利用CRISPR-Cas9技术敲除MAS1基因的质粒构建与酶切方案优化的研究

论文摘要

CRISPR-CAS9技术是新一代基因编辑技术,可简便快捷地对哺乳动物细胞进行指定基因的敲除,实现沉默外源基因表达的目的。但传统的CRISPR-CAS9技术提供的酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。本实验通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,继而通过胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。研究结果说明:BbsⅠ酶与px459质粒比值为1μL:500 ng,酶切体系为50μL,酶切时间为45 min时,酶切效果最佳、胶回收率最高,且此时目的基因在细胞内的表达量为0,确定该实验条件下目的基因被成功敲除。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 孙芳,廖维芳,张洋洋,赵瑞强,贺淑嘉,廖志红,林文珍

关键词: 技术,优化,酶切效率,胶回收效率

来源: 基因组学与应用生物学 2019年04期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学

单位: 广西医科大学生物化学与分子生物学教研室,广西高校生物分子医学研究重点实验室

基金: 国家自然科学基金项目(81660464),广西自然科学基金项目(2016GXNSFAA380275)共同资助

分类号: Q78

DOI: 10.13417/j.gab.038.001552

页码: 1552-1559

总页数: 8

文件大小: 377K

下载量: 359

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