论文摘要
细菌利用各种机制来精确地调节自身行为,以响应环境的变化,从而促进细菌生长、生存和侵染。Sigma（σ）因子就是其中一类影响基因表达转录调控的全局信号调控系统。σ因子作为RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）的重要组成部分,负责识别特异的启动子序列,提高RNA聚合酶辨认启动子的能力。细菌募集各类σ因子调控基因表达,响应不同的环境信号,如温度、渗透压、酸碱、重金属等各种胁迫等。基于结构和功能上的差别,σ因子可分为两类:σ54家族和σ70家族。十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campstris,Xcc）是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要植物病原细菌。本研究对Xccσ因子在致病中的调控作用进行了研究,为进一步阐明Xcc 8004菌株的致病机理提供基础。基于已经测序的Xcc8004基因组序列,我们利用SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http://smart.embl-heidelberg.de）分析预测得到 15 个 σ 因子:XC1311（RpoN1）和 XC2251（RpoN2）属于σ54家族,其它13个σ因子属于σ70家族,其中XC3806（RpoD）属于 group 1,XC3843（RpoH）和 XC2281（FliA）属于 group 3,XC0556（RpoE9）、XC1193（RpoE6）、XC1474（RpoE5）、XC2566（RpoE4）、XC2905（RpoE3）、XC2934（RpoE7）、XC2974（RpoE1）、XC3099（RpoE10）、XC3383（RpoE2）和XC3864（RpoE8）属于group 4,即 ECF（extracytoplasmic function）家族。为研究Xcc中各σ因子的致病性,实验中构建了各σ因子的缺失突变体及互补菌株。在构建缺失突变体过程中只能得到其中13个σ因子的突变体,而无法获得XC3806和XC3843缺失突变体;当在Xcc 8004菌株中导入质粒增加了 XC3806和XC3843的拷贝数时,可以分别将其从基因组上敲除。说明XC3806和XC3843在NYG培养基、28℃培养条件下是Xcc生长所必需的。通过剪叶接种法检测了各σ因子突变体的致病性,结果发现只有rpoE1突变体ΔrpoE1在寄主植物满身红萝卜（Chinese radish（Raphanus sativus）Manshenhong）上引起的病斑长度相较于野生型显著降低;叶内生长实验发现突变体ArpoE1在满身红萝卜叶内生长的菌落数明显少于野生型,表明rpoE1影响Xcc 8004在寄主植物满身红萝卜上的致病力。将各突变体进行过敏反应（Hypersensitive response,HR）检测,发现突变体ΔrpoE1在非寄主植物ECW-10R（Capsicum annuum cv.ECW-10R）上引起HR反应的时间明显延迟和显著减弱,且其顺式互补可以补回野生型表型,说明rpoE1参与了Xcc 8004在非寄主植物上的HR反应。既然rpoE 影响 Xcc HR,而 HR 是 hrp（hypersensitive response and pathogenicity）编码的 Ⅲ 型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）的重要特征表型。为此,检测了 RpoE1对Xcc hrp T3SS相关基因的调控作用。qRT-PCR和GUS报告系统检测结果显示,RpoE1正向调控hrp关键调控基因hrpX、hrp基因簇和Ⅲ型效应物（type Ⅲ secreted effector,T3SE）基因XC0241和XC1553的表达,但是不影响另一hrp关键调控基因hrpG的表达。将质粒pR3X导入突变体ΔrpoE1中得到hrpX组成型表达菌株ΔrpoE1/pR3X,对ΔrpoE1/pR3X进行了 HR检测,结果显示,组成型表达的hrpX可以完全恢复rpoE1突变体在非寄主植物ECW-10R上引起HR的能力;通过qRT-PCR对ΔrpoE1/pR3X中hrp基因簇和效应物基因的表达进行了检测,结果表明ΔrpoE1/pR3X中hrp基因簇和效应物基因的表达水平得到了恢复,进一步说明了 RpoE1正调控hrp基因和效应物基因是通过调控hrpX进行的。另外,GUS检测和qRT-PCR分析结果显示,rpoE1的表达不受HrpG的调控,但是受基本培养基和植物信号诱导。为进一步研究RpoE1正调控hrpX表达的分子机制,本研究利用RNA 深度测序技术（RNA deep sequencing,RNA-seq）对野生型 Xcc 8004及rpoE1缺失突变体ΔrpoE1进行了转录组测序分析。结果显示,在诱导培养基XCM1培养条件下,共有131个基因受到RpoE1的调控,其中21个基因上调,110个基因下调。通过半定量RT-PCR验证转录组测序结果,发现半定量RT-PCR结果与转录组数据一致。分析RpoE1调控元基因启动子区序列特征,发现包括hrpX在内的部分基因其启动子区含有“GNWWTTYYGMWKTT（N（A/T/C/G）,W（A/T）,Y（C/T）,M（A/C）,K（G/T））”特征序列。通过对hrpX 启动子的随机点突变研究也发现这一特征序列影响RpoE1对hrpX的调控。进一步对该特征序列进行定点突变,结果证实RpoE1对hrpX的调控依赖“GNWWTTYYGMWKTT”特征序列。暗示RpoE1可能通过与这一特征序列特异结合实现对hrpX的调控。为此本研究检测了 RpoE1在体内和体外与hrpX启动子区的结合。利用qRT-PCR对rpoE1过表达菌株8004/pJrpoE1中hrpX的表达量进行了检测,结果表明体内过表达rpoE1后hrpX的表达量显著提高;体外转录实验时向转录体系中加入RpoE1蛋白后hrpX的转录量也随之增加,说明RpoE1可以增强hrpX的转录。染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP）实验结合 PCR分析显示hrpX启动子区可以连同RpoE1蛋白一起洗脱下来,说明在体内时hrpX启动子区可以与RpoE1蛋白结合;体外凝胶电泳迁移率检测（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）实验结果显示,加入RpoE1蛋白后,hrpX启动子的迁移率明显降低,表明RpoE1可以与hrpX的启动子区特异结合。本研究还检测了 Xcc 8004中10个ECF σ因子对不同环境的耐受性的响应。通过对不同浓度重金属离子、氯化钠、SDS、苯酚、H2O2和不同酸碱度胁迫的耐受性检测,发现ECF σ因子的十基因缺失突变体Δ10与重金属离子、SDS、苯酚及碱胁迫相关。进而再对Δ10的单基因互补菌株进行了检测以确定各个ECF σ因子在环境胁迫中的作用,检测结果表明rpoE1和rpoE4与Cu2+胁迫相关;rpoE1、rpoE3、rpoE4和rpoE7与Cd2+胁迫相关;rpoE1、rpoE2、rpoE3、rpoE8和rpoE10与Zn2+胁迫相关;rpoE1、rpoE2、rpoE5、rpoE7、rpoE8和rpoE10与SDS胁迫相关;rpoE1和rpoE10与苯酚胁迫相关;rpoE1、rpoE2、rpoE3、rpoE4、rpoE5、rpoE6、rpoE7、rpoE9 和 rpoE10 与碱胁迫相关。本实验对Xcc8004中的σ因子进行了系统性的研究,确定了 Xcc 8004中有两个生长必需的σ因子;其中XC2974（rpoE1）影响Xcc致病性和HR,正向调控hrp及Ⅲ型分泌系统,发现并确认了其调控hrpX的调控特征位点,RpoE1蛋白可以增强hrpX的转录并且可以与hrpX启动子结合;并确认了不同的σ因子参与到不同的抗逆中。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 阳丽艳
导师: 唐纪良
关键词: 十字花科黑腐病菌,致病性
来源: 广西大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,农业基础科学,植物保护
单位: 广西大学
分类号: S432.4
总页数: 166
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标签：十字花科黑腐病菌论文; 致病性论文;