张海谱[1]2003年在《抗人糖原磷酸化酶BB抗体的制备临床应用》文中研究表明目的：糖原磷酸化酶（GP, E.C.2.4.1.1）是糖原分解代谢的关键酶，是肌肉收缩能量来源的重要途径。GP以同源二聚体形式存在，单体分子量约为94KD。GP有叁种同工酶：脑型（GPBB）、骨骼肌型（GPMM）和肝型（GPLL），其中GPBB也存在于心肌中。GPBB 87%与GPMM、80%与GPLL同源，序列上的差异决定了GPBB有不同于其他两种同工酶的抗原表位。近年研究表明：由于GPBB在糖原氧化分解中的关键作用，因而对缺血性心肌损伤具有高度敏感性，对于缺血性心肌损伤及AMI的早期诊断有重要意义。正常情况时血清中GPBB水平较低（参考值<7.0μg/L）难以检测，当心肌缺血缺氧时心肌细胞细胞膜结构改变，GPBB可弥散入血使血清中GPBB水平明显升高，从而进行检测。但由于人GPBB的组织来源较为困难，因而采用抗原纯化→免疫动物制备抗体→建立免疫分析的技术路线难以实现。因此本文依据文献报导的人GP叁种同工酶氨基酸序列，应用计算机信息分析技术比较得出人GPBB特异性片段，并对其进行抗原表位的多参数预测，寻找特异性抗原表位。然后根据预测结果，应用多肽合成技术合成具有8分枝结构复合肽抗原，进而制备其多克隆及单克隆抗体，建立血清中GPBB含量检测的ELISA方法，探讨其临床意义。方法：1．GPBB表位预测及复合肽抗原合成：首先应<WP=5>用GOLDKEY核酸和蛋白质分析软件及配套光盘对GPBB的Hopp&Woods亲水性参数、Welling抗原性参数、二级结构及可及性参数进行单参数分别预测，应用万氏法进行综合预测，根据分析结果确定叁段预合成的复合肽抗原氨基酸序列。利用ABI MODEL 431A型肽合成仪合成具有8分支结构的叁段复合肽抗原GPBBP1、GPBBP2、GPBBP3。2．抗体制备及鉴定：以复合肽抗原常规免疫新西兰白兔，通过多次多点免疫，制备叁种复合肽抗原的多克隆抗体，分别是抗GPBBP1、抗GPBBP2、抗GPBBP3。以GPBBP3常规免疫Balb/c小鼠，通过与骨髓瘤细胞融合，然后用ELISA方法筛选阳性细胞株，以有限稀释法克隆化，建立分泌抗体的杂交瘤细胞株1A8。抗体的效价以ELISA方法检测。抗体的鉴定利用Western blot结合ELISA的方法进行。以此证实叁种抗体与天然GPBB（人心肌来源）的反应性及相对于GPMM（人骨骼肌来源）的特异性。以抗GPBBP3（或1A8）包板，以抗GPBBP2作为检测抗体建立双抗体夹心ELISA方法，对GPBB阳性人心肌组织或细胞株U251、AGS的匀浆和GPMM阳性人骨骼肌组织及GPLL阳性细胞株Hela细胞匀浆检测，作为Western blot的补充。抗体的种属特异性鉴定以小鼠心肌、骨骼肌、肝脏组织匀浆采用ELISA方法进行。3．血清GPBB检测方法的建立及初步应用：以抗GPBBP3作为包被抗体，以HRP标记的抗GPBBP2作为检测抗体，建立血清GPBB检测的半定量方法。质控及阴性对照为正常人群混合血清。结果以标本血清OD值(P)除以阴性对照OD值(N)表示，P/N<2.1为阴性；P/N≥2.1而<4为阳性；P/N≥4为强阳性。<WP=6>然后对3例心梗患者、200例正常人及649人的体检人群血清进行检测，探讨血清GPBB检测的临床意义。结果：1．通过对GPBB抗原表位预测及分析比较，最后选定的具有特异性的抗原表位氨基酸序列为GPBBP1（N4-N15，PLTDSEKRKQIS）、GPBBP2（N590-N601，RIKRDP AKAFVP）、GPBBP3（N786-N804，AQVDQLYRNPKEWTK KVIR）。以此为根据合成了叁段8分枝的复合肽抗原。2．制备的多克隆抗体效价为抗GPBBP1（1:25600）、抗GPBBP2（1:102400）、抗GPBBP3（1:204800），单克隆抗体1A8效价为（1:10000）。所有抗体都可与天然GPBB反应，抗GPBB1对于GPBB不具有特异性。以抗GPBBP2与抗GPBBP3建立的反应体系检测人GPBB具有特异性。3．双抗体夹心ELISA法检测200例正常人标本皆为阴性，P/N值范围为0-2.1，平均为0.96；3例心梗患者标本为强阳性，P/N均值为7.4；649例体检标本626例为阴性，占96.46%，23例为阳性或强阳性，占3.54%。阳性者以不稳定性心肌缺血患者最多，为9例，P/N值为2.5-12.9，平均8.0。结论：1．本文以多参数预测的抗原表位比较准确，以此为根据合成的复合肽抗原免疫动物制备了高效价的抗体，抗体即可与天然抗原反应，也具有高度的特异性。2．经临床初步检测表明，在心梗等心肌缺血性疾病时血清GPBB水平可明显升高，当P/N≥2.1时，应怀疑有心肌缺血。因此血清GPBB水平可作为缺血性心肌损伤等疾病的辅助诊断指标。
黄榕翀, 张嘉宁, 周旭晨, 方唯一, 朱正美[2]2005年在《糖原磷酸化酶同工酶BB测定方法的建立及其在急性冠脉综合征诊治中的价值》文中提出[目的]分离纯化糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB),建立血清GPBB定量测定方法,探讨其在急性冠脉综合征早期诊断及治疗中的价值。[方法]应用纯化GPBB抗原及其抗体建立GPBB定量测定方法。对34例健康人、28例不稳定心绞痛(UAP)患者和29例急性心肌梗死(AMI)患者分别进行血清GPBB、CK、CK-MB及cTnI测定。[结果]GPBB被纯化100倍,比活性384μmol/mg.min-1,回收率28%。建立了GPBB定量测定方法,确定抗原检测线性范围为0.3~20ng。在AMI发作6h内,患者血清中(n=26)GPBB浓度超过正常上限值7.4μg/L。GPBB诊断灵敏度是89.7%,明显高于CK、CK-MB(24.1%,20.8%,P<0.01),与cTnI相当。AMI患者血清GPBB峰值水平(66.38±27.41μg/L)明显高于健康人(2.57±1.61)μg/L,P<0.01。28例UAP患者中21例血清GPBB升高≥7.4μg/L,其均值是(23.2±14.2)μg/L,明显高于健康人和稳定心绞痛患者血清GPBB水平(P<0.01),与cTnI诊断阳性率相似,而UAP患者血清中CK、CK-MB均无明显升高。其中GPBB升高组(≥7.4μg/L)4周内发生心性事件远高于GPBB<7.4μg/L组(47.6%,14.3%,P<0.01)。AMI患者血清GPBB到达峰值时间早于CK和CKMB达到峰值时间。[结论]GPBB是AMI发作后6h内敏感特异的生化指标,对判断UAP预后有一定的临床价值。
参考文献：
[1]. 抗人糖原磷酸化酶BB抗体的制备临床应用[D]. 张海谱. 河北医科大学. 2003
[2]. 糖原磷酸化酶同工酶BB测定方法的建立及其在急性冠脉综合征诊治中的价值[J]. 黄榕翀, 张嘉宁, 周旭晨, 方唯一, 朱正美. 大连医科大学学报. 2005