陆晔[1]2004年在《实验小鼠精子低温保存及体外受精的研究》文中提出小鼠精子的低温保存为保存繁育不良的疾病模型小鼠和采用基因工程手段所获得的大量小鼠品系提供了一种比较安全、经济的资源保存方法。但由于小鼠低温生物学的某些限制，小鼠精子的低温保存仍存在较大的困难，本研究进行多品系小鼠精子冷冻的实验，并以复苏后体外受精率作为冷冻成败的标准，探讨小鼠精于冷冻的影响因素，总结供精小鼠的选择原则，摸索冻融小鼠精子成功体外受精的方法，在此基础上运用成功冷冻的小鼠精于进行胚胎工程实践：将冻融精子体外受精获得的胚胎直接移植、胚胎冷冻复苏后再移植，均获得存活的新生个体；我们还将精子冷冻技术用于昆明小鼠标准化育种研究，避免了活动物运输带来的麻烦，节省了检验检疫费用，并加快了研究进程。 一、小鼠精于冷冻的影响因素研究 1、遗传背景对小鼠精子冷冻的影响 采用小鼠精于冷冻、冻融精子体外受精的方法，初步探究小鼠精于冷冻的影响因素，摸索合适的受精浓度，观察冷冻保护剂对IVF的影响，本实验选用同一年龄(15周龄)五种不同品系小鼠分别进行精子冷冻、复苏，比较各品系冷冻效果(冻融后精子活力)及冻融精子的体外受精(IVF)率，并用新鲜精子IVF作为对照，以体外受精结果作为判断精于冷冻效果的最终标准。 2、年龄对小鼠精于冷冻的影响 对不同周龄昆明(KM)小鼠进行精于冷冻，研究小鼠精子冷冻的影响因素，并将同一年龄小鼠分为冷冻前近期交配过和长期未交配两组，以研究雄鼠的生理周期和状态对精子冷冻的影响，探讨精子冷冻前供体的选择标准。为精子冷冻在小鼠胚胎工程中的应用打下基础。 综合本研究结果：冷冻后各品系小鼠精子复苏后活力约在15％～50％之间；冻融小鼠精于体外受精结果随遗传背景的不同差异显着，受精率分别为：KM小鼠68.4％、ICR小鼠30.3％、DBA／2J小鼠47.2％、C57BL／6J小鼠6.8％、BALB／cA小鼠25％。冻融精子IVF得到的胚胎可以耐受体外培养。10周龄KM小鼠精子不能成功冷冻或者冷冻效果较差复苏率(0～20％)，15、20周龄KM小鼠均可成功冷冻复苏率(30％～40％)，用于冷冻的小鼠周龄影响冷冻效果及受精率。 二、小鼠冻融精子与新鲜精子体外受精的比较 冻融过程造成部分小鼠精子结构破坏和功能障碍，能够使卵受精的精子也发生实验小鼠精子低温保存及体外受精的研究中文摘要了某些变化，使冻融精子体外受精(IVF)与新鲜精子有所不同。本实验用冷冻复苏后的精子分别与颗粒细胞卵母细胞复合体，及用透明质酸酶去除颗粒细胞的裸卵IVF观察受精率的异同;精子复苏并预培养lh，体外分别受精3h、4h、sh、6h后洗卵比较受精率;精子复苏后分别预培养0.5h、lh、1.5h、Zh后与卵细胞作用6h洗卵，观察受精率，所有实验均用新鲜精子进行对照。 通过研究，发现去除颗粒细胞后体外受精率下降，且精子活力愈低下降程度越大;冷冻复苏过程使部分精子获能，不需长时间预培养即可使卵细胞受精，相反新鲜精子预培养时间低至半小时受精率大大降低，预培养1一1.5h使精子获能对新鲜精子的体外受精是必需的;精卵接触后冻融精子使卵受精速度较新鲜精子快。本实验探讨了冻融精子IVF条件对受精率的影响，通过体外受精的变化分析冻融后精子发生的变化，从而总结了提高冻融精子受精率，和利用效率的实验方法。叁、利用小鼠冻融精子进行胚胎工程实践 将昆明(KM)小鼠精子进行冷冻，复苏后体外受精(I VF)，IVF获得的2细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植，并用新鲜精子IVF作为对照。结果显示，精子冷冻并不影响IVF获得胚胎的移植产仔率(5 1 .8%一54忍%)，体外培养效果(发育至囊胚比例为57.4%)、胚胎冷冻复苏率(82.8%)及冷冻胚胎复苏后的移植产仔率(53.3%)，与新鲜精子体外受精得到的胚胎差异不显着。四、应用精子冷冻技术进行昆明小鼠育种的研究 昆明(KM)小鼠标准化研究中，采集武汉生物制品研究所、上海第一生化制药厂普通级KM小鼠的精子冷冻并运输，冻融精子与中科院上海实验动物中心KM雌鼠超排的卵进行体外受精，得到杂交1代2细胞胚胎，用中科院动物中心KM鼠冻融精子对照。无菌条件将2细胞胚胎移植入SPF级假孕鼠，受体饲养于独立通气笼具(IVC)中。 本实验胚胎移植后，平均产仔率为51.9%，离乳率为100%。叁种群12周龄KM雄鼠精子冷冻复苏率，IVF率，移植产仔率均无显着差异(P>0.05)。仔鼠经微生物、寄生虫检测达sPF标准。结果表明，利用冷冻精子，通过IvF、胚胎移植能够方便快速的建立种群间杂交1代，并实现生物净化。
桑国俊[2]2008年在《牛卵母细胞及体外胚培养技术研究》文中研究表明牛胚胎体外生产技术包括卵母细胞体外成熟、体外受精、体外培养及冷冻保存等环节。本试验对牛卵母细胞及体外胚培养技术进行了研究,比较系统地掌握了牛卵母细胞的操作技术,为该技术的深入研究和应用铺垫了良好基础。1、卵母细胞体外成熟技术(1)COCs级别对卵母细胞成熟的影响。选择A、B、C和D级COCs进行成熟培养。A级成熟率为63.81%,B级为47.81%,C级为2.01%,D级为0.00%,各级成熟率之间差异显着(p<0.01),A、B级远高于C、D级。C级仅有个别发育成熟,D级未见成熟。因此,A、B级COCs是卵母细胞体外培养的主要资源,宜选择A、B级COCs进行成熟培养。(2)卵泡直径对卵母细胞成熟的影响。将卵泡分为3级:大卵泡(φ>8mm)、中卵泡(2mm≤φ≤8mm)和小卵泡(φ<2mm)。COCs成熟率分别为大卵泡组17.07%、中卵泡组61.82%、小卵泡组19.06%,中卵泡组显着高于大卵泡组和小卵泡组(p<0.01),大卵泡组和小卵泡组差异不显着(p>0.05)。卵母细胞的成熟率与采集COCs时的卵泡直径关系密切,在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵巢发育正常的卵泡采集,不宜选择发育过大或过小的边际卵泡。2、牛卵母细胞体外受精技术(1)直接离心法对获能效果和卵母细胞受精率的影响。①二次离心沉淀液:对第一次离心的沉淀定容后继续离心后获得的沉淀进行活力、获能效果和受精率测定。洗涤精子最终活力为0.44;获能效果以10min时最高,为0.41,15min时为0.32,超活化以15min时最好;受精率为40.19%。②二次离心上清液:对第一次离心的上清液定容后继续离心后获得的沉淀进行测定。洗涤精子最终活力为0.56;获能效果以10min时最高,为0.59,15min时较低,为0.585,超活化也以15min时最好;受精率为43.21%。二次离心上清液的各项指标显着高于沉淀液(p<0.01)。从试验结果看,宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法,避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路,而直接对上清液进行离心处理,获得了理想的精子洗涤和获能效果。(2)不同温度对精子获能和卵母细胞受精的影响。将精子分别在20～24℃室温和38.5℃恒温(CO2培养箱)上浮60min、获能10～20min。①室温上浮法:超净工作台上浮60min,精子活力以45min时最高,达到0.68;对上浮45min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.40%。②恒温上浮法:CO2培养箱上浮60min,精子活力30min时最高,达到0.697;对上浮30min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.51%。精子获能后的超活化现象与室温法一致。二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显着(p>0.05),恒温上浮法的效果略高于室温组。从可控角度考虑,还以恒温上浮法为宜。(3)精子浓度与受精的关系。使用不同浓度(低1.0×106、中1.5×106和高3.0×106个/ml)精子与卵子共同孵育。中浓度组平均受精率为47.34%,显着高于低浓度组的42.38%(p<0.05)和高浓度组的33.96%(p<0.01);低浓度组的平均受精率显着高于高浓度组平均受精率(p<0.01)。本试验表明精子适宜浓度宜控制在(1.0～1.5)×106个/ml。3、牛体外受精胚胎培养技术(1)卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响。卵丘细胞组、卵丘细胞+bFF组和对照组的桑椹胚率分别为29.07%、34.99%和26.67%;囊胚率分别为8.51%、10.63%和7.24%。卵丘细胞+bFF组的桑囊率显着高于卵丘细胞组和对照组(p<0.01)。本试验通过添加卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养物质,较好地克服了2C发育阻滞。(2)培养液体积对胚胎发育的影响。分别用50μl和500μl培养液培养胚胎。50μl液滴的桑椹胚率为33.14%,囊胚率为9.07%,500μl液滴依次为36.23%和10.23%。大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高(p<0.01)。本项试验中500μl的效果好于50μl。4、卵母细胞冷冻保存技术及解冻培养(1)程序化一步法冷冻时10%GL和10%EG对COCs冷冻效果的影响。COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养。EG组成熟率为34.46%,桑椹胚率为11.18%,囊胚率为4.18%;GL依次为33.44%、10.56%和3.86%。EG组的成熟率比GL组高3.05%(p>0.05),桑椹胚率高5.87%(p>0.05),囊胚率高8.29%(p>0.05)。冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存,但EG的效果比较好。(2)玻璃化冷冻时麦管和OPS管对COCs冷冻效果的影响。以麦管和OPS管作为冷冻载体,二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养,麦管法成熟率为29.84%,桑椹胚率为9.34%,囊胚率为3.47%;OPS法依次为31.89%、9.66%和3.80%。OPS法的成熟率比麦管法高6.87%(p>0.05),桑椹胚率高3.43%(p>0.05),囊胚率高9.51%(p>0.05)。OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法,但无统计差异,而麦管法宜于操作和储存,宜在实际操作中选用麦管法。(3)COCs冷冻方法的比较。COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致,整体效果的优势序列为EG法>GL法>OPS管法>麦管法。玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂,建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法。5、小结通过牛卵母细胞体外培养技术试验的实施,比较系统地掌握了牛卵母细胞成熟培养、精子获能、体外受精和体外培养的技术环节和操作程序,利用共培养系统突破了2C发育阻滞,在精子获能方面建立了新的洗涤和获能方法。本研究的技术指标在同类研究中属于较高水平,在将后研究中将进一步探索和提高。
牛芳[3]2010年在《张民觉生殖生理学研究》文中指出在当代世界着名的华裔科学大家的光辉名册中,杨振宁、李政道、丁肇中、李远哲、朱棣文、崔琦、钱永键、陈省身、丘成桐、陶哲轩等,他们或因荣获诺贝尔物理学、化学奖,或因荣获“数学界的诺贝尔奖”——菲尔兹奖、沃尔夫奖,而成为人们耳熟能详和广为传诵的对象。但在世界生理学和医学领域,也有一位同样重要但却被人们包括国人忽视而多少显得有些“落寞”的华裔科学大家,他就是国际生殖生理学大师——张民觉。张民觉因其卓越的生殖生理学贡献而被誉为“试管婴儿之父”和“口服避孕药之父”,曾叁次荣获诺贝尔奖的提名,是华人在国际生理学和医学领域取得的最高成就者。然而,与以上华裔数学家、物理学家和化学家相比,不仅国人对张民觉的事迹贡献所知甚少,而且国内外迄今尚无关于张民觉科学活动、成就贡献、社会影响的系统、专门和深入的研究,这是极不应该的。本论文是国内外首次关于张民觉生殖生理学贡献的全面、专业和深入的研究,是一次大胆而较新的探索。全文围绕张民觉生殖生理学的研究和贡献展开,以时间为主线,客观、真实地再现了其科研历程。主要内容分为六章：第一章,介绍了张民觉的求学与科研经历。张民觉在国内叁十年的岁月,受到儒家传统文化、家族文化及地域文化的影响,形成了一生的人格品质。中学阶段对生物学的浓厚兴趣是他以后进行生殖生理学研究的主体要素；清华大学接受的良好的系统教育成为他以后科学生涯的基础；国外的求学岁月与科研训练为他成为国际生殖生理学大师铺平了道路。第二章,梳理了张民觉精卵生理学基础研究的内容和成就。特别是精子获能、同步化理论的提出,突出了其作为生殖生理学家注重基础理论研究的理念,奠定了20世纪后半叶生殖生理学发展的学理基础。第叁章,突出了张民觉的精卵受精实验研究。受精是新生命的起点,标志着个体发育的伊始,张民觉是哺乳动物体外受精实验成功的第一人,多种动物卵子的体外受精及其技术上的改进均创始于张民觉的实验室。他凭着顽强毅力和娴熟的技巧,独自完成了几项精卵受精的经典实验,也标志着哺乳动物体外受精技术的成熟。第四章,论述了张民觉对人口控制技术的贡献。体外受精技术的成熟及应用催生了试管婴儿的诞生,为不孕夫妇带来了福音。同时,受精和避孕是一个过程的两个方面,据此张民觉又发明了成为节育有效手段的口服避孕药。张民觉的研究成果让不育者能育、能育者节育,为世界人口与社会的发展做出了巨大贡献。第五章,阐释了张民觉生殖生理学贡献引发的社会变革。从科学与社会的互动角度阐明了张民觉科学贡献的社会功能以及引发的社会伦理争议。“试管婴儿”的问世,使人类的命运从此由自己主宰；口服避孕药作为人工节育的有效手段,也让妇女从此获得了解放；体外受精技术的成功应用,开辟了畜牧改良的新途径,牛羊遍野不再是遥远的梦。同时,他的科学贡献也引发了医学伦理学、社会学和经济学等多方面的争议。对此,本论文也进行了讨论和分析。第六章,凝练出张民觉科学实验成功的启示。在他一生的科学研究生涯中,兴趣是他科学实验成功的原动力,勤奋执着与机遇是科学实验成功的前提,科学方法是他实验成功的保障,而大胆探索、勇于创新是他科学实验成功的关键。即兴趣、勤奋、执着、机遇、方法和创新,是张民觉作为实验科学家之所以成功的“六大法宝”,这当可以引以为当前我国科技创新人才培养的有益借鉴。张民觉一生致力于生殖生理学实验研究,他的基础理论和应用研究成果都源于其科学实验,直到去世前仍然可以看到他实验的可贵身影。他一生的科学实验都浓缩在其发表的362篇学术论文之中,是弥足珍贵的科学资料和精神财富。无论是理论上的巨大发现,还是技术上的重大突破,均解决了20世纪生殖生理学发展的瓶颈问题,凸显了他的重要贡献。本论文主要采用了文献资料综合分析法、口述科技史方法、结合友邻学科的跨学科研究方法、计量分析的方法、内史和外史相结合的方法,在大量原始英文文献的基础上,系统地发掘总结了张民觉生殖生理学实验成果对生殖生理学的贡献,剖析造就华人生殖生理学家成长的重要因素,总结当今中国培养科技创新人才的某些规律。本论文对张民觉这位生殖生理学巨擘的研究历程、生殖生理学成就、科学方法等展开全面发掘,理清了张民觉的成长轨迹和生殖实验成功的路径,总结了张民觉对生殖生理学的伟大贡献。创新之处主要有以下几方面：第一,首次较为系统、全面和深刻地探讨了张民觉在生殖生理学基础研究中做出的巨大贡献,填补了国内外对张民觉缺乏系统研究的空白,也进一步丰富了国内对华裔科学家系列的研究。第二,诚如一位美国友人曾经所言：“山西有很多寺庙、神佛的塑像,但却很少见科学家的塑像,张民觉博士对世界有巨大贡献,你们应该为他塑一尊像。”2004年在张民觉魂归故里10周年之际,其家乡岚县为张民觉塑了一尊塑像。针对山西以至国内对张民觉了解甚少的状况,本论文对从山西走向世界的科学家进行研究,丰富了山西的科学文化,也充实了山西地方科学史的内容。第叁,本论文通过对张民觉成长过程中家庭教育、初等教育、高等教育、研究环境等因素的影响分析,旨在揭示从“山里娃”到“天之骄子”嬗变的必要条件,同时也分析了科学实验研究取得成功所必须的科学素质。第四,张民觉的科学研究造福了人类,也引发了医学伦理学、社会学、经济学等多学科的争议。本论文从科技与伦理的张力视角,给出了关于张民觉何以叁次敲响诺贝尔奖大门而终未能入的社会文化思考。第五,透视张民觉成功的因素,探索当今我国科技创新人才培养的新途径。本论文力图刻绘出一位立体生动的华裔大科学家的全貌以及他的伟大理念,即他本人所说：科学必将造福于全世界,给人类带来文明。
徐平, 刘丽均, 郁丽丽, 贾青, 高娟[4]2009年在《系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的建立与应用》文中指出目的建立小鼠胚胎与配子冷冻库,以安全、有效地保存小鼠资源。方法选择不同遗传背景(近交系、远交群、免疫缺陷、疾病模型和基因改变等)的实验小鼠,系统进行了超数排卵、体外受精(IVF)率、胚胎与精子的冷冻复苏效果、卵巢冷冻与移植、辅助体外受精等比较研究。结果①小鼠年龄和遗传背景的不同,其超数排卵的结果也不同(P<0.01)。叁个日龄段中,28日龄最好,其次为112日龄,56日龄最差;不同遗传背景小鼠的超数排卵结果显示,封闭群和大部分近交系小鼠优于转基因小鼠(P<0.05),自发性疾病小鼠和基因剔除小鼠的结果最差;②不同品系小鼠的新鲜精子和冻融精子的体外受精率差异有显着性(P<0.05),特别是C57BL/6J小鼠冻融精子的IVF率(10.3±4.2%)与新鲜精子(89.8±4.8%)相比,差异极显着(P<0.01);③不同品系小鼠的胚胎复苏率,除MRL/mp小鼠的复苏率略低外,其他小鼠品系均有较高的冷冻胚胎复苏率(58.2%~83.9%),表明,不同遗传背景小鼠之间差异有显着性(P<0.05),但均可以达到有效保存小鼠资源的目的。④小鼠的遗传背景、年龄等对小鼠精子的冷冻效果都有影响,采用改良的FERTIUP冷冻保护剂和细胞质内单精注射(ICSI)技术可有效提高以C57BL/6J为背景的基因改变小鼠的精子冷冻复苏率。⑤卵巢冷冻保存可以改善雌性小鼠的繁殖困难或不孕。结论小鼠资源的安全保存,除了长期连续繁殖保种外,最好的或最保险的方法是低温保存。通过将胚胎、配子、卵巢等长期保存在液氮(-196℃)中避免遗传性状的改变,并在将来复苏后获得正常的小鼠后代,以用于生物学和医学等研究。
贾青[5]2008年在《C57BL/6J小鼠精子冷冻与单精子胞浆内注射技术研究》文中认为随着生命科学研究的日益发展,实验动物科学也在我国得到快速的发展,小鼠是应用最为广泛的实验动物之一。C57BL/6J品系小鼠作为应用最广泛的一种近交系小鼠,因其遗传背景稳定,是研究基因突变的重要工具;多种转基因小鼠均以C57BL/6J品系小鼠为遗传背景。如何开展这些基因工程小鼠的保种工作,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。胚胎生物技术和低温生物学技术的联合应用在小鼠保种中已获得成功,冷冻精子和胚胎业已成为建立冷冻库、保存特定品系最有效的策略。精子冷冻的技术操作方便、快速、无需特殊的设备,应用前景十分广阔。小鼠精子冷冻已成为小鼠种质资源保存的有效方法之一,其冷冻精子体外受精技术对于部分品系的小鼠来说已很成熟,但对于一些特殊品系如应用最广的C57BL/6J近交系小鼠及以C57BL/6J为遗传背景的转基因小鼠,冷冻精子体外受精卵裂率仍然很低。本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象,旨在通过对该品系小鼠精子冷冻及冷冻精子的体外受精、单精子胞浆内注射技术的研究,全面提高该品系小鼠体外受精卵裂率,为C57BL/6J小鼠的资源保存奠定基础。1 C57BL/6J小鼠精子冷冻技术研究本试验主要以C57BL/6J品系小鼠为研究对象,系统比较冷冻稀释液、解冻方法、获能时间和获能液、体外受精液、胚胎体外培养液等对该品系小鼠冷冻精子体外受精卵裂率与胚胎发育率的影响。结果表明:(1)以R_(18)S_3为基础液添加15%或20%卵黄离心上清液作为冷冻稀释液,可有效提高C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率(分别为36%和40%),但添加不同浓度的甘油或乙酰胺却会降低冻精体外受精卵裂率,混合添加卵黄和甘油冷冻效果不如单独添加卵黄,但比单独使用甘油效果要好;(2)采用37℃水浴15min和先60℃水浴6s再37℃水浴解冻15min 2种方法解冻精子,C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率无显着差异(P＞0.05),因一步解冻法操作简便,可作为常规解冻程序;(3)分别采用30、50和60min为C57BL/6J小鼠冻精的获能时间,体外受精卵裂率分别为17.3%、25%和19.4%,以50min获能效果最佳;(4)在100μl HTF体外受精液中分别添加1.0 IU/ml FSH和0.1ug/ml E_2,冷冻精子体外受精卵裂率分别为24.1%和27.3%,与不添加对照组(25%)相比没有明显提高(P＞0.05);(5)在100μl HTF中分别添加45μmol/L肾上腺素、75μmol/L亚牛磺酸、5 IU/ml肝素、7.5 mmol/L牛磺酸,以及不含BSA的TYH中添加0.75 mmol/L MBCD作为精子获能液,结果只有添加5 IU/ml肝素可提高冷冻精子体外受精卵裂率,但无统计学差异(P＞0.05);用R_(18)S_3+15%卵黄上清液冷冻精子时,添加5 IU/ml肝素的体外受精卵裂率最高(49.3%);若用R_(18)S_3+20%卵黄离心上清液冷冻,添加45μmol/L肾上腺素组所获体外受精卵裂率和囊胚发育率最高;(6)体外培养实验表明,KSOM更适合桑椹胚前的发育,而CZB更适合桑椹胚向囊胚的发育;(7)采用R_(18)S_3+20%卵黄离心上清冷冻C57BL/6J小鼠精子,并配合使用100μL HTF+45μmol/L肾上腺素作为精子获能液,体外受精所获2-细胞胚胎20枚移植至1只受体小鼠,产仔4只,产仔率为20%。2 C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究以C57BL/6J品系小鼠及DBA♂×C57BL/6J♀(B6D2FI)杂交鼠为研究对象,以Piezo操作系统为技术支撑;通过小鼠卵母细胞胞浆内精子注射(ICSI)技术,系统比较不同注射针内径、不同显微操作液、不同采卵时间对ICSI结果的影响,并比较鲜精、冻精体外受精和ICSI显微受精结果。结果表明:(1)使用内径为4～6μm的注射针,C57BL/6J小鼠ICSI胚胎卵裂率为88.5%,显着高于8～10μm内径组(85.7%对53.8%,P＜0.05);(2)C57BL/6J小鼠注射hCG后19h采卵进行ICSI操作,卵子存活率虽比注射后12或14h采卵组降低,但其卵裂率最高(92.7%),囊胚发育率也最高(36%);(3)C57BL/6J和B6D2F1小鼠卵使用Hepes-CZB显微操作液,ICSI操作后的卵子存活率分别为36.1%和61.2%,卵裂率为82.4%和63.1%,囊胚发育率为50%和45.8%;当操作液中添加3%蔗糖时,卵存活率分别为59.6%和80.2%,卵裂率为90.3%和82.1%,两品系小鼠存活率和卵裂率较对照组都有显着提高(P＜0.05);囊胚发育率为35.7%和26.3%,有显着降低(P＜0.05);当操作液中添加0.5mg/L细胞松弛素B,ICSI操作后的卵子存活率为49.1%和73.0%,卵裂率为90.0%和82.0%,两品系小鼠存活率、卵裂率都得到显着提高(P＜0.05);囊胚发育率为37.0%和33.0%,显着下降(P＜0.05);(4)C57BL/6J小鼠鲜精常规体外受精的卵裂率为90.4%,与其冻精体外受精后的卵裂率(25.0%、36.0%、40.0%)相比差异显着(P＜0.05),与冻精单精注射后的卵裂率(53.8%)也差异显着(P＜0.05);但冻精ICSI卵裂率与冻精常规体外受精后的卵裂率相比,明显提高(P＜0.05)。冷冻精子ICSI后囊胚发育率显着低于新鲜精子常规体外受精后体外培养的囊胚率(56.3%对71.6%,P＜0.05);(5)用添加3%蔗糖的Hepes-CZB作为显微操作液,经R_(18)S_3冷冻稀释液冷冻保存的C57BL/6J小鼠精子解冻后进行ICSI注射,所获40枚2-细胞胚胎移植给ICR受体假孕小鼠,获得着床8d胚胎13枚,妊娠率为32.5%。
毋状元[6]2016年在《马精子保存技术及精子冻融损伤机制的研究》文中研究说明马作为一种主要的大家畜,曾经与人类生产生活息息相关,机械工业兴起后,马的役用价值弱化,逐渐淡出人们生活。近些年,随着我国人民生活水平的提高,以产品、文化休闲为主的现代马业在我国悄然兴起,现代马业的发展迫切需要采用人工授精的方式进行马匹改良,精液的体外保存是目前我国马匹人工授精推广应用过程中的技术瓶颈,本研究针对这一问题,开展了马精液低温和冷冻保存技术的研究。并在此基础上应用同位素标记定量技术(i TRAQ)探索马精液冻融后受胎率低的原因及精子冻融损伤机制。取得结果如下:(1)分别以INRA82和INRA96?作为基础稀释液,比较6.5、6.7、6.9、7.1、7.3和7.5 p H下保存精液1、24、48和72h后对精液活力的影响,结果表明马精子体外存活的适宜p H为6.9-7.3之间。当p H低于6.7或高于7.3时对精液体外保存不利。用同样方法研究公马个体间是否存在适宜p H差异,结果表明4匹公马精液体外存活的适宜p H均为6.9-7.3。(2)不同平衡时间、冷冻方法及解冻程序对精液冷冻效果的研究表明,精液冷冻前平衡120 min、180 min和240 min叁组精液冻融后活力、质膜完整性显着高于0、45、90 min及过夜平衡组(P<0.05);距离液氮面高度2cm和4cm熏蒸法获得的冷冻效果与程序冷冻仪相当;采用高温快速解冻法(75℃,7s和46℃,20s)比常规方法(37℃,30s)可获得更高的冻后精液活力。(3)不同精清浓度对精液低温及冷冻效果影响研究表明,30%和40%精清浓度组精液保存后精液活力显着低于0%、10%和20%精清浓度组(P<0.05),10%精清浓度组精液保存24 h后活精子比例显着高于0%和20%精清浓度组(P<0.05),但保存至96 h后精液活精子比例显着低于0%精清浓度组(P<0.05);不同浓度精清对精液冷冻效果的影响表明,含0%浓度精清组精子冻融效果最好,随着精清浓度的增加冻融后精液活力、质膜完整性、高线粒体膜电势率逐步递减(P<0.05)。(4)比较5种抗冻剂,包括甘油、乙二醇、二甲基亚砜、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺及抗冻剂组合对马精液冷冻效果的影响。结果表明3.5%浓度的甘油和2.5%、3.5%及5%甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺冻后精液活力显着高于2.5%浓度的甘油和2.5%、3.5%及5%乙二醇和二甲基亚砜(P<0.05);比较甘油、甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺叁种抗冻剂不同组合对马精液冷冻效果的影响,结果表明甘油和甲基甲酰胺两种抗冻剂组合能显着的提高冷冻效果(P<0.05)。(5)比较添加不同浓度的卵黄成分(全卵黄、卵黄浆蛋白、LDL及卵黄可溶性蛋白)、大豆卵磷脂及β-环糊精胆固醇对马精液冷冻效果的影响。结果表明卵黄浆蛋白、LDL及卵黄可溶性蛋白叁种卵黄组分均对精液冷冻保护有显着作用,但不同卵黄组分间效果无显着差异;添加低浓度(1%)的大豆卵磷脂精液冻融后活力与对照组(4%全卵黄组)无显着差异(P>0.05),但添加高浓度大豆卵磷脂(2%和4%)组冻融后精液活精子比例、前向运动精子比例均显着低于对照组(P<0.05);添加不同浓度的β环糊精胆固醇组解冻后精液活力与对照组相比无显著差异(P>0.05)。(6)比较单独或组合添加葡萄糖、果糖、乳糖、棉籽糖及海藻糖对马精液低温保存和冷冻效果的影响。结果表明:单独添加乳糖和棉籽糖低温保存24 h后精液活精子比例和前向运动精子比例显着低于单独葡萄糖、果糖及海藻糖组(P<0.05),葡萄糖、果糖及海藻糖组间无显着差异;葡萄糖和乳糖分别与其他几种糖两两组合低温保存1、24、48、72、96 h后精液质量无显着差异;单独添加棉籽糖精液冻融后活精子比例和前向运动精子比例显着低于果糖和海藻组(P<0.05),但精液质膜完整性和线粒体膜电势却显着高于其他各组(P<0.05);单独添加葡萄糖、果糖、海藻糖及乳糖精液冻融后活精子比例、前向运动精子比例及线粒体膜电势均无显着差异(P>0.05),添加果糖组冻融后精液质膜完整性显着低于葡糖组(P<0.05);不同糖组合精液冻融后,乳糖+葡萄糖+海藻糖组精液质膜完整性显着高于乳糖+果糖、乳糖+海藻糖、乳糖+葡萄糖+果糖和乳糖+海藻糖+果糖组(P<0.05),乳糖+果糖组精液质膜完整性显着低于除乳糖+海藻组外的其他各组(P<0.05)。乳糖+葡萄糖+果糖组精液线粒体膜电势显着高于乳糖+果糖组(P<0.05),与其他各组间无显着差异。(7)探索用酪蛋白酸钠和乳清粉替代天然奶成分配置马精液保存稀释液的可行性。结果表明两种基础稀释液同时添加乳清粉和酪蛋白酸钠低温保存48h后精液活力均显着高于对照组(P<0.05),表明乳清粉和酪蛋白酸钠对对精液低温保存有效;在去除天然奶成分的INRA82基础液中添加0.1g/m L浓度的乳清粉和0.4g/m L的酪蛋白酸钠可获得最佳的精液保存效果;精液冷冻实验证实用乳清粉和酪蛋白酸替代INRA82稀释液中的奶成分添加卵黄和抗冻剂后配置的冷冻液获得了比商品液更好的冷冻效果。(8)分别比较了谷氨酰胺、甘氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、维生素C、维生素E、褪黑素8种抗氧化对马精液低温和冷冻保存效果的影响,结果表明添加25m M牛磺酸显着改善了精液低温保存后精液活力;添加Ve和甲硫氨酸组精子冻后线粒体完整性显着高于对照组,添加甲硫氨酸和甘氨酸组精子冻后质膜完整性有高于对照组的趋势(P=0.055),相反添加2.5m M半胱氨酸则不利于精液低温或冷冻保存。(9)比较添加不同浓度(0.1、1、10、100μg/m L)准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白对马精液冷冻效果的影响。结果表明,添加1μg/m L浓度昆虫抗冻蛋白显着改善了冻融后马精液活力和质膜完整性,但添加更高浓度100μg/m L的抗冻蛋白则对马精液冷冻有害。(10)采用自制稀释液进行精液低温保存或冷冻后受胎验证并进行大群推广验证。结果表明用自制液低温保存精液配种后情期受胎率为67.4%,进口INRA96?稀释液配种后情期受胎率为57.7%,两者无显着差异。自制冷冻稀释精液冻后活力在0.3以上,情期受胎率达到了50%,能够满足生产需要。低温保存稀释液推广应用601匹马,情期受胎率达到了63.39%。(11)利用同位素标记定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantization,i TRAQ)检测精子冻融前后蛋白表达差异,并对差异蛋白进行生物信息学分析,揭示精子冻融损伤机制。每组样本设置两个重复样本,质谱分析后得到的数据用Mascot 2.2软件在Uniprot_equuscaballus_28004数据库中进行数据搜索。共鉴定到2073个蛋白,以变化倍率±1.5倍,P<0.01为标准筛选差异蛋白,3个比较组分别筛选出了112(冻精/鲜精)、90(半衰冻精/冻精)和128(半衰冻精/鲜精)个差异蛋白。
穆春雨[7]2007年在《影响牛体外受精若干因素的研究及性控精液体外受精初探》文中认为本试验的目的是通过研究卵巢保存温度、精子获能方法、胚胎体外培养体系等方面来探讨诸因素对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响，进一步完善胚胎体外生产体系；在此基础上，把性别控制技术与体外受精技术相结合，把建立起来的胚胎体外生产体系应用于性控精液体外受精的初步研究，探讨用性控精液体外受精生产体外性控胚胎的可行性。主要研究结果如下：1．把卵巢随机分成两部分，一部分放到37℃左右的DPBS中保存做对照，另一部分则放到4℃左右的DPBS中，各保存8h后，收集卵母细胞进行体外培养，研究卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响。结果发现卵巢经4℃保存8h后卵母细胞的成熟率急剧下降，与对照组之间存在显着差异(12.12％vs 68.52％)(P＜0.05)，说明卵巢保存温度过低影响卵母细胞的体外成熟。2．将采集到的卵母细胞随机分成四组，分别用含不同浓度EGF(0、25、50、75 ng/mL)的成熟培养液成熟培养22h后检查卵母细胞成熟情况，研究EGF对卵母细胞体外成熟的影响。结果发现添加25ng／mLEGF组的卵母细胞的成熟率为64.74％，与对照组(61.81％)之间差异不显着(P＞0.05)；添加50ng／mL(74.39％)与75ng／mLEGF(75.86％)组间的成熟率无显着差异(P＞0.05)，但均显着高于对照组与25ng／mLEGF组(P＜0.05)。成熟培养液中加入EGF后均能提高卵母细胞的成熟率，随着EGF浓度的增加，卵母细胞的成熟率也随之提高；EGF在培养液中的适宜添加量为50ng/mL。3．从湖北省种公牛站购买了西门塔尔(4头)、夏洛来(1头)和利木赞(2头)3个品种中的7头种公牛的精液分别进行体外受精实验，以便从中筛选出适合用于体外受精的种公牛精液。结果发现不同个体的种公牛的精液对体外受精效果影响很大，用于体外受精的公牛精液在使用时需要进行仔细的选择。4．将采集到的卵母细胞成熟培养后随机分成四组，以BO和TALP为基础液配制受精获能液。精液解冻后分别用BO+上浮法、BO+直接离心法、TALP+上浮法和TALP+直接离心法四种方法获能处理后用于体外受精实验，筛选合适的精子体外获能体系。试验结果表明精子的四种处理方法(BO+上浮法、BO+直接离心法、TALP+上浮法和TALP+直接离心法)对体外受精效果无显着影响(P＞0.05)。5．卵母细胞体外受精后，将受精卵随机分成四组，以TCM199和SOF为胚胎基础培养液，分别用(1)TCM199、(2)TCM199+GCM、(3)mSOF和(4)mSOF+GCM四种培养体系进行体外培养，筛选合适的胚胎体外培养体系。研究结果显示各组之间卵裂率无显着差异(P＞0.05)，但囊胚率上出现了明显的差异(P＜0.05)。M199组的囊胚率(16.98％)最低，与M199+GCM组(29.49％)mSOF组(33.69％)、mSOF+GCM组(41.24％)间差异的显着(P＜0.05)；mSOF组的囊胚率(33.69％)与M199+GCM组(29.49％)在统计学上差异不显着(P＞0.05)，mSOF和mSOF+GCM组(41.24％)间囊胚率差异不显着(P＞0.05)。6．从屠宰场分别采集初情期前的小母牛和成年母牛的卵巢，保存在37℃的DPBS中运回实验室。采集卵母细胞后进行体外成熟培养和体外受精实验。不同年龄的牛(小母牛和成年母牛)的卵母细胞体外成熟效果无显着差异(73.75％vs75.80％)(P＞0.05)，来源于小母牛卵巢组的卵母细胞成熟培养后的卵裂率与成年母牛组间无显着差异(66.13％vs 68.48％)(P＞0.05)，而囊胚率存在明显差异(16.98％vs 37.72％)(P＜0.05)，且差异极显着(P＜0.01)。7．性控精液解冻后分别用上浮法和45％-90％Percoll梯度离心法获能处理后分别对成熟卵母细胞进行体外受精，随后观察胚胎的卵裂率和囊胚发育情况，研究性控精液(X-精子)不同处理方法对体外受精效果的影响，筛选出适合于性控精液体外获能的方法。结果发现性控精液经Percoll法获能处理后体外受精的卵裂率(55.57％)与上浮法(21.72％)存在着显着的差异(P＜0.05)，但在囊胚率上两者差异不显着(35.54％vs38.69％)(P＞0.05)。Percoll法是性控精液较好的体外获能处理方法。8．性控精液与常规精液解冻后均用Percoll法获能处理后分别对成熟卵母细胞进行体外受精，随后观察胚胎的卵裂率和囊胚发育情况，研究性控精液进行体外受精的可行性。性控精液体外受精后卵裂率(54.39％)低于常规精液(66.17％)(P＜0.05)，但囊胚率(36.06％vs 40.56％)无显着差异(P＞0.05)。性控精液用于体外受精体外生产性控胚胎是可行的。
徐平[8]2007年在《实验动物低温生物学和生殖工程技术的发展与应用》文中研究说明低温生物学(cryobiology)是生物科学的一门新兴分支学科,他是研究低温对生物体所产生的影响及其应用的科学。低温生物学的研究和应用,不仅促进了生物学、医学等基础学科的发展,而且为农业、畜牧业、医药工业及其食品工业等带来了巨大的效益。特别是对保护人类赖以生存的环境,挽救濒危物种,保护生物多样性产生了深远的影响。实验动物是生命科学的重要支撑条件,近年来,实验动物新品系,尤其是小鼠突变系的飞速增加已对现有的动物设施和资源的保存方法提出严峻的挑战。随着低温生物学理论的不断深入及其技术的不断完善,低温生物学技术已被广泛应用于实验动物的生产、遗传资源的保存及新品系开发等领域。无疑,小鼠模型的保存将为21世纪哺乳类遗传学的飞速发展和最终攻克人类目前的疑难疾病创造了有利条件。
胡建宏[9]2006年在《猪精液冷冻保存研究》文中进行了进一步梳理人工授精是一项发挥优秀公畜遗传潜力的重要现代动物生物技术,而精液冷冻的目的正是为了提供人工授精所需精子产品的一种精子库。冷冻以后精子的受精能力是保障哺乳动物高妊娠率的重要因素,与冷冻-解冻后精子质量密切相关。在复杂的冷冻-解冻过程中,精子细胞的生化成分和内部结构可能发生改变,致使目前猪精液冷冻保存的效果不够理想。冷冻-解冻后,精子活力、质膜完整性、顶体完整率以及发育能力远远不如鲜精,利用冷冻精液人工授精后母猪较低的繁殖率及较少的窝产仔数等导致猪冷冻精液不能应用于商品化养猪生产。因此,精子冷冻的首要目标,包括稀释液的应用、糖类的选择以及精液的冷冻-解冻程序等,都需要阻止对精子产生危害的致命冰晶的形成,以提高精子活力、活率,降低冷冻对精子顶体和质膜的损伤。为了保护精子免遭低温打击,卵黄在家畜冷冻精液中普遍应用,且其保护作用归功于低密度脂蛋白。关于卵黄低密度脂蛋白对牛和鱼精子冷冻保护的研究已有报道,但是没有研究评估低密度脂蛋白对猪冷冻精液活力和其它质量指标的影响。葡萄糖和果糖等添加物对哺乳动物冷冻-解冻后精子活率的影响报道较多,海藻糖、蔗糖和乳糖等双糖对小鼠、牛、绵羊和山羊精子冷冻-解冻后精子运动能力和受精能力也有一些报道,但是迄今为止,关于海藻糖对冷冻-解冻后猪精液质量的影响没有系统的研究报道。此外,在冷冻精液的生产中,精子细胞面临许多潜在的危险。精液的稀释、孵育,精子染色,荧光、精液的离心以及冷冻等,可能损伤精子DNA,影响精子的存活能力和受精潜力。然而猪精液不同的处理程序和技术对精子DNA完整性的影响几乎没有研究报道。为了进一步提高冷冻-解冻后猪精液的质量,保护精子抵抗低温打击的能力,开发中草药冷冻保护剂,本研究以蛋黄低密度脂蛋白(LDL)、双糖(海藻糖、蔗糖、乳糖)、中草药添加剂等作为冷冻保护剂,以冷冻解冻后精子的活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率、精卵体外受精的卵裂率作为评定标准,利用碘化丙啶(PI)、罗丹明123、异硫氰酸荧光素连接的花生凝集素(FITC-PNA)、氯四环素(CTC)染色以及低渗膨胀测试(HOST)分别检测冷冻-解冻后精子的活率、染色线粒体活性、顶体完整率、获能处理前获能率、获能潜力以及质膜完整性,同时研究了猪细管冷冻精液的冷冻温度曲线、常温保存液预处理与冷冻基础液之间的配伍效应、冷冻-解冻对精子DNA的损伤以及精子体外受精卵裂率与精液参数(精子活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率)之间的相关和回归关系。结果表明:
杨慧欣[10]2006年在《影响绵羊体外胚胎生产效果因素的研究》文中指出本论文从卵母细胞采集、体外成熟培养、体外受精、胚胎体外发育培养以及卵母细胞冷冻保存方面研究了影响绵羊体外胚胎生产效果的因素,以期提高绵羊体外胚胎生产的效率。 在卵母细胞采集方面,研究了不同采集方法(抽吸法和切剖法)和不同季节对绵羊卵母细胞采集效果的影响。结果表明,平均每个卵巢获得的可用卵数,切剖法显着高于抽吸法(2.02枚vs1.05枚,P<0.05);9、10月份屠宰绵羊平均每个卵巢所采集的卵母细胞数(1.50枚,1.68枚)极显着高于其它月份(1、2、3、4、5、6、10、11、12月份)(P<0.01)。 在卵母细胞体外成熟培养方面,比较了成熟液中添加FBS和ESS对卵母细胞成熟效果的影响。结果表明:成熟液中添加ESS较FBS能显着提高卵母细胞的成熟率(72.7%vs60.2%,P<0.05)。 在体外受精方面,研究了精卵共孵育时间长短和不同精液处理方法对体外受精卵裂率的影响。结果表明:精卵共孵育24h组卵裂率高于6h组(60.4%vs22.7%,P<0.05),而与18h组差异不显着(60.4%vs58.6%,P>0.05);低温保存精液上游法的卵裂率(78.6%)显着高于低温保存精液Percoll离心法和冻精Percoll离心法(60.2%,62.3%)(P<0.05),极显着高于冻精上游法(21.1%)(P<0.01)。 在体外胚胎发育培养方面,研究了在发育液中添加EDTA、葡萄糖以及发育液不同更换方式对体外胚胎发育的影响。结果表明,胚胎发育培养液中添加10μM EDTA能显着提高卵裂率(55.7%vs43.6%,P<0.05)和桑椹胚率(24.6%vs16.1%,P<0.05);在胚胎发育不同阶段添加变化浓度的葡萄糖可显着提高卵裂率(66.1%vs44.7%,P<0.01)和桑椹胚率(33.7%vs17.1%,P<0.05);半量更换发育液方式的桑椹胚率高于全换液和不换液方式(42.0%vs33.3%and16.2%,P<0.05)。 本论文还研究了在培养液(包括成熟液、受精液和发育液)中分别添加0,1,2,5和10ng/ml的VEGF对绵羊体外胚胎生产效率的影响。结果表明:VEGF添加量为5ng/ml和2ng/ml的组卵裂率(86%,69%)和桑椹胚率(31.0%,25.0%)显着高于其它各组(P<0.05)。 在绵羊卵母细胞冷冻保存方面,研究了利用EDFS30玻璃化冷冻液,采用OPS法玻璃化冷冻体外成熟绵羊卵母细胞效果的研究。结果表明:经冷冻保存的卵母细胞解冻后体外受精和孤雌激活的卵裂率、桑椹胚率(42.3%、50.0%和18.4%、33.4%)显着低于非冷冻组(65.3%、68.2%和27.0%、13.4%)(P<0.05),冷冻组没有胚胎发育到囊胚。
参考文献：
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[2]. 牛卵母细胞及体外胚培养技术研究[D]. 桑国俊. 甘肃农业大学. 2008
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[7]. 影响牛体外受精若干因素的研究及性控精液体外受精初探[D]. 穆春雨. 华中农业大学. 2007
[8]. 实验动物低温生物学和生殖工程技术的发展与应用[J]. 徐平. 中国比较医学杂志. 2007
[9]. 猪精液冷冻保存研究[D]. 胡建宏. 西北农林科技大学. 2006
[10]. 影响绵羊体外胚胎生产效果因素的研究[D]. 杨慧欣. 河北农业大学. 2006
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