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Bacillus licheniformis MW3级联调控H2S氧化的作用机制研究

2020-12-09阅读(769)

Bacillus licheniformis MW3级联调控H2S氧化的作用机制研究

论文摘要

H2S及硫化物在自然界中广泛存在,是生物地球化学循环中重要的组成部分。H2S是一种有毒气体,能够通过抑制呼吸链而影响中枢神经系统和呼吸系统的活动,从而产生毒性作用,然而随着相关研究的深入,H2S也被认为是继CO和NO之后的第三类气体信号分子,既可以对细胞的生理起到重要的调控作用,也能作为一种还原性的物质直接参与细胞清除自由基的过程,抵抗氧化压力。异养细菌可以在好氧环境中氧化有机质产生H2S,在异养菌中发现的SQR-PDO途径是已知的最重要的H2S氧化途径之一,其能将硫化物经多硫化物氧化成亚硫酸盐和硫代硫酸盐。硫酸盐是硫化合物中氧化程度最高的盐类,也是植物和多数微生物生成半胱氨酸的主要硫源。高浓度的含硫有机工业废水,也会严重影响国家生态安全及环境健康。因此,研究硫及其化合物代谢在生物地球化学循环中有很重要的作用。BigR、CstR和SqrR是分别来自三种不同菌的负调控因子,负调控下游H2S氧化相关基因的转录,进一步的研究发现罗尔斯通氏菌中存在一个新型的σ54因子依赖的调控因子FisR,对sqr和pdo基因起到正调控作用。我们通过生物信息学分析发现在地衣芽孢杆菌（Bacillus licheneformis）MW3中,sqr和pdo基因的上游存在编码双组分调控系统的nreBC基因和yrkD调节基因,但其调控sqr和pdo的机制是未知的,并且调控因子YrkD和双组分系统NreBC如何协同发挥调控作用以及感应的信号分子是不清楚的,因此研究此H2S氧化途径的调控功能十分必要。本文中我们首先构建了nre 和nreC敲除株,发现其在诱导后丧失了氧化H2S的能力,这表明双组分系统NreBC对H2S氧化途径是正调节的激活型转录因子。然而同时敲除yrkD和nreBC基因之后,sqr基因不能正常转录,但在只敲除yrkD基因时sqr基因在不受诱导的条件下能够正常转录,结合qPCR分析结果表明YrkD能抑制双组份调控系统nreBC的表达,进而影响sqr基因的转录。随后,提取了野生株的RNA并进行共转录分析,结果发现yrkD-yrkE-yrkF-yrkH-yrkI-yrkJ-ydfQ-nreB-nreC-sqr-pdo存在一个共转录文本。同时通过构建sqr-pdo反转株,将sqr和pdo整体反转过来,发现在硫化物诱导的情况下sqr基因仍然可以表达,这说明sqr-pdo前面也有独立的启动子。进一步通过5’ RACE分析转录起始位点,结果证实了yrk 和sqr前面有转录起始位点。进而构建了绿色荧光蛋白报告系统,在野生菌中研究发现多硫化物能诱导菌株中绿色荧光蛋白的产生,而在yrkD基因敲除株中,发现多硫化物并不能诱导绿色荧光蛋白产生,而NaHS可以诱导绿色荧光蛋白的表达,结果说明了YrkD和NreB的感应信号不同,YrkD感应多硫化物,而NreB的感应信号是HS-，这是一种新型的感应信号,对于H2S氧化有重要的作用。本文在B.licheniformis中发现了一条新型H2S氧化途径,其中包含已知的SQR-PDO途径,研究揭示了 SQR-PDO途径受到一种新型的YrkD和NreBC双调控因子的级联调控;同时,NreBC作为一个双组份系统也是首次被发现参与了H2S氧化途径的调控;与已知的多硫化物感应信号不同,本文中发现能感应HS-信号的调控因子。本文深入揭示了这条新型H2S氧化途径的调控机理,这将丰富我们对异养细菌硫氧化多样性的认知,为开展H2S的生物处理及其应用提供一定的依据,具有一定的生态意义。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 绪论
  •   1.1 引言
  • 2S和硫烷硫的介绍'>    1.1.1 H2S和硫烷硫的介绍
  •     1.1.2 硫氧化途径
  •   1.2 硫氧化途径的调控因子
  •     1.2.1 BigR （biofilm growth-associated repressor）生物膜生长抑制子
  •     1.2.2 CstR（CsoR-like sulfurtransferase repressor）类铜敏感操纵子阻遏蛋白的硫转移酶抑制子
  •     1.2.3 SqrR（Sulfide:quinone reductase Repressor）硫醌氧化还原酶抑制子
  •     1.2.4 FisR（Fis family transcriptional Regulator） Fis家族调控子
  •   1.3 地衣芽孢杆菌
  •     1.3.1 地衣芽孢杆菌的特性
  •     1.3.2 地衣芽孢杆菌与硫化物的关系
  •   1.4 双组分系统（Two-component Regulatory System TCS）
  •     1.4.1 双组分系统的机制
  •     1.4.2 NreB-NreC组成的双组分系统的介绍
  •   1.5 本论文的研究内容和意义
  • 第二章 YrkD和NreBC的调控功能的研究
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株和质粒
  •     2.1.2 本章所用的引物
  •     2.1.3 试剂和试剂盒
  •     2.1.4 仪器设备
  •     2.1.5 培养基和缓冲液
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 E.coli化学感受态制备（KCM法）
  •     2.2.2 热激法感受态细胞的制备（Inoue法）
  •     2.2.3 敲除质粒的构建
  •     2.2.4 敲除菌株的构建
  •     2.2.5 构建NreB单Cys突变株
  • 2S消耗的测定'>    2.2.6 H2S消耗的测定
  •     2.2.7 硫化物的检测方法（亚甲基蓝,methylene blue,MB法）
  • 2S消耗检测条件的优化'>    2.2.8 H2S消耗检测条件的优化
  •   2.3 结果和讨论
  •     2.3.1 生物信息学分析
  • 2S消耗检测方法的优化'>    2.3.2 H2S消耗检测方法的优化
  •     2.3.3 双组分系统NreBC的调控作用
  •     2.3.4 YrkD的调控功能分析
  •     2.3.5 sqr基因的转录受到了NreBC和YrkD的双重影响
  •     2.3.6 NreB单Cys突变的影响
  •   2.4 本章小结
  • 第三章 MW3中硫氧化相关基因的转录分析
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株和质粒
  •     3.1.2 本章所用的引物
  •     3.1.3 本章主要试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 提取MW3的RNA
  •     3.2.2 反转录成cDNA
  •     3.2.3 共转录分析
  •     3.2.4 实时定量PCR （RT-PCR）分析
  •     3.2.5 5'RACE扩增引物分析
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 共转录分析
  •     3.4.2 nreC和pdo的转录水平都受到YrkD调控的影响
  •     3.4.3 sqr-pdo是独立的操纵子并且仍受到YrkD和NreBC的调控
  •     3.4.4 5'RACE分析转录起始位点
  •     3.4.5 NreC结合位点的预测
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 YrkD和NreBC感应信号的研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌株和质粒
  •     4.1.2 本章所用的引物
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 荧光报告系统的构建
  •     4.2.2 不同硫化物的诱导及荧光检测
  •     4.2.3 不同浓度硫化物的诱导及荧光检测
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 YrkD的感应信号的研究
  •     4.3.2 NreBC感应的诱导底物分析
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 全文总结与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 发表论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李晶晶

    导师: 焦念志,荀鲁盈,夏永振

    关键词: 硫化物氧化,双组分系统,级联调控

    来源: 山东大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 山东大学

    分类号: Q75

    总页数: 71

    文件大小: 4237K

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