基于TLR4/NF-κB通路探讨嗜酸乳杆菌缓解牛乳过敏机制的研究

论文摘要

近年来,食物过敏发病率逐渐上升,已成为严重的公共健康问题,但目前其发病机制还不够明确。TLR4（Toll-like receptor 4,TLR4）作为重要的模式识别受体,能够识别病原体相关分子模式,级联触发细胞信号的免疫反应,可以激活核转录因子NF-κB（Nuclear factor-kappaB,NF-κB）,来调控多种细胞因子的释放,从而调节免疫反应。TLR4/NF-κB信号通路已经被证明在多种炎症疾病中发挥关键作用,但TLR4/NF-κB通路在β-乳球蛋白（β-Lg）过敏炎症中的作用机制尚未被报道。课题组前期研究发现嗜酸乳杆菌KLDS 1.0738具有良好的抗β-Lg过敏作用,然而嗜酸乳杆菌缓解β-Lg过敏炎症是否通过TLR4/NF-κB信号通路还不可知。基于此,本研究通过细胞实验建立β-Lg诱导巨噬细胞RAW264.7的过敏模型,研究了TLR4/NF-κB信号通路在β-Lg诱导的过敏炎症中的作用,以及比较分析嗜酸乳杆菌活菌和热致死菌体对β-Lg过敏免疫调节的作用,并进一步应用TLR4/NF-κB在过敏反应中的关键作用来解释嗜酸乳杆菌缓解β-Lg过敏的作用机制,为治疗和预防β-Lg过敏提供新的靶点。（1）TLR4/NF-κB信号通路在β-Lg诱导巨噬细胞过敏中的作用建立β-Lg诱导巨噬细胞过敏模型,分析TLR4/NF-κB通路在β-Lg诱导巨噬细胞过敏中的作用。分为正常组、β-Lg过敏组（1 mg/mL）、TLR4抑制剂C34组（10μg/mL）、TLR4抑制剂C34（10μg/mL）+β-Lg组（1 mg/mL）。采用ELISA测定细胞上清液中特异性IgE的含量,qRT-PCR测定TLR4/NF-κB通路相关分子TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、TRAF6和细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量,Western blot测定TLR4和NF-κB p65蛋白的表达。研究结果显示,β-Lg刺激巨噬细胞后,升高了细胞上清液中特异性IgE的含量。阻断TLR4/NF-κB信号通路后,与过敏组相比,细胞上清液中特异性IgE的含量显著下降。同时TLR4/NF-κB通路中的相关分子TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1、TRAF6以及细胞因子的mRNA表达量被下调。Western blot结果显示,抑制TLR4信号途径后,TLR4和NF-κB p65蛋白的表达量显著降低（P<0.05）。基于上述研究结果,TLR4/NF-κB通路在β-Lg过敏中发挥重要的正向调节作用。（2）嗜酸乳杆菌活菌及热灭活菌对β-Lg诱导巨噬细胞过敏炎症的调节作用构建β-Lg诱导巨噬细胞过敏模型,比较不同嗜酸乳杆菌活菌和热灭活菌对β-Lg诱导巨噬细胞过敏炎症的调节作用。分为正常组、β-Lg过敏组（1 mg/mL）、市售益生菌活菌/热灭活菌组（Commercial Probiotic,CP）、嗜酸乳杆菌1.0738活菌/热灭活菌组（La 1.0738）、嗜酸乳杆菌1.0210活菌/热灭活菌组（La 1.0210）和嗜酸乳杆菌08001活菌/热灭活菌组（La08001）。采用MTT检测嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导巨噬细胞增殖活性的影响,ELISA测定细胞上清液中特异性IgE的含量以及细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。结果显示,相比于过敏组而言,嗜酸乳杆菌活菌及其热灭活菌都可以降低细胞上清液中特异性IgE,并能够增加巨噬细胞的存活率和降低细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量（P<0.05）。研究结果还显示益生活菌的效果要优于热灭活菌组,特别是嗜酸乳杆菌1.0738活菌组和市售益生活菌组。（3）嗜酸乳杆菌活菌对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路的作用建立β-Lg诱导巨噬细胞过敏模型,分析嗜酸乳杆菌活菌对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4/NF-κB通路的作用。分为正常组、β-Lg过敏组（1 mg/mL）、TLR4抑制剂组（10μg/mL）+β-Lg组（1 mg/mL）、活菌CP组、活菌La 1.0738组、活菌La 1.0210组以及活菌La 08001组。然后采用qRT-PCR测定各组中TLR4/NF-κB通路相关分子及细胞因子mRNA的表达,Western blot测定各组中TLR4和NF-κB p65蛋白的表达。结果显示,与过敏组相比,四种益生菌都能显著降低TLR4、NF-κB、MyD88、IRAK1和TRAF6 mRNA的表达量（P<0.05）,并且蛋白结果同样显示,益生菌能够降低TLR4和NF-κB p65蛋白的表达量,从而抑制NF-κB的转录活性,进一步阻遏了炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达（P<0.05）。以上结果表明,TLR4/NF-κB信号通路在β-Lg过敏中发挥正向调节作用,并且嗜酸乳杆菌缓解β-Lg过敏可能是通过调节TLR4/NF-κB通路来抑制炎症因子的产生。其作用机理可能是嗜酸乳杆菌下调TLR4的表达,通过TLR4介导的MyD88依赖性通路,进而抑制激活IRAK1和TRAF6的表达,从而抑制核转录因子NF-κB的激活,防止NF-κB转入细胞核调控细胞因子的释放。这些新的研究发现为更深层次的阐述食物过敏的机理,并且为预防和治疗食物过敏性疾病提供了新的策略,还为嗜酸乳杆菌在临床应用提供有力的依据。

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摘要

英文摘要

1 前言

1.1 立题背景

1.2 牛乳过敏

1.3 Toll样受体4 信号通路的研究概述

1.3.1 Toll样受体4 的结构及其生物学功能

1.3.2 Toll样受体4 介导的信号通路

1.3.3 核转录因子NF-κB

1.3.4 Toll样受体4 信号通路在过敏性疾病发展中的作用

1.4 益生菌的抗过敏作用

1.5 益生菌对TLRs-NF-κB信号通路的影响

1.6 研究内容、目的及意义

1.6.1 研究目的及意义

1.6.2 研究内容

1.6.3 技术路线图

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验菌株

2.1.2 试验细胞株

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要溶液配置

2.2 主要仪器设备

2.3 试验方法

2.3.1 菌悬液制备

2.3.2 RAW264.7 细胞培养

2.3.3 细胞干预模型的构建

2.3.4 MTT检测巨噬细胞增值活性

2.3.5 ELISA法检测β-Lg特异性IgE及细胞因子的含量

2.3.6 qRT-PCR检测TLR4 通路中相关分子及细胞因子mRNA的表达

2.3.7 Western blot测定TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白的变化

2.3.8 数据分析

3 结果与分析

3.1 TLR4 通路在β-Lg诱导巨噬细胞过敏中的作用

3.1.1 TLR4 抑制剂对β-Lg诱导巨噬细胞中特异性IgE的影响

3.1.2 TLR4 抑制剂对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4/NF-κB通路相关分子mRNA表达的影响

3.1.3 TLR4 抑制剂对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4和NF-κB p65 蛋白表达的影响

3.1.4 TLR4 抑制剂对β-Lg诱导巨噬细胞中细胞因子mRNA表达的影响

3.2 比较不同嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导过敏炎症的调节作用

3.2.1 嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导巨噬细胞中特异性IgE的影响

3.2.2 嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导巨噬细胞增殖活性的影响

3.2.3 嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导巨噬细胞分泌细胞因子的影响

3.3 嗜酸活菌对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4 通路的作用

3.3.1 嗜酸活菌对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4 通路相关分子mRNA的作用

3.3.2 嗜酸活菌对β-Lg诱导巨噬细胞中细胞因子mRNA的影响

3.3.3 嗜酸活菌对β-Lg诱导巨噬细胞中TLR4和NF-κB p65 蛋白表达的影响

4 讨论

4.1 TLR4/NF-κB信号通路在β-Lg过敏中的作用

4.1.1 β-Lg激活TLR4/NF-κB信号通路

4.1.2 阻断TLR4/NF-κB信号通路对β-Lg过敏的作用

4.2 嗜酸乳杆菌缓解β-Lg过敏的作用机制

4.2.1 嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导过敏炎症的作用

4.2.2 嗜酸乳杆菌对β-Lg诱导巨噬细胞TLR4 信号通路的作用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王俊娟

导师: 李艾黎

关键词: 嗜酸乳杆菌,过敏,样受体

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 东北农业大学

基金: 黑龙江省自然科学基金嗜酸乳杆菌调节肠道代谢物缓解牛乳过敏的机制研究课题

分类号: TS201.3

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基于TLR4/NF-κB通路探讨嗜酸乳杆菌缓解牛乳过敏机制的研究

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