WSSV的中国对虾鳃和肌肉中都有明显升高。结果提示磷酸丙酮酸水合酶受到WSSV感染过程影响，该基因内所发现的SNP位点与抗WSSV性状相关。
刘文静[8]2012年在《斑节对虾TLR22及Relish基因的克隆与表达分析》文中认为斑节对虾(Penaeus monodon)是我国重要的海水养殖经济品种。近年来，疾病爆发、种质资源退化和养殖环境污染导致对虾在养殖过程中出现高死亡率，造成了巨大经济损失，成为制约对虾养殖业可持续健康发展的瓶颈之一。因此，从斑节对虾免疫系统入手，发掘和分析免疫相关的基因，研究其免疫调控规律，探讨其抗病机理，提高虾体抗病能力，并为进一步筛选抗病基因，从基因水平进行品种改良提供理论依据。本研究克隆了免疫信号通路的关键因子—TLR22基因和Relish基因，并探索其表达调控机制。同时，本实验还对Relish基因在斑节对虾发育过程中的作用进行了初步研究。TLR22是Toll样受体家族中重要的一员。Toll样受体的发现是20世纪以来宿主天然免疫系统的最大进展。Toll属于模式识别受体(PRR)，通过胞外区的LRR结构域特异性识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)，启动细胞内信号转导通路，诱导干扰素、炎症因子等抗炎症因子表达。获得斑节对虾TLR22(以下简称PmTLR22)基因为3680bp，包含3045bp的ORF，可编码1014个氨基酸。PmTLR22蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。其胞外区含有12个亮氨酸重复(LRRs)，胞内具有相对保守的Toll/白介素1受体结构域（Toll/IL-1R, TIR）。PmTLR22胞外的LRRs在第4个亮氨酸残基（L）高度保守。TLR22在进化上更趋于TLR3。实时定量荧光PCR显示在所检测的11种组织中，PmTLR22的mRNA在肝胰腺的表达最高，其次为肠、胃。使用定量PCR检测肝胰腺PmTLR22在不同免疫刺激条件下的mRNA表达情况，结果显示肝胰腺TLR22可被白斑综合征病毒（WSSV）和创伤弧菌诱导表达，而金黄色葡萄球菌不能诱导该基因表达。其中WSSV感染24h，PmTLR22显着上调表达23倍，创伤弧菌感染后6h和9h显着上调PmTLR22表达。进一步，证明了病毒核酸类似物Poly（I:C）及R484均可激活PmTLR22的表达，说明病毒PAMP对PmTLR22具有诱导表达作用，PmTLR22可能是识别PAMP的模式识别分子。获得PmTLR22胞外段的重组融合蛋白，其大小约为58kDa，为进一步研究其功能提供基础。Relish是NF-κB家族成员之一。Rel/NF-κB是大部分信号转导的中枢，调控机体的先天性免疫应答、炎症反应、细胞增殖和分化、细胞凋亡等重要的病理和生理过程。本研究在构建的斑节对虾肝胰腺cDNA文库中克隆得到NF-κB的家族成员之一Relish，命名PmRelish，其全长5112bp，包括3561bp的ORF，推测编码一个含1186个氨基酸的蛋白。PmRelish的蛋白具有Rel/NF-κB蛋白家族的典型结构特征，包括N端的RHD结构域，核定位信号，C端的6个锚蛋白重复序列以及死亡结构域，表明该蛋白是NF-κB1亚型。同源性分析显示斑节对虾PmRelish与凡纳滨对虾LvRelish及短小亚型LvRelish-S的RHD结构域序列完全一致，进化上也与之关系最近。该基因在所检测组织中组成型表达，并在血细胞表达量最高。使用定量PCR检测肝胰腺PmRelish在不同免疫刺激条件下的mRNA表达情况，结果显示肝胰腺Relish基因是诱导型表达，并被创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和WSSV调控表达，其中被创伤弧菌上调表达最显着。进一步，证明了病毒核酸类似物Poly（I:C）及R484可激活PmRelish的表达。上述研究说明Relish是斑节对虾的重要免疫因子，可能通过直接或间接作用参与对细菌和病毒的免疫反应。此外，研究了PmRelish在斑节对虾的发育过程中的表达情况。结果显示PmRelish表达在幼体发育四个时期都存在显着性差异，其中糠虾阶段表达量最高；PmRelish在不同发育阶段的精巢和卵巢中的表达特征相似，即未成熟期的表达相对较低，其中PmRelish在10-12cm体长雄虾精巢中表达量最高，卵巢中的表达则在成熟期（V期）最高，为卵原细胞期的14.3倍。这说明PmRelish在斑节对虾的发育过程中也可能起着重要作用。
王慧芬[9]2008年在《日本对虾免疫相关基因的克隆及功能的初步研究》文中研究表明对虾白斑综合症病毒(WSSV)是危害养殖对虾的主要病原,也是制约对虾养殖业发展的最重要因素。要寻找抵御该病原的有效方法,最基本的入手点之一就是充分了解作为病原宿主的对虾的免疫机制,通过提高其自身的抗病毒能力,来达到从根本上防治WSSV的目的。因此本论文以具有重要经济价值的日本对虾(Marsupenaeus japonicus)为对象,首先构建了用于探寻蛋白质相互作用及调控机制网络的酵母双杂交文库,这一平台为后续研究蛋白质在日本对虾抗病毒免疫中的作用奠定了基础。而后,本论文又对几个与日本对虾天然免疫密切相关的基因展开初步的研究,为建立有效的对虾病害防治方法提供科学依据和思路。本论文以日本对虾血细胞和肝胰腺组织混合mRNA为模版,利用SMART技术和酵母体内同源重组的方法构建酵母双杂交文库,并以日本对虾翻译调控肿瘤蛋白TCTP为诱饵蛋白对文库进行初步筛选。文库dsDNA条带最大可达5kb。文库转化效率为4.8×105转化子/ug pGADT7-Rec,文库容量为1.4×106克隆子/ml,重组率大于90%。初筛结果验证了我们所构建的日本对虾酵母双杂交文库有效、可靠。本论文通过巢式PCR及RACE等方法获得了日本对虾的两种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因——ERK1/2和p38。根据人们在其它物种中的研究报道,这是两种在各项细胞活动包括抗病毒免疫中具有极为重要地位的基因。通过对两种基因的序列分析发现,日本对虾的ERK1/2和p38具备与其他物种中的这两种基因同样的基本特征和功能结构域。而且通过Western blot检测后发现,日本对虾的ERK1/2蛋白在WSSV病毒感染后磷酸化水平即活性上调,且该现象发生在病毒感染早期,说明在日本对虾中,ERK1/2信号转导通路可以被WSSV所激活,且可能是被病毒进入宿主细胞这一过程所诱导。然而,在本研究中,我们还发现日本对虾的ERK1/2和p38蛋白与其他物种之间的不同之处。首先,日本对虾的ERK1/2蛋白在Western blot检测时只显示出一种分子量大小的条带,说明日本对虾的ERK1/2蛋白可能不具有如高等动物中的分化。此外,我们克隆到的日本对虾p38基因编码的蛋白质同其他物种进行比较在C端缺少了近100个氨基酸,但是该现象是否真实,它发生的具体原因还需要进一步的实验确认。本论文中还报道了日本对虾中一个与WSSV感染相关的基因——centaurin-α1。由于在早期实验中,我们已经获得了该基因的部分序列,因此,我们首先通过Real time PCR检测了该基因与WSSV感染的关系。结果显示,该基因转录水平的表达量随着病毒感染时间延长,病毒量增加可以显着升高,而且这种现象是在病毒感染早期到中期时出现的,说明该基因可以被WSSV感染所诱导,且在病毒感染过程的早中期参与细胞活动。然而,有趣的是,该基因的转录水平表达量在抗病虾中相比于普通虾却是明显下调的,在后者中,centaurin-α1基因的转录量约为前者的3.6倍。这样的结果说明,centaurin-α1基因及其编码的蛋白质在日本对虾的天然免疫中的作用可能是双向的,即可能既可抗病毒又可被病毒利用从而协助病毒增殖。因此,我们又进一步通过半巢式PCR获取了日本对虾centaurin-α1基因的全长序列,分析表明它与其他物种中的centaurin-α1一样具有保守的结构域,进而可以推测它可能具有的功能。此外,我们还通过RT-PCR和免疫荧光对日本对虾的centaurin-α1进行了组织和细胞的定位。这些研究结果为日后深入研究该基因的功能奠定了基础。
刘媛[10]2012年在《叁疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究》文中认为叁疣梭子蟹是我国重要的海水养殖品种,但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高,由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重,给叁疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展叁疣梭子蟹免疫防御机制相关研究,探索免疫防治新途径,是实现其健康养殖的可靠保障。本研究构建叁疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,利用表达序列标签技术(EST),对叁疣梭子蟹表达序列进行大规模测序分析,从中鉴定免疫相关基因,并利用cDNA末端快速扩增(RACE)、实时定量PCR、基因原核重组表达等技术系统研究叁疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型,确定抗脂多糖因子cDNA和基因组序列结构,分析其前体mRNA剪接方式,探讨它们在叁疣梭子蟹免疫防御中的作用。本研究成功构建叁疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,库容分别是8.0×105和5.6×105克隆。从血细胞文库中随机测序获得4452条高质量的EST序列,经拼接得到1066条Unigenes,包括461条Contigs和605条Singletons。从眼柄文库中随机测序获得4606条高质量的EST序列,可拼接为510条Unigenes,包括301条Contigs和209条Singletons。通过BLAST比对发现,血细胞文库中660条Unigenes、眼柄文库中365条Unigenes与Genbank数据库中的基因有较高同源性。进一步分析发现,血细胞文库中64条Unigenes、眼柄文库中35条Unigenes与免疫相关。这些基因可分为6类,分别是抗菌肽、氧化还原蛋白、黑化反应相关蛋白、分子伴侣蛋白、凝集因子和其它类别。其中,有5种免疫相关基因都存在多种相应的蛋白亚型,即抗脂多糖因子(PtALF1-7)、Crustin(PtCrustin1-3)、硫氧还蛋白(PtTrx1-2)、带有clip结构域的丝氨酸蛋白酶(PtcSP1-5)和Kazal型蛋白酶抑制剂(PtKPI1-4)。EST序列的获得和免疫基因的富集,丰富了叁疣梭子蟹的基因组信息,为进一步克隆和研究叁疣梭子蟹免疫防御功能基因奠定基础。本研究在EST分析基础上,克隆得到叁疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型PtALF1-7。它们的开放读码框编码的蛋白均含有一段信号肽、两个保守的半胱氨酸残基,与相近物种的ALF均具有较高同源性。与大多数报道的ALF晶体结构类似,PtALF2、PtALF3、PtALF5和PtALF7预测的空间结构由4个β折叠片和3个α螺旋组成,而PtALF1蛋白的空间结构中仅包含1个α螺旋,PtALF4蛋白的空间结构中含有5个β折叠片。序列分析表明PtALF1-3是由同一个基因组位点编码,经mRNA前体可变剪接产生。PtALF4-7分别由不同的基因组位点编码。在PtALF4、PtALF5和PtALF7基因的内含子区域均发现串联重复序列。通过直接测序,在PtALF1-3和PtALF7基因组序列中分别发现89个和128个SNP位点。PtALF1-7基因在健康叁疣梭子蟹各个检测组织中均有表达,但是呈不同的表达模式。在叁疣梭子蟹受到溶藻弧菌刺激后,PtALF1-7基因的表达量随时间变化明显,提示PtALFs是清除入侵病原菌的快速应答因子和持续效应因子。叁疣梭子蟹抗脂多糖因子在大肠杆菌中表达情况并不理想,重组的PtALF5经抑菌试验证明没有活性,PtALF3和PtALF7在加入IPTG的诱导初期对大肠杆菌具有强烈的抑制作用。以上研究结果揭示叁疣梭子蟹抗脂多糖因子及其亚型的分子基础、组织分布特点及对微生物的响应机制,为全面理解抗脂多糖因子及其亚型的结构和功能奠定了良好基础。
参考文献：
[1]. 对虾抗病相关基因的克隆、表达及其功能研究[D]. 罗田. 厦门大学. 2003
[2]. “黄海2号”中国对虾高通量SNP筛选及其与抗WSSV性状的关联分析[D]. 逄锦菲. 上海海洋大学. 2013
[3]. 日本对虾一个抗病相关基因的克隆表达与功能研究[C]. 陈丹丹. 第四届世界华人虾类养殖研讨会论文摘要汇编. 2004
[4]. 中华绒螯蟹表达序列标签（EST）分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究[D]. 赵大显. 华东师范大学. 2009
[5]. 日本对虾免疫相关基因QM的功能研究[D]. 许建阳. 厦门大学. 2007
[6]. 中国明对虾凋亡基因caspase的克隆、表达及功能的初步分析[D]. 宋光年. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2010
[7]. 中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗白斑综合征病毒（WSSV）候选基因分析[D]. 李旭鹏. 中国海洋大学. 2014
[8]. 斑节对虾TLR22及Relish基因的克隆与表达分析[D]. 刘文静. 上海海洋大学. 2012
[9]. 日本对虾免疫相关基因的克隆及功能的初步研究[D]. 王慧芬. 国家海洋局第叁海洋研究所. 2008
[10]. 叁疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究[D]. 刘媛. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2012
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