不同毒力G蛋白狂犬病重组病毒的拯救及生物学特性研究

论文摘要

本课题研究以狂犬病病毒疫苗毒LBNSE株的反向遗传学系统为骨架,分别用RT-PCR扩增CVS-11株（标准攻击毒株）与SAD株（疫苗毒株）的G基因,将该基因分别与pLBNSE质粒中的的G基因进行替换,构建两株重组质粒。利用反向遗传学系统拯救出两株重组不同毒力狂犬病G蛋白的重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG,然后对两株病毒的生物学特性进行探究。应用Overlap PCR的方法,利用Snapgene生物学软件设计引物,对实验室保存的全长pLBNSE质粒的Pst I和EcoR I酶切位点进行改造,改造后质粒命名为r-pLBNSE。根据GenBank上发表的SAD株和CVS11株的全基因序列,利用Primer5生物学软件分别设计G基因引物（G基因前加信号肽和flag标签）,分别进行RT-PCR扩增出SAD株和CVS11株的G基因序列。将扩增出的G基因序列,经酶切、连接等步骤替换到改造后的r-pLBNSE质粒上,构建出重组G基因的全长质粒并命名为r-pLBNSE-SfG（带 flag 标签的 SAD 株 G 基因）和 r-pLBNSE-CfG（带 flag 标签的 CVS11株G基因）。利用反向遗传学系统,将重组全长质粒与辅助质粒pH-N、pH-P、pH-G和pH-L共转染BSR细胞,拯救出重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG。应用直接免疫荧光和RT-PCR的方法鉴定拯救的重组病毒。通过探究两株重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG的生物学特性,发现重组病毒的生长特性与亲本毒株相一致,通过对糖蛋白表达量的比较发现重组病毒糖蛋白表达量明显低于亲本毒株,而致病性由强到弱依次为rLBNSE-CfG≥rLBNSE-SfG≥LBNSE。本实验为探究狂犬病的致病机理、病毒的包装、运输、释放及病毒的神经嗜性与糖蛋白的关系等机制的研究奠定基础。

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摘要

Abstract

缩略语表

1 引言

1.1 狂犬病的特征及其流行状况

1.2 狂犬病病毒的基本形态、构成和物理化学特性

1.2.1 病毒的基本形态

1.2.2 病毒的构成

1.2.3 病毒理化特性

1.3 狂犬病病毒的血清型分类

1.4 狂犬病病毒G蛋白的结构与生物学功能

1.4.1 狂犬病病毒G蛋白的结构

1.4.2 狂犬病病毒G蛋白的生物学功能

1.5 狂犬病病毒的复制

1.6 狂犬病的发病机理

1.7 狂犬病的防控

1.8 狂犬病病毒反向遗传学技术的发展

1.9 研究的目的与意义

2 实验一狂犬病病毒LBNSE株反向遗传学系统的改造及鉴定

2.1 材料

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.2 方法

2.2.1 引物

2.2.2 RV全长克隆质粒pLBNSE的改造策略

2.2.3 目的基因rEP的扩增

2.2.3.1 分别扩增出组成rEP基因的3个片段

2.2.3.2 未加引物初步扩增出rEP基因

2.2.3.3 特异性引物扩增出rEP基因

2.2.4 pLBNSE质粒的大量制备

2.2.5 改造质粒r-pLBNSE的构建及鉴定

2.2.6 转染及病毒的拯救

2.2.7 重组病毒rLBNSE的鉴定

2.3 结果

2.3.1 通过Overlap PCR获取rEP目的基因结果

2.3.2 全长pLBNSE质粒酶切结果

2.3.3 全长r-pLBNSE质粒和辅助质粒酶切鉴定结果

2.3.4 全长r-pLBNSE质粒测序结果

2.3.5 直接免疫荧光鉴定拯救的rLBNSE病毒

2.3.6 RT-PCR鉴定拯救的rLBNSE病毒

2.4 讨论

3 实验二狂犬病重组质粒的构建及重组病毒的拯救

3.1 材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.2 方法

3.2.1 引物

3.2.2 RV全长重组克隆质粒的构建策略

3.2.3 pcDNA3.1-SfG和pcDNA3.1-CfG质粒的构建

3.2.4 重组质粒r-pLBNSE-SfG和r-pLBNSE-CfG的构建

3.2.5 转染及病毒的拯救

3.2.6 重组病毒rLBNSE-SfG和rLBNSE-CfG的鉴定

3.3 结果

3.3.1 PCR扩增CVS11-flag-G和SAD-flag-G目的基因

3.3.2 pcDNA3.1质粒酶切结果

3.3.3 pcDNA3.1-SfG和pcDNA3.1-CfG质粒酶切鉴定结果

3.3.4 PCR扩增PB-CfG和PB-SfG目的基因

3.3.5 改造后的全长r-pLBNSE质粒酶切处理

3.3.6 重组质粒r-pLBNSE-SfG和r-pLBNSE-CfG的酶切鉴定结果

3.3.7 重组质粒r-pLBNSE-SfG和r-pLBNSE-CfG的测序结果

3.3.8 直接免疫荧光鉴定重组病毒

3.3.9 RT-PCR鉴定重组病毒及测序结果

3.4 讨论

4 实验三重组狂犬病病毒生物学特性研究

4.1 材料

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验试剂

4.2 方法

4.2.1 重组病毒的传代

4.2.2 重组病毒的滴度测定

4.2.3 重组病毒BSR细胞传代稳定性测定

4.2.4 重组病毒体外生长曲线测定

4.2.5 重组病毒糖蛋白表达量测定

4.2.6 重组病毒致病性测定

4.3 结果

4.3.1 重组病毒BSR细胞传代稳定性

4.3.2 重组病毒体外生长曲线

4.3.3 重组病毒糖蛋白表达量

4.3.4 重组病毒致病性

4.4 讨论

5 全文结论

致谢

参考文献

附录

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马子鹏

导师: 温永俊

关键词: 狂犬病病毒,蛋白,反向遗传系统,生物学特性

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: S852.655

DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000469

总页数: 70

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