侯文萃[1]2006年在《烟草和水稻病程相关蛋白基因的克隆与功能分析》文中提出植物在受到一些化学物质的诱导、盐害、病原物(如真菌、细菌、病毒)的侵染等逆境胁迫时,会发生一系列防卫反应,往往产生出一些新的蛋白质,即所谓的病程相关蛋白( pathogenesis-related protein,PRP)。根据最新的研究结果可知,PR蛋白可分为PR1、PR2、PR3、PR4等共17类,除PR1与抗真菌的关系比较密切外,其它PR蛋白的生物学功能,如抗盐、抗病毒等都有不同的报道。利用转基因技术对不同的PR蛋白基因进行功能分析,特别是其在抗病方面的研究已成为该领域的热点之一。本研究在克隆烟草病程相关蛋白PR1b基因(NCPR1b)、PR4a基因(NCPR4a)、水稻RSOsPR10基因(RSOsPR10)的基础上,构建了不同类型的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化了普通烟草(Nicotiana tabacum NC89)、叁生烟草(Nicotiana tabacum L.cv Samsun),获得了一系列转基因植株,并对这些转基因烟草的T1代植株进行了抗盐、抗病等生物学功能分析。主要实验结果如下:1.根据已报道基因序列,设计特异引物,利用RT-PCR,从普通烟NC89中克隆得到NCPR1b基因、NCPR4a基因,cDNA大小分别为506bp、460bp;从水稻(中花11)中克隆得到RSOsPR10基因,cDNA大小为586bp。2.构建了含NCPR1b基因的叁种植物表达载体,即含正义NCPR1b基因的载体pBI-Z-PR1b、含反义NCPR1b基因的载体pBI-F-PR1b、含有核基质结合序列(MAR)的正义NCPR1b基因载体pMR-PR1b;构建了含正义NCPR4a基因的载体pBI-PR4a ;构建了含正义RSOsPR10基因的载体pROKⅡ-PR10。3.以普通烟草NC89为转化受体,采用农杆菌介导的方法,将pBI-Z-PR1b和pBI-PR4a分别转化,获得了两类转基因烟草植株,即含有pBI-Z-PR1b的转基因NC89(T-1),含有pBI-PR4a的转基因NC89(T-4);以叁生烟草为转化受体,采用农杆菌介导的方法,分别将NCPR1b基因的叁种植物表达载体、正义NCPR4a基因的载体、正义RSOsPR10基因的载体转化,获得了五类转基因烟草植株,即含有pBI-Z-PR1b的转
朱廷恒[2]2003年在《水稻编码病程相关蛋白PR-4和葡聚糖酶基因的克隆与鉴定》文中研究指明病原物的侵染或某些化学诱导剂的处理都会激活植物自身的抗病防卫反应。植物防卫反应中，病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PR proteins)的大量表达是一个显着特征。研究表明，PR基因的表达水平和抗病性之间紧密相关，有些PR蛋白在体外就有抗菌活性并且转PR蛋白基因的植物能提高抗病性。因此，PR蛋白基因的表达常作为分子水平上抗病反应的标志。化学诱导剂苯并噻二唑(benzothiadiazola, BTH)可诱导水稻产生系统获得抗性(systemic aquired resistance, SAR)，提高对稻瘟病和白叶枯病等的抗病性。本文报道了水稻中受BTH诱导表达的两个病程相关蛋白基因OsPR-4a和OsGlu的克隆和鉴定。 从水稻受BTH诱导表达的差减杂交cDNA文库中，选择一个预测编码PR-4蛋白的差别表达克隆bnhn-n18，以水稻受BTH诱导表达的全长cDNA文库DNA为模板，以基因特异引物和载体通用引物，通过PCR克隆了OsPR-4a的cDNA的缺失端。根据已知序列和克隆的缺失端序列拚接出OsPR-4a的全长cDNA。OsPR-4a全长cDNA为739bp，预测编码一个有151个氨基酸组成的蛋白，推测的分子量和等电点分别为16.47kD和4.42。从等电点看，OsPR-4a为一酸性蛋白。同源性分析表明，推测的OsPR-4a蛋白与已知的其他植物PR-4类蛋白在氨基酸水平上有大于60％的一致性。其中与大麦的PR-4蛋白相似性最高，达83％。OsPR-4a具有一个主要的结构域Barwin domain，属于Barwin家族。预测OsPR-4a蛋白N端的前25个氨基酸可能为信号肽并负责蛋白的胞外分泌。它与Barwin家族蛋白序列的一个显着特征是有6个保守的半胱氨酸，并能形成3个二硫键。根据OsPR-4a基因cDNA的非编码区序列设计引物对，经PCR扩增了其基因组序列，发现有一个944 bp的内含子。Sourthern分析表明，OsPR—4a以单拷贝存在于水稻基因组。 以Northern blot分析比较了供试的水稻抗病和感病近等基因系在稻瘟菌接种后OsPR-4a表达的差异。在不亲和互作中，接种36 h检测到OsPR-4a的表达；而亲和性互作在供试时间内没有检测到表达。对水稻稻瘟病感病品种幼苗在0.3mmol／L BTH处理后24 h作Northern blot分析，检测到OsPR-4a表达，而水处理对照在 48 h内未检测到表达。以 RTPCR检测 OsPR－4a在水稻SAR 中的表达动态，结果表明：水稻感病品种幼苗，在稻瘟菌接种后 36 hOsPR－4a表达量最高，72 h略有降低：在 0．3 mmol／L BTH处理 3 d后接种稻瘟菌，接种 3 6 h后 OsPR－4a表达量升高，并持续到 72 h。以上结果表明，水稻OsPR4a基因能被SAR诱发剂BTH和稻瘟病菌的侵染诱导表达，而且在水稻受BTH诱导处理后，稻瘟病菌的挑战接种能进一步强化该基因的表达。 克隆的水稻OsPR－4a基因在大肠杆菌中得到了表达，纯化的表达蛋白在体外对水稻稻瘟菌（M中卯porthe gFisea）和纹枯菌（Rh拓octonia solani）的生长都有一定的抑制作用。在抑菌实验中，对抑菌圈边缘的菌丝形态进行显微观察后发现，与正常菌丝相比，稻瘟病菌和纹枯病菌的菌丝有畸形和不规则扭曲。 用一对根据OsPR．4a基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到 OsPR下a基因上游 2257 hp的启动子序列。用 PLACE软件分析顺式作用元件，发现 OsPR－4a基因起始密码子上游 1．5 kb的区域内存在几个可能与 PR蛋白基因表达调控相关的顺式作用元件，如 W盒、PALboXA、GT结合序列、Dof结合序列和 Mybstl元件等。将 OsPR一a基因启动子区域及其 5’部分缺失构件与圳Z报道基因相连，并克隆进pCAMBIA139lZ载体中，用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR一a基因表达中的功能。 本研究还从水稻受BTH诱导表达的差减杂交CDNA文库中，选择一个预测编码p－l，3－葡聚糖酶的差别表达克隆bihn－nlo，以水稻受BTH诱导表达的全长CDNA文库DNA为模板，以基因特异引物和载体通用引物，通过PCR克隆了 OsGlu的 5’缺失端。用已知序列和Genebank搜索的该基因EST序列拚接出仇oU的全长c＊＊A。OSOS的全长。＊＊A为2们4抑，预测的0＊F编码一个有470个氨基酸组成的蛋白，推测的分子量和等电点分别为 50．3 kD和5．77。同源性分析表明，推测的OSGlll蛋白与己知的其他植物pl，3－葡聚糖酶有相似性，属于糖基水解酶家族 17哈lycosyl hydrolaseS family 7人
苏亚春[3]2014年在《甘蔗应答黑穗病菌侵染的转录组与蛋白组研究及抗性相关基因挖掘》文中认为甘蔗(Saccharum officinarum)是最重要糖料作物,蔗糖占我国食糖总产92%。病害是影响甘蔗产量和质量的重要因素,甘蔗黑穗病(Sporisorium scitamineum)是世界各植蔗区最主要的病害之一,也是我国甘蔗栽培上最重要的病害,种植抗病品种是控制该病最经济、最有效的措施。前人从相关细胞学、形态学、生理生化及抗病性遗传方面,探讨了甘蔗对黑穗病的抗性机制。目前,有关甘蔗响应黑穗病菌侵染的分子机制研究,基本还停留在以抗病甘蔗基因型接种病原后的材料进行个别几个差异表达基因的克隆与定量表达研究,这些研究初步反映了甘蔗抗黑穗病菌的分子机制受到多基因网络系统的调控,分子水平的机理与机制研究有待继续深入。利用高通量的技术手段,从转录组学和蛋白组学水平上,研究甘蔗对黑穗病菌胁迫的应答反应,有助于从整体上揭示甘蔗响应黑穗病菌侵染的代谢通路和分子调控网络,也有助于筛选与鉴定起关键作用的基因。本研究建立了一种基于实时荧光定量PCR技术检测甘蔗黑穗病菌的方法,在黑穗病症状未出现前快速、灵敏地检测病原菌,为甘蔗黑穗病菌的快速检测和早期预防提供依据。此外,以甘蔗黑穗病抗性基因型崖城05-179和感病主栽品种"ROC”22为植物材料,通过病原菌胁迫,建立了甘蔗—黑穗病菌之间的不亲和与亲和互作系统,利用高通量RNA-Seq测序技术与iTRAQ技术,通过多点时序比较,分析甘蔗响应黑穗病病原菌胁迫过程中,同一甘蔗基因型不同接种时间点和不同甘蔗基因型不同接种时间点的mRNA及蛋白表达水平的变化,构建甘蔗应答黑穗病菌侵染的表达谱,对于从分子水平上揭示甘蔗抗黑穗病性机制具有重要的理论指导和实践意义。实验还筛选鉴定了3类抗性相关基因,包括p-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)、几丁质酶基因(chitinase)和过氧化氢酶基因(catalase),旨在为甘蔗抗病分子育种提供优异基因资源。初步研究成果如下：1.甘蔗黑穗病是一种真菌性病害,在蔗区广泛流行,该病菌的早期诊断和准确检测将有助于该病害的治理。针对黑穗病菌bE基因(b East mating-type, GenBank登录号为U61290.1)设计特异性的实时荧光定量PCR检测引物(bEQ-F/bEQ-R)与TaqMan探针,其检出限为10ag bE质粒DNA和0.8ng甘蔗基因组DNA,比传统PCR(检出限为10fgbE质粒DNA和100ng甘蔗基因组DNA)更灵敏。实验通过检测人工接种甘蔗组培苗(FN40)进一步验证TaqMan技术的可靠性,结果显示,该技术在病原菌感染初期(12h)能够检测到黑穗病菌,适用于甘蔗无病种茎和幼苗的诊断。此外,通过不同甘蔗抗/感基因型(崖城05-179和"ROC"22)受黑穗病菌侵染后的定量检测实验,结果表明,该TaqMan技术具有进一步开发成为评价甘蔗基因型对黑穗病抗性技术的潜力。总的来说,所建立的技术体系可作为检测和诊断甘蔗黑穗病原菌的工具,实现灵敏、准确、快速和定量检测的目的。2.以甘蔗抗黑穗病无性系崖城05-179和感黑穗病品种"ROC"22蔗芽为材料,以清水处理24h时间点为对照,对接种甘蔗黑穗病菌24h、48h和120h时间点的蔗芽进行Illumina RNA-Seq (测序)。借助维恩图(Venny diagram),通过多点时序比较,分析甘蔗响应黑穗病病原菌侵染过程中,同一基因型不同时间点和不同基因型同一时间点的差异基因表达变化,构建了甘蔗响应黑穗病病原菌侵染过程的转录组表达谱。主要结果如下：(1)8个甘蔗样品转录组测序共获得36.68Gb数据,181,603,016对reads.分样品de novo组装后共获得148,605条Unigene,其中长度在500bp以上的有46,525条,长度在1.0kb以上的有20,798条；合并测序数据de novo组装后共获得99,824条Unigene,其中长度在500bp以上的有47,345条,长度在1.0kb以上的有22,091条。进行基于合并组装Unigene库的基因结构分析,包括ORF预测、SSR(simple sequence repeat)分析以及样品间SNP (Single Nucleotide Polymorphism)分析,获得SSR标记5,095个。将Unigene与NT、NR, SwissProt、TrEMBL、COG、GO和KEGG数据库进行比对,共获得65,852条Unigene的生物信息学注释结果。另有33,972条Unigene(34.03%)未被注释到,推测该部分序列可能是新转录本,需进一步验证。本实验构建的转录组数据库可为甘蔗其他相关研究的基因注释提供参考。(2)进行各样品中基因表达量和差异表达基因的分析,以及对差异表达基因进行模式聚类、功能注释和富集性分析,并通过Q-PCR进行验证。结果显示：①黑穗病菌侵染后,两个甘蔗基因型被诱导的大多数差异表达基因和代谢通路都是常见的,几乎涵盖整个生命活动的各个方面。比对上的Unigene涉及细胞组件(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物过程(biological process)等功能。在此分析基础上,获得了与抗性相关的功能注释信息,如信号转导机制(Signal transduction mechanisms)、能量产生与转导(Energy production and conversion)、离子转运机制(Inorganic ion transport and metabolism)和防御机制(Defense mechanisms)等。Pathway聚集分析显示,差异基因参与了包括植物激素信号转导途径(Plant hormone signal transductio)、类黄酮生物合成途径(Flavonoid biosynthesis)、植物与病原菌互作途径(Plant-pathogen interaction)和细胞壁防御途径(Cell wall fortification pathway)等抗病相关代谢途径。可见,黑穗病菌激发了甘蔗多种抗病途径、差异表达基因涉及防御反应及信号转导等,提示甘蔗对黑穗病病原菌侵染响应的分子机制受到多基因网络系统的调控。②随着接种黑穗病菌时间的延长,激活的甘蔗差异表达基因数目增多,且上调表达的差异基因明显多于下调表达的差异基因。黑穗病菌在崖城05-179和"ROC"22中诱导的差异基因在很大程度上是相同,但总的来说,崖城05-179中分析到的显着性抗病相关代谢通路明显多于"ROC"22,且抗性相关基因的转录表达时间(24h～48h)较"ROC"22的(48h-120h)早,此外,抗病品种中差异转录本的上／下调表达情况相对较丰富,提示它们在非亲和互作中表现抗性特异性以及较早的时序性。以上应答黑穗病菌的甘蔗转录本潜在功能的分析,有助于我们更深入研究这些候选基因在甘蔗响应黑穗病病原菌侵染中的作用,同时也为开展甘蔗抗病功能基因组学研究奠定基础。3.在转录组学研究的基础上,以抗病和感病基因型接种黑穗病菌48h时间点的蔗芽为材料,利用iTRAQ技术,研究其蛋白组学的变化。结果表明：鉴定到的蛋白数量为4,251个,其中崖城05-179筛选到的差异表达蛋白有273个,“OC"22有341个。差异蛋白显着富集于苯丙氨酸代谢、苯丙烷类生物合成、次级代谢产物生物合成、苯并恶嗪生物合成、脂肪酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成代谢通路中等,这些代谢通路直接或间接参与甘蔗对黑穗病菌的抗病反应。崖城05-179的蛋白组与转录组的关联性为0.1502,而"ROC"22的关联性为0.2466。甘蔗抗病和感病基因型中筛选出的与转录组关联的差异蛋白数分别为27个和10个,与差异基因表达趋势相同的差异蛋白的数量分别只有18个和10个,但均为关联上调表达,且其中近半数以上的关联差异蛋白与植物抗逆性密切相关,如过氧化物酶、病程相关蛋白PR-1、p-1,3-葡聚糖酶、热休克蛋白和植物凝集素等。研究结果为后续确定深入研究的代谢通路以及关键蛋白的鉴定提供依据。4.甘蔗响应黑穗病菌胁迫后,在转录组测序结果中,发现病程相关蛋白(pathogenesis related proteins)的转录本差异表达,涉及10个葡聚糖酶基因(Glucanase)、26个几丁质酶基因(Chitinase)和1个过氧化氢酶基因(Catalase)。蛋白组与转录组关联分析结果也揭示了病程相关蛋白PR-1和p-1,3-葡聚糖酶等被甘蔗黑穗病菌诱导上调表达。植物病程相关蛋白是在某种病理或者与病理相关的环境条件下,植物体内诱导产生的的特异蛋白质,这些蛋白质在植物抗病反应过程中起重要作用,和植物系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)紧密相关。本研究根据该3类典型PR蛋白的差异转录本信息,借助RT-PCR技术从甘蔗中分离出2个β-1,3-葡聚糖酶基因ScGluA1和ScGluD1、1个几丁质酶基因ScChi和1过氧化氢酶基因ScCATl。通过Q-PCR技术,分析差异表达基因在黑穗病菌侵染甘蔗过程中的时空表达特性,并应用基因工程手段,进行融合蛋白亚细胞定位及目的基因遗传转化研究,为后续甘蔗抗黑穗病遗传改良提供优异基因资源。(1)p-1,3-葡聚糖酶可以水解病原真菌细胞壁的主成分p-1,3-葡聚糖,已被证实在植物—病原菌互作中被诱导表达,且参与植物防御反应。本研究中,接种黑穗病菌后,甘蔗β-1,3-葡聚糖酶活性在抗病品种中较感病品种增加速度快且维持时间长,表明β-1,3-葡聚糖酶可能与甘蔗抗黑穗病性之间呈正相关。此外,实验从甘蔗接种黑穗病菌后的材料中,克隆到两个β-1,3-葡聚糖酶基因ScGluA1(GenBank登录号为KC848050)和ScGluD1(GenBank登录号为KC848051)。ScGluAl和ScGluD1推导的编码蛋白均存在糖苷水解酶第17家族的保守结构域,但两者之间的氨基酸序列一致性只有29.25%。系统发育树分析显示,ScGluA1和ScGluD1分别隶属于β-1,3-葡聚糖酶亚家族A和亚家族D。采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,将携带目标基因和报告基因(绿色荧光蛋白,GFP)的重组菌株侵染洋葱表皮细胞,结果显示ScGluA1和ScGluD1定位于细胞外或质膜上。所构建的含pET32a-ScGluA1或pET32a-ScGluD1的Rosetta (DE3)菌株原核表达细胞,在添加NaCl、CdCl2、PEG、CuCl2或ZnS04的培养基中,表现出不同的耐受性。Q-PCR分析结果表明,ScGluA1在应答黑穗病菌中上调表达, ScGluD1基因小幅下调表达,暗示ScGluA1可能涉及甘蔗对黑穗病菌的防御反应,而ScGluD1可能被抑制。受其他环境因子(如水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸、NaCl、CdCl2和自然干旱胁迫)处理后,ScGluA1和ScGluD1的基因表达模式与生物胁迫类似。在烟草中过表达ScGluA1,对烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和烟草灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)有抑制效果,且转ScGluA1烟草T0代植株叶片β-1,3-葡聚糖酶粗酶液,对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的菌丝生长有一定的抑制作用。总的来说,β-1,3-葡聚糖酶可能作为甘蔗对黑穗病菌防御机制中的一个组分。ScGluA1的积极应答或许对甘蔗抗病性和抗逆反应有益,而ScGluD1的消极应答,显示其在甘蔗响应生物和非生物胁迫中,可能发挥不同的作用。(2)许多植物与病原菌互作会诱导产生几丁质酶(EC3.2.2.14),报道显示其与植物防御病原菌相关。本研究发现,几丁质酶活性与甘蔗黑穗病抗性之间呈正相关。实验克隆了一个Class Ⅲ几丁质酶基因ScChi (GenBank登录号为KF664180),编码一个31.37kDa多肽。亚细胞定位显示,ScChi定位于细胞核、细胞质和质膜上。Q-PCR结果表明,ScChi在叶和蔗皮组织中高度表达。受黑穗病菌侵染后,ScChi转录水平在抗病品种中较感病品种高,且维持时间较长。ScChi同时受SA、H2O2、MeJA、ABA、 NaCl、CuCl2、PEG和低温(4℃)胁迫的诱导表达。ScChi瞬时表达后的目标基因的转录水平及6个本氏烟(Nicotiana benthamiana)免疫相关标记基因均上调,而与对照相比,过表达pCAMBIA1301-ScChi的本氏烟叶片经组织化学分析,结果显示出更深的DAB染色效果及更高的导电率,表明存在高水平的H2O2积累。此外,瞬时表达ScChi有助于提高烟草对青枯菌(Pseudomonas solanacearum)、茄病镰刀菌蓝色变种和灰葡萄孢菌的防御作用,同时,转ScChi烟草T0代植株叶片的几丁质酶粗酶液,可以抑制茄病镰刀菌蓝色变种的菌丝生长。这些结果暗示,ScChi的表达与植物免疫之间关系密切。总的来说,ScChi能积极响应生物和非生物胁迫,表明该基因在甘蔗中是一类与逆境胁迫相关的抗病基因。(3)过氧化氢酶是铁卟啉酶,它作为一种有效的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)清除剂,可以保护植物避免氧化损伤。过氧化氢酶的酶活性在甘蔗抗病品种(崖城05-179)应答黑穗病菌中总是高于感病品种(柳城03-182),表明过氧化氢酶活性可能与甘蔗黑穗病抗性呈正相关。为了从分子水平上了解过氧化氢酶的功能,实验从受黑穗病菌侵染的甘蔗材料中,分离到一个ScCAT1(GenBank登录号为KF664183)的cDNA序列。该基因预测编码492个氨基酸残基,其推导的蛋白序列与其他植物的过氧化氢酶同源性高。ScCAT1的重组大肠杆菌Rosetta细胞,在CuCl、CdCl2和NaCl的胁迫下长势更快,表明其耐受能力更强。Q-PCR分析结果显示,ScCAT1在蔗芽中的表达量相对较高,而在蔗皮和蔗髓的表达量中等。不同外源胁迫包括甘蔗黑穗病菌侵染、植物激素(SA、MeJA和ABA)处理、氧化胁迫(H2O2)、重金属(CuCl2)和高渗透(PEG和NaCl)胁迫,均诱导ScCAT1基因上调表达。亚细胞定位结果显示,ScCAT1定位在质膜和细胞质。此外,DAB、台盼蓝染色和电导率测定等组织化学分析表明,ScCAT1基因可能涉及甘蔗的免疫应答。总的来说,ScCAT1正响应生物和非生物胁迫的研究结果表明,ScCAT1参与保护甘蔗应答与氧化反应相关的环境刺激。
陈晓峰[4]2008年在《不结球白菜抗真菌病基因的克隆与表达分析》文中认为利用已知抗真菌蛋白基因的保守序列设计引物,获得了不结球白菜重要的抗真菌蛋白基因,为转基因研究、增强不结球白菜抗真菌病害奠定了基础。同时,利用cDNA-AFLP技术,从病原菌诱导处理的不结球白菜中筛选到一个重要的几丁质酶基因片段,通过RT-PCR和RACE技术,获得了该基因cDNA全长序列,序列分析发现与已知的不结球白菜几丁质酶基因具有较低的同源性。1.不结球白菜几丁质酶基因cDNA全长的克隆与诱导表达分析利用已发表的油菜几丁质酶基因序列设计引物,以不结球白菜抗霜霉病自交系‘苏州青'为实验材料,通过RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜几丁质酶基因的cDNA全长序列,命名为Bcchi,将该序列提交DDBJ,登录号为AB302323。序列分析发现,不结球白菜Bcchi基因核苷酸序列全长1068bp,编码268个氨基酸残基,其中包含24个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为28.7kD,等电点(pI)为8.28。Bcchi推导的氨基酸序列与油菜ChB4基因具有100%的同源性,与大白菜CHB4基因具有99%的同源性,与其它植物几丁质基因的同源性为59%-78%。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一个。实时定量PCR和Northern blot分析表明,该基因有低水平的组成型表达,霜霉病菌诱导处理后,叶片中该基因表达量迅速增加。组织表达特异性分析表明,霜霉病诱导24h后,该基因诱导表达最高的部位是叶片。数据表明该基因有可能参与植物对病原菌侵染的抗性反应。2.不结球白菜植物防卫素基因cDNA全长的克隆与诱导表达分析利用已发表的植物抗真菌蛋白和防卫素基因序列设计引物,以不结球白菜抗病自交系‘苏州青'为实验材料,通过RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜植物防卫素基因的cDNA全长序列,命名为BcAF,将该序列提交DDBJ,登录号为AB302324。序列分析发现,不结球白菜BcAF基因核苷酸序列长450bp,编码79个氨基酸残基,其中包含29个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为8.56kD,等电点(pI)为8.15。BcAF推导的氨基酸序列与油菜AFP3基因(GenBank登录号AAB03224)具有100%的同源性,与萝卜AFP3(EMBL登录号CAA65984)基因具有96%的同源性,与其它植物防卫素基因的同源性为82%-88%。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一个。实时定量PCR和Northern blot分析表明,该基因有低水平的组成型表达,霜霉病菌诱导处理后叶片中表达量迅速增加。组织表达特异性分析表明,霜霉病诱导12h后,该基因诱导表达最高的部位是叶片。数据分析表明该基因可能参与植物对病原菌侵染的抗性反应。3.不结球白菜BcPR4基因cDNA全长的克隆与诱导表达分析利用已发表的大白菜PR4基因序列设计引物,以霜霉病病原菌诱导处理后的不结球白菜‘苏州青'为实验材料,通过RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜PR4基因的cDNA全长序列,命名为BcPR4,将该序列提交DDBJ,登录号为AB325873。序列分析发现,不结球白菜BcPR4基因核苷酸序列全长637bp,编码140个氨基酸残基,其中包含21个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为15.5kD,等电点为8.13。不结球白菜PR4蛋白与大白菜PR4基因氨基酸序列的同源性为100%,与其它植物PR4基因氨基酸序列同源性为63-75%。Southern杂交分析表明该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。实时定量PCR分析表明,SA和霜霉病菌诱导处理后24h和48h,该基因的表达量达到高峰。数据分析表明该基因可能参与对病原菌侵染的抗性反应。4.不结球白菜新型几丁质酶基因的克隆与表达分析利用cDNA-AFLP技术,我们从不结球白菜中获得了一个受真菌诱导的几丁质酶基因。该基因是从霜霉病菌诱导的叶片mRNA中分离到的。在对侵染过程进行检测的时候,我们发现一个未在对照植株叶片中转录表达,却在Peronospora parasitica诱导12h以后的叶片中转录表达的特异片段,通过RT-PCR和RACE技术,获得了该基因全长序列。序列分析发现,该基因为典型的几丁质酶基因。该基因核苷酸序列长1070bp,编码278个氨基酸残基,其中包含30个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为30kDa,等电点(pI)为8.92。推导的氨基酸序列与其它几丁质酶蛋白同源性较低,命名为Bcenchi,将该序列提交DDBJ,登录号为AB369105。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一个。实时定量PCR法对两种真菌(霜霉病菌和黑斑病菌)以及两种信号传导物质SA和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导该基因表达进行分析。结果表明Bcenchi参与寄主对病原菌侵染的抗性反应。
高玉龙[5]2006年在《棉花防卫反应相关基因类似物的克隆与特征分析和受黄萎病诱导表达的两个全长cDNA的获得》文中提出植物在自然界中受到许多病原物的威胁，如病毒、细菌、真菌、线虫等。棉花是重要的经济作物，棉纤维是主要的纺织原料。而棉花的病害比较多，我国枯萎病、黄萎病尤其严重，给棉花生产造成很大的损失。实践证明，种植抗病品种是防治病害的最经济有效的方法。陆地棉是我国棉花的主栽品种，陆地棉抗枯萎病育种非常成功，但黄萎病抗病品种的培育一直是育种家的一大难题，主要原因在陆地棉中找不到免疫或高抗的黄萎病抗源。根据其他作物中克隆的抗病基因与防卫反应基因的信息，分离鉴定棉花抗病基因类似物(resistance gene analogs，RGAs)与防卫基因类似物(defense gene analogs，DGAs)，有助于直接克隆或开发与棉花抗病基因紧密连锁的标记，定位、克隆抗病基因，为培育抗病品种奠定基础。 本研究选用我国遗传研究和育种广泛利用的抗黄萎病品种海岛棉海7124(G．barbadense L．cv．Hai7124)为材料来克隆抗病基因类似物(RGAs)和防卫基因类似物(DGAs)。成功分离了79条核糖体结合位点(Nucleotide binding site，NBS)类RGAs，21条丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(Serine／Threonine kinase，STK)类RGAs和11条DGAs。棉花中已经报道的NBS类RGAs有143条，我们分离的79条NBS类RGAs中13条与已克隆的棉花RGAs没有序列相关性，其它66条序列与已克隆的棉花RGAs有85％～99％的序列同源性。将本研究分离的79条NBS类RGAs与先前克隆的143条RGAs进行聚类分析，所有这些NBS类RGAs可以分为十个亚类(Ⅰ～Ⅹ)，其中亚类Ⅸ的所有成员由本研究克隆的5条序列组成。与其它双子叶作物中得到的结果类似，我们分离的具有连续开放读框的NBS类RGAs依其氨基酸序列可以分为两类，具有Toll-白介素-1受体(Toll-Interleukin-1 receptor，TIR)与不具有该结构的non-TIR。这两类RGAs都存在NBS类RGAs保守的六个基元：P-loop、RNBS-A、Kin-2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL。鉴定了棉花TIR与non-TIR各自所特有的RNBS-A序列。为棉花R基因和NBS类RGAs的分
靳敏峰[6]2007年在《青花菜抗病基因同源序列及相关基因的克隆与表达分析》文中研究表明本文对青花菜抗病相关基因β-1，3-葡聚糖酶基因进行克隆，并对抗病基因同源序列进行了相关研究．主要内容如下：1．青花菜β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建根据其他植物的β-1，3葡聚糖酶基因保守域序列设计兼并引物，扩增出青花菜β-1，3葡聚糖酶基因的中心区段，结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列，经序列拼接获得了一个1277bp的cDNA，在GenBank中登录号为EF484879，定名为BObg。序列分析结果表明，该cDNA包含一个1056bp的开放读码框，编码352个氨基酸，其理论上的等电点PI=7．314，分子量MW=38．92KD，进化树分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1，3葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性。利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析，结果表明，该基因在霜霉病接种后48小时优势转录表达，未接种和接种后其它时期都呈低水平转录表达。利用PBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体，酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功。2．青花菜抗病基因同源序列的克隆与表达分析根据已克隆抗病基因(R-gene)与病程相关蛋白基因(PR)的保守域设计引物，对青花菜基因组DNA进行PCR扩增。获得了4个片段。同源性比较发现，该4个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA)，与已知R基因相应区段的氨基酸序列高度同源。与已知抗病基因聚类分析结果显示，该4个RGA序列属于不同类别。本研究成功获得了青花菜RGA序列，为进一步克隆青花菜的R基因奠定了基础。这些RGA既可进一步用于筛选青花菜的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于青花菜遗传图谱的构建。
朱慧[7]2007年在《产酶溶杆菌OH11菌株生防相关基因的克隆与表达》文中指出农业生产上由真菌、细菌、线虫引起的植物病害的防治一直是非常重要的环节。多数病害的防治主要依赖于化学农药的使用，但化学农药的大量使用容易对环境造成污染，危害人畜健康，同时造成病原菌抗性不断上升。而生物防治对人畜安全，对环境污染极少，有时对某些有害生物可以达到长期抑制的作用，使用方便，便于利用，近年来受到了广大的关注。产酶溶杆菌OH11菌株是从土壤中分离的一个生防菌株，革兰氏阴性菌，对由真菌、细菌引起的许多病害都有生防作用。它GC含量高，有滑移性，能产生许多胞外水解酶，如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、a-水解蛋白酶等，而酶的水解活性一直是生防菌株生防机制的重要研究内容之一。本研究根据已经报道的产酶溶杆菌生防基因的核酸序列进行分析，设计引物，从产酶溶杆菌OH11菌株基因组DNA中扩增出几丁质酶基因(chiA基因)、β-1，3-葡聚糖酶基因(gluA基因和gluC基因)和a-水解蛋白酶基因(a-lytic protease基因)，并克隆到表达载体pET21a(+)或pET30a(+)上。挑选阳性克隆，分别命名为BLChiA、BLGluA、BLGluC、BLaLP并测序。测序后发现OH11菌株中chiA基因与C3菌株和N4-7菌株的chiA基因在氨基酸水平上分别有97.24％和95.93％的同源性，96.85％和95.74％的相似性。β-1，3-葡聚糖酶基因中gluA基因与C3菌株和N4-7菌株的gluA基因在氨基酸水平上分别有98.06％和94.57％的同源性，96.77％和94.57％的相似性；gluC基因与C3菌株和N4-7菌株的gluC基因在氨基酸水平上分别有97.42％和96.12％的同源性，96.99％和95％的相似性。a-水解蛋白酶基因与菌株ATCC 29487和菌株ATCC 29478的a-水解蛋白酶基因在氨基酸水平上分别有90.77％和91.02％的同源性，92.93％和92.68％的相似性。将表达菌株大量培养，IPTG诱导后进行15％SDS-PAGE检测，压力破碎细胞后用Ni~(2+)柱纯化蛋白，将纯化后的蛋白作水解圈和抑菌圈实验发现纯化的蛋白均能产生水解圈，对水稻纹枯病菌菌丝的生长有抑制和水解效应。
李生萍[8]2017年在《核桃PR1与PR4基因的克隆及表达分析》文中指出核桃(Juglans regia)是胡桃科核桃属落叶落果乔木,属于多年生的经济树木。作为世界四大坚果之一,其核仁具有极其丰富的营养如富含优质的蛋白,多种矿质元素等营养物质,脂肪含量高,素有“木本油料之王”的称号。核桃种植面积在不断扩大,我国已成为世界第一种植大国,2012年核桃种植面积约为42.5万公顷,产量约为170万吨(联合国粮农组织FAO),但近年来,环境变化及病虫害的影响对核桃的生产和经济效益造成的巨大的损失,其中核桃细菌性黑斑病是细菌侵染引起的病害,又称黑斑病,该病害广泛分布在全世界所有主要的核桃产区,严重危害核桃的生产,病程相关蛋白(PRP)是重要的抗病响应蛋白,但在核桃中的鲜有报道。本研究以“香玲”核桃为研究对象,从核桃中克隆了PR1和PR4基因,利用生物信息学分析的方法比较了PR1和PR4基因,通过实时荧光定量技术,比较了两个基因在不同核桃品种冬芽中的表达水平,并分析了细菌性黑斑病病原菌侵染过程中PR1及PR4的相对表达量。本研究的主要结果如下:(1)通过T-A克隆得到核桃的PR1及PR4基因并测序确认了序列,通过BLAST、进化分析及多序比对分析,对这些蛋白的序列特征进行了初步分析。得到核桃的PRI基因与水稻、小麦的PR1基因同源性较高,核桃PR4基因与葡萄的PR4基因同源性较高。(2)核桃细菌性黑斑病严重危害核桃生产,细菌在冬季时潜伏在核桃越冬芽中,对PR1和PR4基因在不同核桃品种中的冬芽表达进行分析发现,PR1在西扶1、辽3、香玲及林3以冬芽中的表达呈现上调表达,而在契可和辽4中表达水平低于对照,呈抑制状态;PR4在西扶1、辽3、香玲、林3以及契可的越冬芽中呈现上调表达,在辽4冬芽中的表达呈抑制状态,表明不同品种核桃PR1及基因中的表达不同,进而预测不同品种的核桃抗病性不同。(3)采用针刺法接种方式对香玲及清香核桃叶片进行细菌性黑斑病病原菌的接种,对病原菌胁迫下的不同品种的核桃叶片进行抗逆性分析,结果表明PR1和PR4在不同品种的核桃接种病原菌后的表达量变化有很大差异,两个基因的相对表达量在清香和香玲中的变化趋势都呈现先上升后下降的趋势,并且在清香中基因的相对表达量明显高于香玲中的相对表达量。为进一步研究PR1和PR4在核桃中的功能奠定了基础。
魏琴[9]2004年在《麻疯树（Jatropha curcas）种子抗真菌蛋白及相关基因的分离、表达研究》文中进行了进一步梳理麻疯树(Jatropha curcas)为大戟科麻疯树属植物，其种仁含有丰富的蛋白质。分离、纯化抗真菌蛋白并检测其对提高植物抵抗病原真菌的潜力具重要意义。本实验从四川攀西地区的麻疯树种仁中纯化了一种B-1，3葡聚糖酶，分子量约为65.5 kD，叁亚基组成，非共价键结合，等电点为8.3。酶最适作用温度为40℃-50℃，最适pH为7。在4℃-55℃内以及pH 6-8范围内最稳定。该酶具特定的紫外光谱、荧光光谱和氨基酸组成。Western杂交显示麻疯树β-1，3葡聚糖酶仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布。 麻疯树β-1，3葡聚糖酶能不同程度地抑制水稻稻瘟病菌、玉米纹枯病菌、小麦赤霉病菌、玉米弯孢杆菌菌丝的生长、孢子的萌发与形成，其中对水稻稻瘟病菌的抑制作用最强而长效。光镜下经处理的水稻稻瘟病菌菌丝多数呈葫芦形，小麦赤霉病菌茵丝细胞内有黄色圆球状物分布。电镜观察处理菌丝的细胞壁均变薄。推测麻疯树β-1，3葡聚糖酶的抗真菌活性与其对菌丝细胞壁的分解作用有关，也可能与代谢的改变有关。麻疯树β-1，3葡聚糖酶对小白鼠毒性低，LD_(50)为2.226±0.52 g／Kg(95％的可信限)。在聚乙二醇介导下有特异凝集鸭血的作用。 麻疯树毒蛋白(curcin)能强烈抑制水稻稻瘟病菌、松赤枯病菌、玉米纹枯病菌、油菜菌核病菌和胶胞炭疽杆菌菌丝生长和孢子的产生。光镜下观察处理四川大学博士论文菌丝畸形。SDS一以GE显示，试验菌丝的蛋白质条带减少。推测curcin对菌丝生长和抱子萌发的抑制作用与curcin阻碍蛋白质合成有关。W七stem杂交检测到curcin仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布。 首次从麻疯树基因组中分离到与编码麻疯树毒蛋白(。uroin)的cDNA序列一致的开放阅读框(O盯)，证明了无内含子的存在。通过农杆菌介导将curcin基因导入烟草，经PCR和RT一PCR检测到curcin基因已整合到烟草DNA中，并在转录水平得到表达，转基因烟草对力枯丝核菌(R.:。lani)有一定的抗性。 首次从麻疯树叶中克隆了在水分、温度胁迫及真菌侵染条件下诱导表达蛋白JFIP的cDNA序列。JFIP前体蛋白O邢由927个核昔酸组成，编码309个氨基酸，带有42个氨基酸组成的信号肤，推测的分子量为34.9kD，等电点为6.56;成熟蛋白ORF由801个核昔酸组成，编码267个氨基酸，分子量为30.IkD，等电点5.25。 JFIP具特定的疏水区结构及特定的酶修饰位点，二级结构以Q螺旋为主，其叁级结构包括6个a螺旋和6个p转角。JFIP与班Ps的保守结构域有较高的同源性。W七stem杂交结果显示，麻疯树毒蛋白(curcin)的抗血清在4℃和50℃温度胁迫及松赤枯病菌、玉米弯胞病菌、小麦赤霉病菌侵染后的叶中识别了一条32kD左右的蛋白条带，而在根、茎中无。在10%一40%聚乙二醇 (PEG一6000)胁迫后的叶中识别了一条32kD和一条 65kD的蛋白条带。其中32kD的杂交阳性带的分子量与JFIP的预测分子量接近。我们推测该蛋白与JFIP有相关性。干早、高低温胁迫及病原真菌侵染下麻疯树蛋白质分子标记的存在，为逆境蛋白的研究奠定了实验基础。 将编码JF丁的成熟蛋白和前体蛋白的O盯分别定向克隆到pQE一30、pQE一31质粒后，转化大肠杆菌M巧菌株。经IPTG诱导，编码成熟蛋白的pQE一3压M表达出了N端融合了6xHis的融合蛋白，过量表达的蛋白主要以不溶性蛋白形式存在，其表达量占菌体总蛋白的25%。SDS一PAGE分析表明，表达产物的分子量约为31.9 kD。经研尼stem印迹分析，证实表达的蛋白可与RGS一His抗体和curcin抗兔血清发生专一性抗原抗体反应。包涵体经变性后又复性处理，用His TrapTMHP柱分离纯化，纯度可达电泳纯。体外抗真菌活性试验表明，复性处理后的JFIP融合蛋白使玉米弯抱菌和玉米纹枯菌的菌丝生长受到一定程度的抑制。而带信号肤的前体蛋白未能表达。该实验结果为信号肤功能研究及JFIP基因功能研究提供卖验基础。/乡
徐炎[10]2006年在《中国原产华东葡萄抗白粉病基因cDNA文库构建及其EST序列分析》文中研究指明葡萄白粉病[Uncinula necator(Schw．)Burr．]是影响世界葡萄生产的主要病害之一。育种实践证明，培育抗病品种是控制葡萄白粉病的经济有效途径。原产我国葡萄野生种华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)株系“白河-35-1”，在多年研究证明它对我国葡萄白粉病表现出极强的抗病性；对其抗白粉病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明抗病机制，而且对葡萄抗白粉病研究及抗病基因的育种利用具有重要价值。本研究以cDNA文库为基础，以测序为主线，结合生物信息学方法和PCR技术对获得的目标序列进行结构和表达分析，以期获得与抗病有关的EST序列和抗病相关基因。取得如下主要结果： 1．以中国原产华东葡萄株系“白河-35-1”为材料，于2003年7月8日上午8：00-10：00，在西北农林科技大学葡萄种质资源圃进行接种实验；在接种前，选取健康的华东葡萄株系“白河-35-1”的幼叶，用无菌蒸馏水喷湿接种叶片的上叶面，从高度感病的中国原产华东葡萄株系“湖南-1”上取感白粉病的叶片，用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌，接种后立即套袋。在接种后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d剪去1.0cm~2大小的幼叶叶片，立即放置液氮中，用SDS／酚法提取总RNA；用不同接种时间白粉病病原菌[U.necator(Schw.)Burr.]诱导的叶片分别提取总RNA，然后混合提取的RNA样形成总RNA构建华东葡萄叶片cDNA文库。文库初始滴度为3.0×10~5pfu／ml，重组率为96.9％，用包装后的原始文库直接转化寄主菌BM 25.8，转化效率为90％以上，插入片段主要分布在0.5-3.O kb之间，平均大小为900bp左右。 2．通过随机测序，获得了107条质量好的cDNA序列；并已登录GenBank数据库，登录号分别为：AY848693、DQ336280、DQ 336281、DQ 336282、DQ 336283、DQ 336284、DQ336285、DQ336286、DQ336287、DQ336288、DQ336289、DQ339462、DQ 339463、DQ 339464、DQ354157、DQ354158、DQ354159、DQ354160、DQ354161、DT646287、DT661587、DT 661588、DT661589、DT661590、DT661591、DT661592、DT661594、DT 661595、DT 661596、DT 661597、DT661598、DT661599、DT6615600、DT661601、DT661603、DT661605、DT661608、DT661610、DT 661611、DT661613、DT661614、DT661615、DT661616、DT661618、DT661619、DV182076、DV182077、DV182078、DV182080、DV182981、DV182082、DV182084、DV182085、DV182086、DV182087、DV182088、DV182089、DV182090、DV182091、DV182092、DV182093、DV182094、
参考文献：
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[10]. 中国原产华东葡萄抗白粉病基因cDNA文库构建及其EST序列分析[D]. 徐炎. 西北农林科技大学. 2006
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