孔祥峰[1]2003年在《中药成分对细胞增殖、病毒感染和抗体生成的影响》文中研究说明本研究完成了国家自然科学基金资助项目“中药成分的免疫增强作用和机理及新型免疫增强剂的研究”的部分工作，试验分为五部分： 1．中药成分提取和含量测定 选定黄芪多糖(APS)、当归多糖(CAPS)、板蓝根多糖(IRPS)、淫羊藿多糖(EPS)、蜂胶多糖(PPS)、黄芪黄酮(AF)、淫羊藿黄酮(EF)、蜂胶黄酮(PF)、黄芪皂甙(AS)和人参皂甙(GS)为研究对象。其中，GS购自吉林省亚成制药厂(含量75％)，其余九种中药成分自备。五种多糖用水煎醇沉法提取，硫酸蒽酮法测定含量；AF和EF用聚酰胺柱层析法提取，PF用酸碱沉淀法提取，均用芦丁法测定含量；AS用大孔吸附树脂柱层析法提取，TLC分光光度法测定含量。九种中药成分的提取率(g·Kg~(-1))分别为13.6、14.5、10.0、4.1、36.0、2.1、5.7、11.0、1.0，净含量(％)分别为82.48、77.28、82.94、66.38、51.41、1.39、38.37、46.92、72.88。 2．中药成分对鸡胚成纤维细胞(CEF)安全浓度的测定 将十种中药成分用细胞维持液分别稀释成一系列浓度，以两种方式(与细胞同时和细胞形成单层后)加入到培养的CEF中，通过测定细胞OD值和观察细胞形态学的变化判定安全浓度的范围。结果表明，各中药成分的最大安全浓度(μg．mL~(-1))分别为APS，1600；CAPS，1200；IRPS，600；AS，150；GS，120；PPS和EPS，40；EF和PF，20；AF，2.5。 3．中药成分对CEF增殖的影响 将十种中药成分分别稀释成安全浓度范围内的五种浓度，分别与CEF同时加入和CEF培养24 h后加入培养板，前者在加药后24、36、48、60、72 h、后者在加药后12、24、36、48、60 h用MTT法测定细胞OD值的动态变化，判定各中药成分对CEF增殖的影响。结果表明，同时加药时，所有成分均显着促进CEF增殖；细胞形成单层后加药时，As、APS、IRPS和PF促进细胞增殖，EPS抑制细胞增殖，其余五种成分在一定的浓度和时间点促进或抑制细胞增殖，且显示一定的量效和时效关系。 4．中药成分对病毒感染细胞能力的影响 将中药成分(浓度同3)和新城疫病毒以叁种方式加入(先加入中药后接种病毒、先接种病毒后加入中药、中药与病毒混合感作后加入)到培养的CEF中，通过测定CEF OD值的变化评价各中药成分对病毒的感染细胞能力的影响。结果表明，几乎所有中药成分均能一定程度地抑制病毒感染细胞能力，其作用由强到弱的顺序依次为：AS＞PPS＞EF＞IRPS＞APS、AF＞CAPS＞EPS、PF、GS，且与浓度有一定的相关性；不同中药成分的作用机理不同，或直接杀灭病毒，或 中药成分对细胞增殖、病毒感染和抗体生成的影响 通过提高细胞抵抗力抑制病毒感染，或二者兼有。 5．中药成分对 ND疫苗免疫后抗体生成的影响用新城疫 IV系疫苗免疫雏鸡，试 验 1先免疫，然后分别注射高、低剂量的 CAPS、APS、IRPS、EPS、PPS、EF、PF、AS 和站等丸种中药成分，连续 3 k，分别于免疫后第 7、14、21、35天采血；试验 2 先用药（种类和剂量同试验1）3天，然后首免，两周后二免，于首免后第7、14、21、 28、35和49天采血。用卜微量法监测血清中血凝抑制杭体效价的动态变化．结果表 明，九种中药成分均能不同程度地提高抗体效价，且与给药时间、剂量和免疫次数有 一定的关系．
褚秀玲[2]2007年在《分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究》文中研究说明人参皂苷是中药人参的主要活性成分之一。对药物分子的化学改造和修饰是研制新药与改变药效的主要途径之一。本实验以马立克氏病毒为模型,通过体内、外抗病毒实验,系统比较了分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及效果。体外实验结果显示,药物在高浓度时,表现为细胞毒性效应,抑制CEF细胞的生长;中、低浓度时促进细胞的生长。人参皂苷衍生物7具有更好的抗病毒效果,其感染阻断、增殖抑制和直接杀灭叁种途径抗MDV的半数抑制浓度IC_(50)分别是20.83μg/mL、61.98μg/mL和125.43μg/mL,选择指数SI分别是13.47、4.61和2.28。人参皂苷及其衍生物7对MDV具有直接的破坏作用,并可以减轻MDV对CEF的损伤程度,降低单位视野中的病毒粒子数。体内实验结果表明,衍生物7能够显着降低实验鸡的发病率和死亡率,减少实验鸡脏器肿瘤阳性率,与病毒对照组相比差异显着(p<0.05);并且可以改善免疫器官的形态,降低病毒抗原在组织中的表达,促进免疫器官发挥抗病毒作用。
陈玉库[3]2010年在《几种中药成分及其复方抗病毒和增强免疫活性的研究》文中进行了进一步梳理病毒性疾病一直是危害我国动物养殖业的主要疾病,因为缺乏有效的治疗药物,目前主要应用疫苗进行预防,配合免疫增强剂能进一步提高免疫效果。然而一些油乳类、铝胶类等化学佐剂常有副作用大、局部刺激重、致癌以及制备麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此研制高效、低毒的抗病毒药物和新型免疫增强剂成为亟待解决的课题。研究证明,许多中药具有抗病毒和增强免疫的作用,且应用安全。本研究根据文献检索选择有抗病毒和增强免疫作用的氧化苦参碱、黄芪多糖等7种中药成分,并组成复方,比较了它们抗鸡新城疫病毒和对新城疫疫苗免疫效果的影响。试验分为以下八个部分：试验一、7种中药成分对鸡胚成纤维细胞的安全浓度和生长的影响选择氧化苦参碱(OM)、甘草酸(GA)、绿原酸(CA)、栀子苷(GP)、虎杖苷(PD)、木犀草素(LT)、黄芪多糖(APS)等7种中药成分为研究对象,分别用细胞维持液倍比稀释成10个浓度,OM、APS、GP、PD为2000～3.91μg/mL,GA、CA为1000～1.95μg/mL,LT为50～0.09 gg/mL,加入到鸡胚成纤维细胞的培养体系中,用MTT法测定A570值和形态观察结果判定它们对鸡胚成纤维细胞增殖的影响。结果表明,7种中药成分的最大安全浓度分别为PD 500μg/mL,APS和GA 250μg/mL,GP和CA 125μg/mL,OM 31.25μg/mL,LT 3.13μg/mL；7种中药成分在合适的浓度均能促进细胞生长,作用强度依次为GA>CA>PD>OM>GP>APS>LT.试验二、7种中药成分对新城疫病毒感染细胞能力的影响将7种中药成分稀释成安全浓度范围内的高、中、低3种浓度(μg/mL):PD,500、250、125; GA,250、125、62.5；APS和CA,125、62.5、31.25；OM和GP,32、16、8；LT,1.6、0.8、0.4。分别与新城疫病毒以先加中药后加病毒、先加病毒后加中药、中药与病毒同时加入3种方式加入到鸡胚成纤维细胞的培养体系中,用MTT法测定新城疫病毒感染细胞能力的变化。结果表明,先加中药后加病毒时,OM、GA、APS在高、中浓度和GP在高浓度显着抑制病毒感染细胞；先加病毒后加中药时,OM在高、中浓度和APS在中、低浓度显着抑制病毒感染细胞；中药与病毒同时加入时,APS在高、中、低浓度、OM在高、中浓度和GA在高浓度显着抑制病毒感染细胞。综合比较,4种中药成分抑制病毒感染细胞能力作用依次为OM>APS>GA>GP、试验叁、4个中药成分复方对鸡胚成纤维细胞的安全浓度和生长的影响选择OM、APS、GP和GA 4种中药成分分别按一定比例组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP 4个复方,分别用MEM培养液倍比稀释成1000～1.95μg/mL10个浓度,分别加入到鸡胚成纤维细胞的培养体系中,用MTT法测定4个复方对鸡胚成纤维细胞增殖的影响。结果表明,OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS-GP对CEF的最大安全浓度为1000μg/mL, GA-APS为500μg/mL; OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS在500～1.961μg/mL,GA-APS-GP在500～3.92μg/mL显着促进CEF生长,OM-APS-GP的作用最强,其次为OM-APS。试验四、4个中药成分复方对鸡新城疫病毒感染细胞能力的影响将OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP 4个复方用细胞维持液稀释成安全浓度范围内的高(500μg/mL)、中(250μg/mL)、低(125μg/mL)3种浓度,分别与新城疫病毒以3种方式加入到鸡胚成纤维细胞的培养体系中,用MTT法测定A570值判定其对鸡新城疫病毒感染细胞能力的影响。结果表明,先加中药后加病毒时,4个复方的3个浓度显着抑制病毒感染细胞；先加病毒后加中药时,OM-APS的3个浓度、OM-APS-GP的中、低浓度、GA-APS的高、中浓度和GA-APS-GP(?)勺高、低浓度显着抑制病毒感染细胞；中药与病毒同时加入时,OM-APS的高、中浓度、OM-APS-GP的中、低浓度、GA-APS的高、低浓度和GA-APS-GP高浓度显着抑制病毒感染细胞。综合3种加药方式,4个复方抑制NDV感染细胞能力依次为OM-APS>OM-APS-GP>GA-APS>GA-APS-GP。试验五、2个中药成分复方及其主药防治鸡ND的效果26日龄非免疫罗曼蛋公鸡570羽随机均分成19组,空白对照组隔离饲养；疫苗对照组用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫,每羽4羽份；30日龄时,3个预防组分别开始口服1 mg的OM-APS、OM-APS-GP和OM,每天3次,连用7 d；33日龄时各组胸肌注射新城疫强毒攻毒,3个同时给药组分别口服1 mg的上述3种药物,每天3次,连用4 d；于攻毒后12h大部分鸡只开始发病时9个治疗组分别口服高(2 mg)、中(1 mg)、低剂量(0.5 mg)上述3种药物,病毒唑对照组口服10 mg病毒唑,每天3次,连用4 d；病毒对照和疫苗对照组不治疗。于攻毒后7d统计各组死亡率、采血测定血清NDV抗体效价、剖检死亡鸡统计器官出血阳性率、存活鸡称重计算总增重和均增重。结果显示,OM-APS各组,OM-APS-GP 6勺高、低剂量组和预防组的死亡率均显着或极显着低于病毒对照组,OM-APS高剂量组、预防组,OM-APS-GP的低剂量组和预防组的死亡率低于病毒唑对照组；OM-APS、OM-APS-GP和OM的高剂量、中剂量、低剂量和预防给药组抗体效价显着高于病毒对照组；OM-APS低剂量、OM-APS-GP高剂量、OM中剂量抗体效价显着高于病毒唑对照组；OM-APS的3个剂量组、OM-APS-GP预防组的盲肠扁桃体出血率显着低于病毒对照组和病毒唑对照组,2个复方的预防组、3个剂量组和同时给药组的腺胃出血率显着低于病毒对照组；OM-APS(?)勺中、低剂量组和OM-APS-GP高剂量组的小肠黏膜出血率显着低于病毒对照组；OM-APS高剂量组和OM-APS-GP预防组的总增重率、OM-APS高、中剂量组和OM-APS-GP预防组的均增重率显着高于病毒对照组和病毒唑对照组。表明,2个复方对ND有较好的防治效果,OM-APS的效果最好。试验六、四种中药成分及其复方对鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响将OM、APS、GA、GP及其复方OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP用RPMI1640培养液自15μtg/mL倍比稀释至0.9μg/mL5个浓度(安全浓度范围内),与鸡脾脏淋巴细胞、伴刀豆素球蛋白(ConA)一同加入到96孔细胞培养板中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,APS、OM、GA、OM-APS、OM-APS-GP和GA-APS的5个浓度、GA-APS-GP在0.9μg/mL的A570值显着高于ConA对照组和细胞对照组(P<0.05)。表明,4种中药成分及其复方能显着促进淋巴细胞增殖,单味成分以APS、复方以OM-APS的作用最强,复方的效果优于单味。试验七、中药成分复方及其组分药对新城疫苗免疫应答的影响14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡594羽随机均分为11组,除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫,28日龄重复免疫。在首次免疫的同时,OM-APS、OM和APS的高、中、低剂量组分别口服高(4 mg/mL)、中(2 mg/mL)、低(1 mg/mL)浓度的药物1 mL,疫苗对照组和空白对照组口服等量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别于14、21、28、35和42日龄采血,用MTT法测定T淋巴细胞增殖的变化,用β-微量法测定血清抗体效价变化。于14、21、28、35日龄,每组随机抽取4羽,称重,剖杀,摘取法氏囊和脾脏称重,计算免疫器官指数。于69日龄用新城疫强毒攻毒,观察保护率。结果表明,OM-APS、OM和APS的高、中剂量组在各时间点的T淋巴细胞增殖、OM-APS的高、中剂量组在各时间点的抗体效价显着高于免疫对照组；OM-APS的3个剂量组在各时间点的脾指数、高、中剂量组在各时间点的法氏囊指数显着高于免疫对照组；OM-APS和APS的3个剂量组、OM中、低剂量组的攻毒保护率高于免疫对照组。试验八、中药成分复方及其组分药对新城疫苗免疫雏鸡血清IL-2、IFN-γ水平的影响14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡594羽随机均分为11组,除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫,28日龄重复免疫。在首次免疫的同时,1～9组分别口服高(4 mg)、中(2 mg)、低(1 mg)剂量的OM-APS、OM和APS,疫苗对照组和空白对照组口服等量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别于14、28和42日龄采血,用双抗夹心ELISA法测定血清IL-2和IFN-γ的浓度。结果显示,OM-APS的3个剂量组、OM高、中剂量组和APS高、中剂量组在各时间点的血清IL-2浓度显着高于免疫对照组(p<0.05)；OM-APS的高、中剂量组在各时间点、OM-APS低剂量组在42日龄、APS高、中剂量组在28和42日龄、OM中剂量在42日龄的血清IFN-γ浓度显著高于免疫对照组(p<0.05)。表明,OM-APS、OM和APS能促进鸡血清IL-2、IFN-γ的分泌,复方的效果优于组分药。
马霞[4]2011年在《蜂胶和硫酸化多糖的增强免疫和抗病毒活性研究》文中指出畜禽传染病一直是危害畜牧业发展的首要问题,尤其是病毒性传染病,迄今尚无有效的治疗方法。采用疫苗接种进行预防仍是最重要的措施,应用免疫佐剂能够提高疫苗的免疫效果。但是目前国内外广泛使用的油乳类和铝胶等化学性免疫增强剂常有局部刺激强、致癌、致畸等副作用。因此,研制高效、低毒的新型免疫增强剂成为亟待解决的问题。蜂胶是一种含有黄酮类、芳香酸类、酚类、氨基酸等多种成分的天然活性物质,具有增强免疫、抗病毒、抗菌和抗氧化等生物活性；硫酸化多糖是一类天然多糖经硫酸化修饰后糖羟基上带有硫酸根的多糖,比天然多糖具有更多、更强的生物活性。本研究选择蜂胶和硫酸化多糖为研究对象,分别研究了蜂胶对猪细小病毒灭活苗和硫酸化多糖复方对鸡新城疫疫苗的增强免疫作用和抗病毒活性。试验分为以下六个部分：试验Ⅰ、蜂胶对猪细小病毒灭活疫苗佐剂作用的研究为了研究蜂胶对猪细小病毒灭活疫苗的佐剂作用,首先制备蜂胶、铝胶和油佐剂3种佐剂猪细小病毒(PPV)灭活疫苗,并检测其安全性。然后比较3种佐剂疫苗对效检动物豚鼠和家兔的免疫效果。免疫应答试验,分别用豚鼠68只和家兔40只随机均分为4组,1-3组分别免疫3种佐剂的PPV疫苗,空白对照组注射等量生理盐水。于免疫后8周内每周分别采血测定血清PPV特异性抗体、豚鼠脾脏和家兔外周血淋巴细胞的增殖和IL-2、IL-4的分泌。免疫保护试验,50只豚鼠随机均分为5组,3个佐剂组分别免疫3种佐剂的PPV疫苗,攻毒对照组和空白对照组注射等量生理盐水。于免疫后第42 d除空白对照组外用PPV强毒攻毒,攻毒后不同时间点采血测定血清PPV特异性抗体、外周血淋巴细胞的增殖及IL-2和IL-4的分泌,攻毒后28 d采集心、肝、脾、肺、肾和性腺用实时荧光定量PCR测定PPV含量。结果显示,蜂胶的安全性高于油佐剂和铝胶佐剂；3种佐剂均能提高豚鼠和家兔对PPV疫苗的免疫应答,蜂胶提高血清抗体的效果优于铝胶佐剂、弱于油佐剂,促进淋巴细胞增殖及IL-2和IL-4分泌的效果优于油佐剂和铝胶佐剂；攻毒后,蜂胶提高抗体生成的作用强于铝胶佐剂,促进淋巴细胞增殖和细胞因子分泌和降低器官中PPV的含量的作用最为显着。结果表明,蜂胶对PPV疫苗具有较强的佐剂活性,是一种安全有效的佐剂。试验Ⅱ、蜂胶对猪细小病毒灭活疫苗免疫效果的影响为了研究蜂胶的佐剂活性,比较了蜂胶、铝胶和油佐剂3种佐剂的猪细小病毒灭活疫苗对猪的免疫效果。25～30日龄仔猪20头随机均分为4组,1-3组分别颈部肌肉注射2 mL蜂胶、铝胶和油佐剂猪细小病毒灭活疫苗,空白对照组注射等量生理盐水。分别于免疫后第7(D7)、D14、D21、D28、D35和D49耳静脉采血,用p-微量法检测血清中猪细小病毒特异性抗体,于D7、D14、D21、D35颈静脉采血,用ELISA方法测定血清中IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的含量,于D7、D14、D35颈静脉采血,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖,同时用ELISA方法检测淋巴细胞上清液中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量。结果显示,蜂胶佐剂组在D7、D14的抗体效价均高于铝胶佐剂组(P<0.05)和油佐剂组(P>0.05),其余时间点均高于或显着高于铝胶佐剂组；在D7～D35,蜂胶佐剂组的IgM、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的含量均高于或显着高于铝胶佐剂组和油佐剂组,IgG1含量显着高于铝胶佐剂(P<0.05)；在D7～D35,蜂胶佐剂组的淋巴细胞增殖显着高于铝胶佐剂和油佐剂组(P<0.05), IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量多显著高于铝胶佐剂和油佐剂组(P<0.05)。这些结果表明,蜂胶能显着提高猪细小病毒灭活疫苗的免疫效果,尤其在增强细胞免疫方面优于油佐剂和铝胶佐剂。试验Ⅲ、蜂胶体外抗PPV的研究为了研究蜂胶的抗病毒作用,测定了蜂胶体外对猪细小病毒感染细胞能力的影响。首先将蜂胶自2000μg·mL-1连续2倍比稀释成10个浓度,加到长成单层的猪肾细胞(PK-15)株的培养体系中,用MTT法测定其对PK-15的安全浓度；然后取PPV和安全浓度范围内5个浓度的蜂胶,以3种加药方式(先加蜂胶后接种病毒、先接种病毒后加蜂胶、蜂胶与病毒混合感作后)加入到PK-15的培养体系中,同法测定PPV感染PK-15能力(细胞A570值)的变化,并用实时荧光定量PCR方法检测PK-15中PPV的含量。结果显示,在3种加药方式中,蜂胶在31.2-250μg.mL-1范围内的细胞A570值均显着高于病毒对照组(P<0.05),细胞中的PPV含量均显着低于病毒对照组(P<0.05),表明蜂胶可以增强PK-15细胞抵抗和清除PPV感染；这种作用与其剂量和给药方式有相关性,在安全浓度范围内,蜂胶浓度越高则效果越好,以先加蜂胶后接种病毒的作用最好。试验Ⅳ、硫酸化多糖复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响在前期研究筛选出增强免疫效果最好的硫酸化多糖、并证明复方的作用强于单味的基础上,比较了4个硫酸化多糖复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响。14日龄蛋公鸡270羽随机分为9组,除空白对照组外均用新城疫IV系疫苗滴鼻点眼免疫,2周后二免。在首次免疫的同时,4个硫酸化多糖复方组和3个组分(sAPS、sEPS和sLNT)组分别肌肉注射相应多糖,无佐剂对照组(NA)和空白对照(BC)组注射等体积生理盐水。分别于首免后第7(D7)、14(D14)和21(D21)d采血,用p-微量法检测血清抗体效价,于D14和D21心脏采血,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖,于首免后第23 d除BC组外用NDV强毒攻毒,观察鸡的临床症状和死亡情况,连续观察14d统计发病率、死亡率和免疫保护率,于攻毒后第14d采血测定血清抗体效价。结果显示,各多糖组在免疫后各时间点的抗体效价均高于、淋巴细胞增殖显着高于NA组,方1组的抗体效价和淋巴细胞增殖最高、显着高于NA组(P<0.05)；攻毒后各多糖组的发病率和死亡率均低于、保护率和抗体效价均高于NA组,方1组的发病率最低、保护率和抗体效价最高,与NA组的差异显着(P<0.05)。以上结果表明,各多糖均能增强新城疫疫苗的免疫效果,提高攻毒保护率,加速攻毒后血清抗体生成,方1的效果最好。试验V、硫酸化多糖复方体外对鸡脾脏淋巴细胞的增殖及IL-2和IL-6分泌的影响为了比较硫酸化多糖复方的增强免疫活性,首先用MTT法测定4个硫酸化多糖复方对鸡脾脏淋巴细胞的安全浓度。然后取安全浓度范围内5个浓度的4个硫酸化多糖复方及其3个组分多糖(sAPS、sEPS和sLNT)与ConA一起加入到鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖(细胞A570值)的变化,并用酶联免疫吸附法检测淋巴细胞分泌IL-2和IL-6的含量。结果显示,在12.5-3.13μg·mL-1范围内,4个硫酸化多糖复方及sAPS、sEPS的淋巴细胞增殖显着大于ConA和细胞对照组,所有多糖组的IL-2和IL-6含量显着高于细胞对照组,方1组的细胞淋巴细胞增殖和IL-2、IL-6含量最高。这些结果表明,所有复方及其组分均能协同ConA显着刺激淋巴细胞增殖,促进淋巴细胞分泌细胞因子,硫酸化多糖复方1的效果最好。试验Ⅵ、硫酸化多糖复方体外对NDV感染细胞能力的影响为了比较硫酸化多糖复方的抗病毒作用,首先用MTT法测定4个硫酸化多糖复方对CEF的安全浓度。然后取安全浓度范围内3浓度的各硫酸化多糖复方及其组份加入到长成单层的CEF的培养体系中,2h时后更换NDV液,继续培养72 h后收集细胞,提取RNA,用实时荧光定量PCR检测细胞中NDV的含量。结果显示,4个硫酸化多糖复方及其3个组分药的所有浓度组的病毒含量显着低于病毒对照组,方1组最低。结果表明,4个硫酸化多糖复方及其组分均能显着抑制NDV感染细胞,方1的作用最强。
徐玉凤[5]2009年在《芪蓝抗毒饮及其组方成分体外抗新城疫病毒作用及其机制初步研究》文中认为芪蓝抗毒饮(简称“芪蓝饮”,Qilanyin, QLY)是本组研制的纯中药抗病毒药(现已获得国家发明专利,专利号：第263651号),并由地方标准升国家标准成为新兽药。经过临床推广应用,芪蓝饮还对NDV等其它病毒性疾病有一定的防治作用。但是,芪蓝饮制剂为初提物剂型,贮藏后易形成沉淀,需要在剂型方面进一步优化；对NDV等疾病的临床防治效果也需进一步证实和提高；另外,中药抗病毒机制还未得到明确阐释。本实验提取了芪蓝饮及其组分,利用体外抗病毒的筛选法筛选出抗病毒成分,并采用空斑形成法证实了其抗NDV感染的效果,同时从免疫和病毒吸附、释放3个方面初步研究了其抗病毒的机制。研究分为以下4个部分。试验Ⅰ芪蓝抗毒饮及其组分在CEF上的最大安全浓度测定采用组织细胞培养的方法,测试了“芪蓝饮”及其组分在鸡胚成纤维细胞(CEF)体外培养中的最大安全浓度。结果显示：芪蓝抗毒饮原药(QLY)、总多糖(TPS)、总萜类化合物(TT)、板蓝根总生物碱(R]A)及其水溶性部位(RIAw)和酸性部位(RIAa)的最大安全浓度分别为1000、1000、500、125、31.3和62.5μg/mL。采用细胞破坏率评价时,药物的最高无毒剂量一般比上述最大安全浓度低1个稀释度。试验Ⅱ芪蓝抗毒饮及其组分对NDV在鸡胚成纤维细胞中增殖的影响通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测了各组分对新城疫病毒(NDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程的影响,采用空斑形成法对药物的抗病毒活性进行了确证。结果显示在3种加药方式中QLY直接杀灭NDV的作用最强,抑制率最高为128.85%；TPS干扰NDV的增殖作用最强,抑制率最高为130.23%；TT直接杀灭NDV的作用最强,抑制率最高为146.15%; RIA、RIAw和RIAa对抗NDV的方式是多环节的；空斑实验证实了RIA、RIAw和RIAa的抗NDV活性。结果表明,“芪蓝饮”及其组分表现出较强的的干扰NDV增殖和直接杀灭NDV的作用,而阻断作用稍弱。试验Ⅲ芪蓝抗毒饮及其组分对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响采用MTT比色法测定了药物单独和协同植物血凝素(PHA)刺激鸡外周血淋巴细胞增殖的变化。结果显示,单独刺激时,QLY、TPS、RIA、RIAw和RIAa分别在62.5、62.5～500、3.9～62.5、2.0和15.6μg/mL时其A570值都显着高于细胞对照组(P<0.05),最高的增殖率分别为25.26%、30.53%、34.62%、27.05%和25.96%；协同PHA刺激时,TPS和RIA分别在500和3.9～31.3μg/mL时其A570值都显着高于细胞对照组(P<0.05),最高的增殖率分别为14.29%和13.85%。结果表明,以TPS、RIA单独和协同刺激鸡外周血淋巴细胞增殖的作用最强,具有提高机体免疫的功能。试验Ⅳ中药抗病毒成分RIAa对新城疫病毒吸附、释放的影响通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测了RIAa对NDV感染CEF吸附和释放过程的影响,结果显示药毒混合方式中在60min,在浓度为31.3μg/mL时的A570值显着高于病毒对照(P<0.05)；在120mmin时3个浓度均显着高于病毒对照(P<0.05)；先加药物方式中在120min,浓度为62.5和31.3μg/mL时其A570值均显着高于病毒对照(P<0.05)；先加毒吸附方式中,各吸附时间的A570值均不显着(P>0.05)；RIAa+NDV的细胞上清再次作用细胞后其A570值显着高于没有加RIAa的NDV对照(P<0.05)。结果表明,吸附时间、加药方式对病毒感染细胞的能力有显着影响,RIAa在一定浓度下对病毒的吸附有阻碍作用,能够保护细胞减少病毒感染,但是不能解除已经吸附的病毒；RIAa在一定浓度下能够显着抑制病毒的释放。
王学文[6]2017年在《复方中药制剂对甲型流感病毒感染的抑制作用及其作用机制的研究》文中提出甲型流感病毒是一种引起人和动物急性呼吸道传染病的病毒。中药具有抑制病毒的复制、阻止病毒引起细胞病变、调节机体免疫功能、改善肺循环和镇痛抗炎等综合功效,且病毒难以对其产生抗药性,因此筛选安全有效的中药一直是防治甲型流感病毒感染的研究热点。本研究通过对复方中药制剂的体内、外抑制作用试验,确定其对甲型流感病毒的抑制作用。进一步针对其作用机制进行了研究,为复方中药制剂抗流感病毒的临床应用提供试验依据,对流感的防治具有重要意义。体外抑制作用试验结果显示:复方中药制剂在MDCK细胞上的半数毒性浓度(TC50)为1596μg/mL。复方中药制剂对H1N1亚型流感病毒感染的作用效果显示,抑制病毒吸附后的复制增殖作用,对病毒吸附的预防作用和直接杀灭病毒作用叁种药物与病毒的作用方式的平均半数有效浓度(EC50)分别为208.9、207.4和237.1μg/mL,治疗指数(TI)分别为7.6、7.7和6.7;复方中药制剂对H7N7亚型流感病毒感染的作用效果显示,抑制病毒吸附后的复制增殖作用,对病毒吸附的预防作用和直接杀伤病毒作用叁种药物与病毒的作用方式的平均半数有效浓度分别为212.4、338.7和360.9μg/mL,TI值分别为7.5、4.7和4.4。体内抑制作用试验结果显示了复方中药制剂对流感病毒感染小鼠死亡的保护作用:病毒对照组小鼠平均存活时间为8.7d,复方中药制剂中剂量组小鼠平均存活时间为11.7d,与病毒对照组相比差异极显着(P<0.01);病毒对照组死亡率为80.0%,复方中药制剂中剂量组死亡率为33.3%,经X2检验,二者差异极显着(P<0.01)。复方中药制剂对感染小鼠肺脏炎症抑制作用:与病毒对照组相比,复方中药制剂中剂量组平均肺指数极显着降低(P<0.01),复方中药制剂高、低剂量组平均肺指数显着降低(P<0.05);与病毒对照组相比,试验组平均血凝滴度均极显着下降(P<0.01);病毒对照组病变较重,如肺脏毛细血管充血,大部分肺组织肺泡结构破坏,部分肺组织实变区融合,肺泡隔增厚,肺泡腔和间质内炎性细胞浸润。经药物治疗后,各药物组与病毒对照组相比,小鼠健康有了明显改善。作用机制的研究结果显示:(1)复方中药制剂对感染小鼠免疫器官指数和淋巴细胞增殖的影响:与病毒对照组相比,复方中药制剂中剂量组胸腺指数和脾脏指数显着升高(P<0.05);与病毒对照组相比,复方中药制剂中剂量组T、B淋巴细胞A值显着增高(P<0.05)。(2)复方中药制剂对感染小鼠细胞因子表达的影响:与病毒对照组相比,复方中药制剂中剂量组IL-6显着下降(P<0.05),IL-10显着升高(p<0.05);复方中药制剂中、低剂量组TNF-α极显著下降(p<0.01),IFN-γ极显著升高(p<0.01);复方中药制剂高剂量组IFN-γ显著升高(P<0.05)。(3)复方中药制剂对感染小鼠抗氧化能力的影响:与病毒对照组相比,复方中药制剂中、低剂量组SOD极显着升高(p<0.01),复方中药制剂高剂量SOD显着升高(P<0.05),各药物组MDA均极显着降低(p<0.01)。综上所述,体内、外试验提示该复方中药制剂对甲型流感病毒感染有显着的抑制作用。复方中药制剂在调节感染小鼠的免疫功能和细胞因子分泌,减轻流感病毒造成的过氧化应激损伤等方面具有间接抗病毒的功能。
邵珊[7]2009年在《黄芪多糖与白花蛇舌草多糖增强猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫效力及其机理研究》文中指出猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病,主要导致妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的大量死亡。该病至今尚无有效的治疗方法,疫苗预防是主要的措施。疫苗的研究已取得显着进展,世界上商品化的PRRS疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。临床上PRRS疫苗主要存在的问题是：第一,疫苗产生免疫反应需要较长时间；其次,PRRSV疫苗并不具备完全的保护力,尤其是灭活疫苗不能激发细胞免疫；第叁,PRRSV弱毒疫苗可以在免疫猪体组织中存在几周时间,并且从注苗猪向易感猪传播。因此,应用灭活疫苗增强疫苗免疫效力和安全性,研制免疫增强剂来提高PRRS灭活疫苗的免疫效果具有显着优势。大量研究表明,黄芪多糖和白花蛇舌草多糖具有显着的免疫增强作用,作为免疫增强剂有显着优势。本试验选取黄芪多糖和白花蛇舌草多糖联合PRRS灭活疫苗免疫仔猪,观察其联合应用对疫苗免疫效果的影响,研究其免疫增强作用和机理,旨在筛选具有较好免疫增强作用的单味或复合中药成分,为研制免疫增强剂提供理论依据。试验分为以下六部分：试验Ⅰ、黄芪多糖和白花蛇舌草多糖提取及含量测定提取黄芪多糖(APS)和白花蛇舌草多糖(OPS),为下一步研究多糖的活性及筛选具有较好免疫增强作用的单味或复合中药成分,本试验进行APS和OPS的提取及其含量的测定。采用水提醇沉法提取多糖,苯酚-硫酸法测定多糖含量。结果表明,黄芪多糖和白花蛇舌草多糖的提取率分别为21.69%、13.58%,净含量分别为44.61%、27.25%。试验Ⅱ、黄芪多糖和白花蛇舌草多糖的体外筛选试验本试验通过黄芪多糖和白花蛇舌草多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响,筛选具有较好免疫增强作用的单味或复合中药成分。采用MTT法比较黄芪多糖、白花蛇舌草多糖以及黄芪多糖联合白花蛇舌草多糖直接作用以及协同ConA或LPS促进体外培养小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用。结果表明,APS和OPS均能促进淋巴细胞增殖,而且APS和OPS在一定浓度既能单独又能协同ConA或LPS刺激淋巴细胞增殖,OPS作用较强,并且APS和OPS联合作用与OPS单独作用效果差异不显着。试验Ⅲ、黄芪多糖和白花蛇舌草多糖对PRRS灭活疫苗对免疫效果的影响本试验通过观察PRRS抗体水平的动态变化,研究黄芪多糖和白花蛇舌草多糖与PRRS灭活疫苗联合应用对仔猪免疫效果的影响。20头(26±1)日龄PRRS检测阴性猪随机分成5组,所有猪均注射猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗,同时试验组分别肌肉注射高、中、低剂量白花蛇舌草多糖和黄芪多糖,空白对照组注射等剂量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别在注射疫苗后7、14、24、34、44、54、69 d前腔静脉采血。ELISA方法测定抗体。结果表明,APS和OPS均能提高PRRSV灭活疫苗免疫后小猪血清中抗体水平,促进抗体提前达到峰值,OPS各组抗体水平维持时间要优于对照组和APS试验组,OPS中剂量组免疫增强作用优于低剂量组和高剂量组。试验Ⅳ、黄芪多糖和白花蛇舌草多糖对猪外周血淋巴细胞增殖影响本试验通过观察猪外周血淋巴细胞增殖的影响,探讨黄芪多糖和白花蛇舌草多糖联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗增强免疫作用机理。试验动物处理同试验Ⅲ.MTT法测定外周血淋巴细胞增殖。结果表明,无论ConA、LPS刺激APS和OPS,还是APS和OPS直接作用均能显着促外周血淋巴细胞增殖：OPS中剂量组>OPS高剂量组>APS组>生理盐水组。试验V、黄芪多糖和白花蛇舌草多糖对PRRS灭活疫苗免疫后T细胞亚群的影响本试验通过观察仔猪免疫后T细胞亚群动态变化,探讨黄芪多糖和白花蛇舌草多糖联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗增强免疫作用机理。试验动物处理同试验Ⅲ。通过流式细胞仪检测猪外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞百分数。结果表明,APS和OPS均能显着提高仔猪的CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞的百分数；OPS中剂量组CD4+/CD8+比值极显着高于生理盐水和APS组(P<0.01),表明黄芪多糖和白花蛇舌草多糖均能提高机体细胞免疫力,但提高机体免疫力则与剂量有关。试验Ⅵ、黄芪多糖和白花蛇舌草多糖对PRRS灭活疫苗免疫后IL-2和IFN-γ的影响本试验通过观察仔猪免疫后IL-2和IFN-γ动态变化水平,探讨黄芪多糖和白花蛇舌草多糖联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗增强免疫作用机理。试验动物处理同试验Ⅲ。定量ELASA法测定IL-2, IFN-γ。IL-2检测结果表明,生理盐水组、APS组、OPS低、中剂量组IL-2水平呈现先降低后升高趋势,OPS高剂量组呈现一直升高趋势。IFN-γ呈检测结果表明,联合注射疫苗和多糖后IFN-γ表达先下降后上升到24 d时达到最高值后又降低。说明APS和OPS可通过调节机体内细胞因子的表达来提高机体免疫。
张萍[8]2015年在《赤灵芝多糖抗病毒活性和增强免疫作用研究》文中提出畜禽传染性疾病,尤其是病毒性疾病,是危害畜牧业发展的首要问题,由于它们能造成畜禽养殖业的巨大损失而在全世界范围内备受关注。因病毒具有独特的生物特征和发病机理,目前还没有针对病毒性疾病有效的治疗方法,所以疫苗接种则成了主要的预防措施。虽然有关传染性疾病疫苗的研究和应用很多,但现有疫苗的免疫效果却不尽人意,很多疫苗由于病毒的易变异性和理化因素等影响,经常出现免疫失败的现象。近年来,在畜禽免疫方面,中药多糖增强免疫应用受到了兽医界医药科研者的广泛关注。研究证明,许多中药及其组分具有一定的抗病毒和增强免疫作用,一些中药及其组分在疫苗接前后使用,这样可以提高机体免疫力,降低传染病发病率。灵芝(Ganoderma lucidum)在我国应用历史悠久,灵芝的药用成分非常丰富,尤其是从灵芝中提取的灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides,GLP)。近年来试验研究表明,灵芝多糖具有增强免疫功能、抗病毒、抗炎症、抑制肿瘤、降血压、护肝等作用,上述研究主要集中在人医上,且相关作用已得到多方面的实验验证,但灵芝多糖在畜禽生产方面的研究还很有限,尤其是在畜禽生产中抗病毒和增强免疫作用方面的研究甚少。因此,本论文以赤灵芝多糖为研究目标,通过相关体内外试验,研究了赤灵芝多糖抗病毒与免疫调节作用及其机理,为赤灵芝多糖在养禽养殖上的应用以及在此基础上进一步开发新型免疫增强剂奠定基础。具体试验安排分以下八个部分:1.赤灵芝多糖对NDV、IBDV感染细胞能力的影响目的:探究赤灵芝多糖的体外抗病毒活性作用。方法:将赤灵芝多糖与IBDV、NDV两种病毒分别以3种加样方式(先加药,先加病毒,病毒和多糖感作后同时加入)加入培养24 h的鸡胚成纤维细胞(CEF)上,MTT法测定细胞活性以评价赤灵芝多糖对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡新城疫病毒(NDV)两种病毒感染CEF能力的影响。结果:先加赤灵芝多糖后接种病毒的方式,赤灵芝多糖在9.766～625μg.mL-1时,其A570均显着大于病毒对照组;先加病毒后,赤灵芝多糖对NDV无明显抑制作用,且只有在高浓度才体现抑制IBDV作用;病毒和多糖感作后同时加入,赤灵芝多糖在9.766～625 μg·mL-1时,其A570均显着大于IBDV对照组,而所有的多糖组A570均显着大于NDV对照组。结论:赤灵芝多糖对IBDV、NDV两种病毒感染CEF有一定的抑制作用,尤其是提前给多糖方式效果较好,提示赤灵芝多糖对病毒吸附宿主细胞有阻断和抑制作用。2.赤灵芝多糖对CEF细胞中IFN-β的mRNA表达影响目的:探讨赤灵芝多糖对CEF抗病毒感染的能力的影响机理。方法:选用Oligo7软件设计了一对干扰素-β(Interferonβ,IFN-β)引物,用荧光定量PCR方法测定了赤灵芝多糖对鸡胚成纤维细胞IFN-β的mRNA表达的影响。结果:赤灵芝多糖能诱导CEF中IFN-β的表达,使IFN-β的mRNA转录水平升高,尤其是灵芝多糖在156.25μg·mL-1 时,能够显着促进 CEF 中 IFN-β 的表达(P<0.05),在 39.065 和 78.125μg·mL-1时能促进IFN-β mRNA的表达,但与对照组差异不显着。结论:结合之前抗病毒试验结果分析,赤灵芝多糖对CEF抗病毒作用的影响与其诱导产生的IFN-β有关,可能是IFN-β干扰了病毒吸附宿主细胞,这也许是赤灵芝多糖增强CEF抗病毒感染能力的分子机制之一。3.赤灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞、脾脏淋巴细胞增殖的影响目的:探讨赤灵芝多糖对体外培养鸡外周血淋巴细胞、脾脏淋巴细胞增殖的影响。方法:将不同浓度的赤灵芝多糖单独或协同伴刀豆素球蛋白(ConA)刺激仔鸡外周血淋巴细胞、脾脏淋巴细胞,采用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果:单独刺激外周血淋巴细胞时,GLP在0.070～2.25 mg·mL-1的剂量范围内,其吸光度值均显着大于细胞对照组(P<0.05),协同ConA刺激外周血淋巴细胞时,GLP+ConA组在0.141～2.25 mg·mL-1吸光度值显着大于ConA对照组(P<0.05)。单独刺激脾脏淋巴细胞时,GLP在0.035～2.25 mg·mL-1浓度时的吸光度值显着大于细胞对照组(P<0.05),协同ConA刺激脾脏淋巴细胞时,GLP+ConA组在0.035～2.25 mg·mL-1吸光度值显着大于ConA对照组(P<0.05)。结论:赤灵芝多糖在体外不仅能单独刺激鸡淋巴细胞增殖,与ConA具有协同刺激作用,且在一定范围内呈现明显的量效关系。4.赤灵芝多糖体外对鸡外周血淋巴细胞中IL-6、IFN-γ mRNA表达的影响目的:探究赤灵芝多糖增强免疫的机理。方法:用Oligo7软件设计了白介素-6(Interleukin 6,IL-6)引物、干扰素-γ(Interferonγ,IFN-y)引物,利用多糖辅助 ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞,并从中提取总RNA。荧光定量PCR方法测定赤灵芝多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-6、IFN-y的mRNA表达的影响。结果:赤灵芝多糖在合适的浓度下能够协同ConA促进外周血淋巴细胞中IL-6、IFN-y mRNA的表达,与ConA对照组相比,GLP在562.5μg·mL-1、281.25 μg·mL-1时能够显着促进IL-6 mRNA的表达(P<0.05),GLP 在 140.63 μg·mL-1 时能够显着促进 IFN-y mRNA 的表达(P<0.05)。结论:赤灵芝多糖在合适的浓度下能够促进IL-6、IFN-γ mRNA的表达,这可能是其增强免疫的机理之一。5.赤灵芝多糖对雏鸡黏膜免疫功能的影响目的:探讨赤灵芝多糖对免疫雏鸡黏膜免疫功能的影响。方法:1日龄非免疫罗曼蛋公鸡饲养至14日龄,随机选取225只,分为5组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ苗滴鼻、点眼免疫,1羽份/羽,28日龄二免。在每次免疫的同时,3个药物剂量组分别灌服不同浓度的赤灵芝多糖溶液,连续3天,免疫对照组和空白对照组不给药。在二免后第14天分别各组随机抽取5羽,放血致死,采取十二指肠和盲肠扁桃体,用免疫组化法测定肠绒毛和盲肠扁桃体SIgA阳性细胞数量。结果:赤灵芝多糖在50、25、12.5 mg·kg-1剂量时可以显着提高十二指肠和盲肠扁桃体的SIgA细胞阳性数,其中25 mg·kg-1剂量组SIgA水平最高。结论:赤灵芝多糖可以有效地提高SIgA阳性细胞数目,从而增强机体黏膜免疫。6.赤灵芝多糖对免疫雏鸡外周血淋巴细胞IL-6、IFN-γ mRNA表达的影响目的:探讨赤灵芝多糖对免疫雏鸡白介素-6(Interleukin 6,IL-6)、干扰素-γ(Interferonγ,IFN-γ)表达的影响,分析赤灵芝多糖体内增强免疫机理。方法:1日龄非免疫罗曼蛋公鸡饲养至14日龄,随机选取225只,分为5组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ苗滴鼻、点眼免疫,1羽份/羽,28日龄二免。在每次免疫的同时,3个药物剂量组分别灌服不同浓度的灵芝多糖溶液,连续3天,免疫对照组和空白对照组不给药。在首免后第28天分别各组随机抽取5羽,无菌心脏采血,分离淋巴细胞,并从中提取总RNA。用Oligo7软件设计IL-6引物、IFN-γ引物。荧光定量PCR方法测定赤灵芝多糖对免疫雏鸡外周血淋巴细胞IL-6、IFN-γ mRNA表达的影响。结果:赤灵芝多糖在50、25 mg·kg-1时能够显着促进IL-6、IFN-γ mRNA的表达(P<0.05)。结论:赤灵芝多糖在体内能够促进细胞因子IL-6、IFN-γ mRNA的表达,这可能是其增强免疫的机理之一。7.赤灵芝多糖对雏鸡新城疫疫苗免疫应答影响目的:研究赤灵芝多糖对新城疫免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖、免疫器官指数以及抗体效价的影响。方法:300只1日龄罗曼蛋公鸡饲养至14日龄,随机分为6组,除空白对照组外均用新城疫疫苗滴鼻、点眼免疫,1羽份/羽,28日龄时进行二免,在每次免疫的同时,分别灌服3种不同浓度的赤灵芝多糖溶液,药物对照组灌服黄芪多糖溶液,连续3天,免疫对照组和空白对照组不给药。分别在首免后的第7天、14天,21天、28天测定外周血淋巴细胞增殖活性、新城疫抗体效价,在首免后第28天随机抽取5只处死,称取胸腺、脾脏和法氏囊重量,计算免疫器官指数。结果:赤灵芝多糖在50、25 mg·kg-1时可以促进雏鸡外周血淋巴细胞增殖、提升机体血清抗体效价,提高免疫器官指数等。结论:赤灵芝多糖可以提高机体的免疫能力,增强疫苗的免疫效果。8.赤灵芝多糖对免疫雏鸡抗新城疫病毒影响目的:研究赤灵芝多糖对免疫雏鸡抗新城疫病毒影响。方法:280只1日龄罗曼蛋公鸡饲养至14日龄,随机分为7组,除空白对照组外均用新城疫疫苗滴鼻、点眼免疫,1羽份/羽,28日龄时进行二免,在每次免疫的同时,分别灌服3种不同浓度的赤灵芝多糖溶液,药物对照组灌服黄芪多糖溶液,连续3天,免疫对照组、病毒对照组和空白对照组不给药。在首免后的第28天,除空白对照组外,其他各组用新城疫病毒攻毒,记录各组发病状况,并统计各组的发病率、死亡率、保护率。结果:赤灵芝多糖组高、中剂量组鸡只的死亡率和发病率均显着低于病毒对照组(P<0.05),也低于APS对照组和免疫对照组。结论:赤灵芝多糖可以增强疫苗的免疫效果,提升机体的抗病毒能力。
郭振环[9]2010年在《硫酸化香菇多糖的抗病毒和增强免疫活性及其与其他几种硫酸化多糖的比较》文中进行了进一步梳理多糖具有抗病毒、增强免疫、抗肿瘤等多种生物活性,尤其是具有抗病毒和增强免疫活性,显示了广阔的药用前景。硫酸化多糖是一类糖羟基上带有硫酸根的多糖,比天然多糖具有更多、更强的生物活性。为提高中药多糖的生物活性,可通过硫酸化修饰的方法进行结构改造,获取更多的硫酸化多糖。本研究选择香菇多糖(Lentinan, LNT)作为研究对象,提取纯化,用氯磺酸-吡啶法修饰,以3种修饰条件制备了3种硫酸化LNT,以天然LNT为对照,比较它们的抗病毒和增强免疫活性,并与本研究室前期筛选的硫酸化黄芪多糖、硫酸化淫羊藿多糖、硫酸化当归多糖和硫酸化枸杞多糖进行了比较。试验分为以下九个部分：试验I香菇多糖的提取和纯化用超声水煎-醇沉法提取粗香菇多糖,然后用Sevag法去蛋白、H202法去色素、SephadexG-200柱层析纯化香菇多糖。分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定纯化过程中多糖和蛋白含量。结果表明,粗香菇多糖的提取率为8.4%、多糖含量和蛋白含量分别为30%和65%,随着去蛋白过程的重复,多糖得率和蛋白含量逐渐降低,多糖含量逐渐升高,纯香菇多糖的得率为0.6%,多糖含量高达91.0%,蛋白质含量降低至5.3%。试验Ⅱ香菇多糖的硫酸化修饰用氯磺酸-吡啶法对纯化的香菇多糖进行硫酸化修饰,以产物的得率和硫酸基取代度为指标,对氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应时间进行优选。结果显示,反应温度60℃、反应时间4 h、氯磺酸和吡啶比例在1：6～1：2时为最佳修饰条件。采用最佳反应温度、反应时间和3种氯磺酸-吡啶比例(1：2、1：4和1：6)制备3种硫酸化香菇多糖(Sulfated lentinan, sLNT)sLNT1、sLNT2和sLNT3,产物得率分别为62.5%、60.5%、63.5%,硫酸基取代度分别为1.37、0.98、0.69。试验Ⅲ硫酸化香菇多糖对NDV、IBDV和IBV感染细胞能力的影响为了比较3种硫酸化香菇多糖sLNT1、sLNT2和sLNT3的体外抗病毒作用,首先用MTT法测定3种硫酸化香菇多糖和LNT对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度；然后将4种多糖在安全浓度下稀释5个浓度,分别以3种方式(先加多糖、先加病毒、多糖和病毒感作后加入)加入到CEF的培养体系中,用MTT法比较它们对鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病毒和传染性支气管炎病毒感染细胞能力的影响。结果表明,硫酸化香菇多糖在所选浓度0.4μg·mL-1～5.9μg·mL-1范围内都可以增强CEF抵抗病毒感染,而香菇多糖多数在1.5μg·mL-1～5.9μg·mL-1范围内有效,且在同一多糖浓度下硫酸化香菇多糖组A570值显着高于香菇多糖组,表明香菇多糖经硫酸化修饰可以增强CEF抵抗病毒感染的能力；硫酸化香菇多糖增强CEF抵抗病毒感染的效果与其浓度有关,硫酸化多糖浓度在5.9、3.0、1.5、0.8、0.4μg·mL时作用效果依次降低；叁种加药方式以先加多糖方式作用效果较好,3种硫酸化香菇多糖中以sLNT2抑制病毒感染细胞的作用最强。试验Ⅳ硫酸化香菇多糖对鸡淋巴细胞增殖的影响为了比较3种sLNT的体外增强免疫作用。将3种sLNT和LNT分5个浓度,分别单独或与ConA、PHA一起加入到鸡外周血淋巴细胞、单独或与ConA、LPS一起加入到鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果表明,叁种sLNT在所选浓度内基本都有效,而LNT有效浓度多在1.5μg·mL-1～5.9μg·mL-1范围内,且在同一多糖浓度下硫酸化香菇多糖组A570值多显着高于香菇多糖组,表明LNT经硫酸化修饰后可以提高其促进鸡淋巴细胞增殖能力,且有一定的浓度依赖性,叁种sLNT浓度在5.9、3.0、1.5、0.8、0.4μg·mL-1时作用效果依次降低；叁种sLNT增强鸡淋巴细胞增殖效果相比,sLNT2组A570值在同一浓度下多显着高于sLNT1和sLNT3组,表明sLNT2的效果最佳。试验V硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响为了比较3种硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗的免疫增强作用,免疫应答试验取14日龄雏鸡450只随机均分为9组,用新城疫Ⅳ系苗免疫,28日龄二免。在首免同时,6个硫酸化香菇多糖(sLNT)组和2个香菇多糖(LNT)组分别肌肉注射高、低剂量的sLNT1、sLNT2、sLNT3和LNT。分别于首免前和首免后6周内检测血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。免疫保护试验取350只14日龄雏鸡随机均分为7组,除非免疫(NV)组外用新城疫Ⅳ系苗免疫,同时3个sLNT组和LNT组肌肉注射8.0 mg·mL-1的sLNT1、sLNT2、sLNT3和LNT 0.5mL,其它组注射等量生理盐水。于免疫后第21 d,除无佐剂组2(NA2)外各组鸡肌肉注射NDV强毒攻毒。分别于攻毒前和攻毒后第3、6、9、12和15 d测定血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。结果显示,3种sLNT比LNT更显着提高血清抗体效价,高剂量效果优于低剂量；促进淋巴细胞增殖,低剂量的效果强于高剂量；3种sLNT能显着降低攻毒鸡发病率、死亡率和提高攻毒保护率,加速攻毒后血清抗体生成和T淋巴细胞增殖。综合评价以sLNT2效果最好。试验Ⅵ硫酸化香菇多糖对法氏囊疫苗免疫效果的影响为了比较3种硫酸化香菇多糖对法氏囊疫苗的免疫增强作用,14日龄雏鸡450只随机均分为9组,6个sLNT组分别肌肉注射高、低剂量的sLNT1、sLNT2、sLNT3,2个LNT对照组注射高、低剂量的LNT,无佐剂对照组(non-adjuvant, NA)注射等量生理盐水。在给药后4天用法氏囊疫苗免疫,两周后进行二免。分别于首免前和首免后第7、14、21、28和35d采血,检测血清抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。取脾脏、法氏囊和胸腺测定免疫器官指数。结果表明,3种sLNT均能显着提高血清抗体效价、促进T淋巴细胞增殖和免疫器官发育,作用强于未修饰的LNT,并有一定的量效和时效关系,高剂量提高血清抗体效价、低剂量促进T淋巴细胞增殖的效果较好,综合评价以sLNT2的效果最好。试验Ⅶ五种硫酸化多糖增强CEF抵抗和清除NDV感染的比较为了筛选抗病毒作用较好的硫酸化多糖,比较了sLNT2和本实验室前期筛选出的硫酸化黄芪多糖sAPS60、硫酸化淫羊藿多糖sEPS5、硫酸化当归多糖sCAPS11和硫酸化枸杞多糖sLBP14的体外抗病毒作用。首先测定5种硫酸化多糖对CEF的安全浓度,然后用MTT法比较了它们对CEF抵抗鸡新城疫病毒(NDV)感染能力的影响,用实时荧光PCR方法检测CEF培养体系中NDV含量的变化。结果显示,5种硫酸化多糖均可增强CEF抵抗和清除NDV感染的能力,其强弱顺序依次为sEPS5>sAPS60>sLMT2>sLBP14、sCAPS11、sEPS5、sAPS60和sLNT2的效果较好。试验Ⅷ五种硫酸化多糖促进鸡淋巴细胞增殖、IL-2和IL-6分泌的比较为了筛选增强免疫作用较好的硫酸化多糖,比较了sLNT2、sAPS60、sEPS5、sCAPS11和sLBP14的体外增强免疫作用。首先测定5种硫酸化多糖对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度,然后将5种硫酸化多糖分别单独或与ConA一起加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化,用ELISA方法测定淋巴细胞上清中IL-2和IL-6含量。结果表明,5种硫酸化多糖均可单独或协同ConA刺激淋巴细胞增殖,作用由强到弱的顺序为sAPS60>sEPS5>sCAPS11>sLBPM14、sLNT2,且有一定的浓度依赖关系；5种硫酸化多糖均可协同ConA刺激淋巴细胞分泌IL-2和IL-6,以sAPS60和sEPS5效果较好。试验Ⅸ叁种硫酸化多糖增强ND疫苗免疫效果的比较为了进一步筛选增强免疫作用较好的硫酸化多糖,14日雏鸡175羽随机分为5组,除空白对照组外用NDV-Ⅳ系苗免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,3个硫酸化多糖组分别一次皮下注射sAPS60、sEPS5和sLNT2,无佐剂对照组注射等量生理盐水。分别于首次免疫前和首次免疫后第7、14和21d每组随机抽取6羽翼下静脉采血,测定ND抗体效价；在第14和21d每组随机抽取4羽心脏采血,测定外周血淋巴细胞增殖及其分泌IL-2和IL-6的变化。于首次免疫后第23 d,除空白对照组外用NDV强毒攻毒,每天观察鸡群发病、死亡情况,连续观察14 d统计发病率、死亡率和免疫保护率。结果表明,3种硫酸化多糖能显着提高新城疫抗体效价,促进淋巴细胞增殖及其IL-2和IL-6的分泌,明显提高攻毒保护,sAPS60、sEPS5的效果优于sLNT2。
赵现敏[10]2007年在《中药多糖的免疫增强活性及其对抗体生成影响的研究》文中研究表明为筛选新型免疫增强剂,并研究其在临床上的应用,用水提醇沉法从传统中草药板蓝根、黄芪、山药和牛膝中提取和制备了板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖,采用体内试验与体外试验相结合的方法,研究了4种多糖对特异性免疫因素和非特异性免疫因素的影响,并通过动物试验比较了它们各自在临床应用时的免疫增强效果,试验成功地筛选出了免疫增强活性较好的中药多糖及其剂量,作为低毒、高效的新型免疫增强剂,以便为这些中药多糖作为畜禽免疫增强剂,尤其猪用免疫增强剂提供理论和临床依据。试验分为5部分,如下所述:试验1本试验用水提醇沉法从板蓝根、山药、黄芪和牛膝中提取和制备了板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖,并用硫酸葸酮比色法测定了其含量。4种中药多糖的净含量分别为:板蓝根多糖,58%;山药多糖,73%;黄芪多糖,65%;牛膝多糖,54%。以此作为后面试验的材料,为整个试验研究打下了基础。试验2为从板蓝根多糖、山药多糖、黄芪多糖和牛膝多糖中初步筛选免疫活性较好的中药多糖,用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素和溶血空斑形成试验,观察了4种多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素和溶血空斑形成的影响。结果表明,4种多糖均能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数,与对照组比较差异显着(P＜0.05和P＜0.01),能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能加强,从而加强机体的非特异性免疫作用;4种多糖也能显着提高小鼠血清溶血素含量和凝集素水平,与对照组比有极显着性差异(P＜0.01),说明这些多糖均能较好地提高小鼠的体液免疫水平,促进抗体的生成。试验3为筛选免疫活性较好的中药多糖和研制新型猪用免疫增强剂,用MTT比色法比较了不同浓度的板蓝根多糖、牛膝多糖、山药多糖和黄芪多糖对猪脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果表明,IRPS,ABPS,CYPS,APS均能显着刺激ConA或LPS诱导的猪脾淋巴细胞增殖(p＜0.05),且4种多糖促进猪脾淋巴细胞增殖的作用与多糖浓度有关。试验4为选择具有免疫增强活性的中药多糖及其最佳作用剂量,用淋巴细胞转化试验测定了不同浓度的板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖对体外培养猪脾脏淋巴细胞增殖功能的影响。结果表明,IRPS,APS,CYPS,ABPS均能显着地直接或协同LPS,ConA诱导的猪脾脏淋巴细胞增殖(P＜0.05);4种多糖促进猪脾脏淋巴细胞增殖的作用与多糖浓度密切相关,且不同多糖促进淋巴细胞增殖的最佳剂量不同。试验5为研究免疫增强剂在临床上的应用,用板蓝根多糖、黄芪多糖、山药多糖和牛膝多糖在PRRSV灭活疫苗免疫小猪后,将高、低剂量的4种中药多糖,一天一次,连续3天分别皮下注射,然后用ELISA试剂盒检测血清中的抗体水平,观察各种多糖对PRRSV灭活疫苗的免疫增强效果。结果发现,四种中药多糖的峰值抗体水平由高到低的顺序依次为IRPS＞CYPS＞APS＞ABPS,各组平均值均显着高于疫苗对照组(P＜0.05),表明IRPS、CYPS、APS和ABPS均具有明显提高猪特异性抗体的作用。上述研究结果表明,板蓝根多糖、山药多糖、黄芪多糖和牛膝多糖能够有效地促进小鼠的免疫机能,促进猪脾淋巴细胞增殖,提高猪抗体水平,表明4种中药多糖具有非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫增强作用,从而为这些中药多糖作为畜禽免疫增强剂,尤其猪用免疫增强剂提供理论和临床依据。
参考文献：
[1]. 中药成分对细胞增殖、病毒感染和抗体生成的影响[D]. 孔祥峰. 南京农业大学. 2003
[2]. 分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究[D]. 褚秀玲. 吉林大学. 2007
[3]. 几种中药成分及其复方抗病毒和增强免疫活性的研究[D]. 陈玉库. 南京农业大学. 2010
[4]. 蜂胶和硫酸化多糖的增强免疫和抗病毒活性研究[D]. 马霞. 南京农业大学. 2011
[5]. 芪蓝抗毒饮及其组方成分体外抗新城疫病毒作用及其机制初步研究[D]. 徐玉凤. 南京农业大学. 2009
[6]. 复方中药制剂对甲型流感病毒感染的抑制作用及其作用机制的研究[D]. 王学文. 中国农业大学. 2017
[7]. 黄芪多糖与白花蛇舌草多糖增强猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫效力及其机理研究[D]. 邵珊. 南京农业大学. 2009
[8]. 赤灵芝多糖抗病毒活性和增强免疫作用研究[D]. 张萍. 南京农业大学. 2015
[9]. 硫酸化香菇多糖的抗病毒和增强免疫活性及其与其他几种硫酸化多糖的比较[D]. 郭振环. 南京农业大学. 2010
[10]. 中药多糖的免疫增强活性及其对抗体生成影响的研究[D]. 赵现敏. 河南农业大学. 2007
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