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1型鸭肝炎病毒诱导鸭胚成纤维细胞自噬的研究

2020-12-02阅读(853)

1型鸭肝炎病毒诱导鸭胚成纤维细胞自噬的研究

论文摘要

1型鸭肝炎病毒（DHAV-1）属于小RNA病毒科禽肝病毒属,可引起感染雏鸭高度致死、传播迅速的急性传染病。细胞自噬是一种重要的清除病原体的细胞内途径。DHAV-1能否激活感染的宿主细胞发生自噬的研究鲜见报道。本研究以DHAV-1感染鸭胚成纤维细胞（DEF）为模型,研究DHAV-1诱导细胞自噬以及细胞自噬对病毒复制的影响,获得结果如下:1 DHAV-1感染对DEF细胞自噬的影响DHAV-1感染DEF细胞后,蛋白质免疫印迹（Western blotting）法检测到自噬标志蛋白LC3由LC3-I酯化为LC3-II,透射电镜观察到细胞质内出现单层或双层膜结构的自噬体囊泡,显微镜观察到转染荧光标记的LC3融合蛋白点状聚集形成明亮的斑点,荧光定量PCR检测到自噬相关基因5的转录水平上调。确定DHAV-1感染能够诱导DEF细胞自噬。进一步检测感染细胞自噬底物蛋白SQSTM1/p62的转录与表达水平,结果表明DHAV-1感染可抑制细胞内SQSTM1/p62的转录以及表达。pmCherry-GFP-LC3双荧光系统标记自噬体,显微镜观察GFP荧光蛋白淬灭,pmCherry荧光蛋白表达无影响,融合蛋白表达呈黄偏红色。Lyso-Tracker Red标记的溶酶体和GFP-LC3标记的溶酶体发生共定位。确定DHAV-1感染促进自噬底物蛋白蛋白降解,及自噬体与溶酶体发生融合,表明DHAV-1感染DEF细胞能够诱导发生完整的自噬过程。2 DHAV-1病毒蛋白完整性对细胞自噬的影响分别用热灭活和紫外灭活的DHAV-1处理DEF细胞,Western blotting检测LC3的表达情况,发现在热灭活DHAV-1添加的细胞中,LC3表达没有变化,表明DHAV-1诱导的自噬是由具有活性的病毒蛋白诱导产生的;而在紫外灭活的DHAV-1添加的细胞中,LC3由LC3-I酯化为LC3-II,表明紫外灭活法不能破坏DHAV-1蛋白诱导自噬的能力。真核表达DHAV-1所有基因。分别转染DHAV-1 VP0、VP1、VP3、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D基因的真核表达质粒,Western blotting检测LC3的表达情况,发现2C和3D蛋白的表达不影响LC3的表达情况,而DHAV-1其他病毒蛋白的表达均能诱导LC3由LC3-I酯化为LC3-II。表明DHAV-1病毒P1区VP0、VP1、VP3,P2区2A、2B,P3区3A、3B和3C蛋白可诱导细胞自噬,紫外灭活DHAV-1依然能够诱导细胞自噬的原因可能是细胞自噬依赖DHAV-1病毒蛋白完整性。3自噬对DHAV-1增殖及胞外释放的影响分别用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂氟喹预处理DEF细胞后,再感染等量的DHAV-1,荧光定量PCR检测细胞内外的病毒拷贝数。结果表明雷帕霉素处理上调细胞内外病毒拷贝数含量,氟喹处理下调细胞内外病毒拷贝数含量。比对各组别中细胞内外病毒拷贝数的差值,发现雷帕霉素处理组中细胞内外病毒拷贝数差值最小,而氟喹处理组中的细胞内外病毒拷贝数差值最大。表明激活自噬可促进DHAV-1复制及胞外释放。进一步检测自噬抑制对DHAV-1增殖的影响。自噬抑制剂氟喹预处理DEF细胞后,再感染DHAV-1,TCID50检测细胞内病毒含量。观察发现药物氟喹抑制自噬时,细胞内DHAV-1病毒含量下降,并且病毒含量下降的趋势与病毒感染时间相关。表明抑制自噬能够阻碍DHAV-1增殖。综上,DHAV-1感染DEF细胞诱导产生完整的自噬及自噬流过程;DEF细胞自噬依赖DHAV-1病毒蛋白完整性;细胞自噬可促进DHAV-1增殖及胞外释放。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 1 引言
  •   1.1 1型鸭肝炎病毒的研究概况
  •     1.1.1 生物学特性
  •     1.1.2 基因组特征
  •     1.1.3 复制机理
  •   1.2 细胞自噬的研究进展
  •     1.2.1 自噬的发现与分类
  •     1.2.2 自噬的检测方法
  •     1.2.3 小RNA病毒与自噬
  •   1.3 目的及意义
  • 2 试验研究
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 毒株、载体、质粒
  •     2.1.2 血清和试验动物
  •     2.1.3 qRT-PCR引物
  •     2.1.4 主要试剂
  •     2.1.5 试验仪器设备
  •     2.1.6 试验分析软件
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 鸭LC3蛋白生物信息学分析
  •     2.2.2 DHAV-1培养与病毒滴定
  •     2.2.3 自噬体的检测
  •     2.2.4 自噬流的检测
  •     2.2.5 确定DHAV-1诱导自噬的作用蛋白
  •     2.2.6 自噬对DHAV-1增殖的影响
  •     2.2.7 统计学处理
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 鸭LC3多重蛋白质序列比对
  • 50测定'>    2.3.2 DHAV-1的TCID50测定
  •     2.3.3 DHAV-1感染诱导DEF产生自噬体
  •     2.3.4 DHAV-1感染促进DEF产生完整的自噬流
  •     2.3.5 DHAV-1诱导自噬的蛋白确定
  •     2.3.6 激活自噬可促进DHAV-1复制及胞外释放
  •     2.3.7 抑制自噬可阻碍DHAV-1增殖
  •   2.4 讨论
  •     2.4.1 鸭LC3蛋白生物信息学分析
  •     2.4.2 DHAV-1感染激活细胞自噬
  •     2.4.3 DHAV-1感染诱导产生完整的自噬流
  •     2.4.4 细胞自噬依赖DHAV-1病毒蛋白完整性
  •     2.4.5 细胞自噬促进病毒增殖及胞外释放
  • 3 结论
  • 4 创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 周珊

    导师: 程安春,汪铭书

    关键词: 型鸭肝炎病毒,自噬,病毒蛋白,病毒增殖

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 四川农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000912

    总页数: 66

    文件大小: 2925k

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