导读:本文包含了转运结构域论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:ABC转运蛋白,结核分枝杆菌,渗透调节,x-ray
转运结构域论文文献综述
陈江淮[1]（2017）在《结核分枝杆菌ABC转运蛋白COG1732底物结合结构域的晶体学研究》一文中研究指出ABC转运蛋白是一类古老的、广泛存在的,出现在古细菌、真细菌及真核生物中的跨膜转运蛋白。这类蛋白的主要功能是通过水解ATP驱动物质的跨膜转运,它们一般由叁个结构域组成,包括跨膜结构域(TMDs),核酸结合结构域(NBDs)和底物结合结构域(SBDs)。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是导致结核病的高致病性病原,它的细胞膜具有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的共同特点,可在全身各个器官增殖,在肺中最为多见,而ABC转运蛋白所介导的物质转运可能是其适应不同宿主细胞内环境的重要机制。本研究主要针对结核分支杆菌中的一个ABC转运蛋白的底物结合蛋白质COG1732的生化功能及叁维结构展开。序列分析表明该蛋白与相容性溶质结合蛋白有27.8%的序列相同度,暗示了该蛋白可能与结核分枝杆菌对高渗透环境的适应有关,但是通过荧光淬灭实验我们发现该蛋白并不能结合甜菜碱、胆碱等相容性溶质。进一步通过化合物筛选我们发现一系列与COG1732结合的酚类化合物2`,6`-Dihydroxyacetophenone(2`,6`-HAP)、Monoacetylphloroglucinol(MAPG)、2`-Hydroxyacetophenone(2`-HAP)、4`-Hydroxyacetophenone(4`-HAP)、2`,4`-Dihydroxyacetophloroglucinol(DAPG)、Phloretin、2`,4`-Dihydroxyacetophenone(2`,4`-HAP)这些化合物与COG1732结合的解离常数在20 uM-200 uM之间。同时我们也尝试了对COG1732的结晶,通过对重组蛋白序列的优化,获得了高质量的蛋白晶体,这为揭示COG1732的生化功能以及其结合配体分子的结构生物学基础奠定了坚实的基础。(本文来源于《兰州大学》期刊2017-05-01）
张康宁[2]（2017）在《DENN结构域蛋白FAM45A在囊泡转运中的功能》一文中研究指出DENN(differentially expressed in normal and neoplastic cells)结构域是一种进化高度保守的结构域,主要功能是作为Rab蛋白的鸟苷酸交换因子(GFF)。Rab蛋白是一类通过招募特异的效应分子控制囊泡识别转运的小G蛋白,做为细胞内的分子开关,在细胞内膜泡运输过程中发挥重要作用。FAM45A是一种真核生物保守基因,存在于阿米巴、海胆、昆虫和脊椎动物中,但功能未知。通过生物信息学预测,FAM45A蛋白与DENN家族蛋白有相似性,提示可能参与膜转运过程。利用荧光蛋白和免疫荧光标记,我们发现FAM45A蛋白主要定位于晚胞内体和溶酶体,进一步研究发现FAM45A定位于多囊泡胞内体(multiple vesicular endosome,MVE)中的胞内体囊泡(Intraluminal vesicles),提示FAM45A参与细胞内物质囊泡运输中的晚胞内体/溶酶体阶段转运通路。FAM45A基因沉默后,会导致细胞的晚胞内体分布更靠近细胞核,并且EGFR降解变慢,说明FAM45A影响了细胞信号介导的胞吞途径。综上所述,我们发现FAM45A是一种新的调节细胞囊泡运输过程的蛋白。目的:研究FAM45A在囊泡转运中的功能方法:一、FAM45A的细胞器定位1.构建Citrine-FAM45A融合表达载体,研究FAM45A的细胞器定位构建pCitrine-FAM45A融合表达载体,转染Hela细胞使之过表达带有绿色荧光的FAM45A蛋白,同时共转染红色荧光标记细胞器marker,如EEA1、Lamp1等,利用激光共聚焦显微镜确定FAM45A的细胞器定位。为了观测FAM45A在胞内体囊泡上的定位,利用apilimod处理细胞,使膜状细胞器变大,进一步观察FAM45A在晚胞内体和溶酶体上的确切定位。2.研究内源性FAM45A的细胞器定位利用免疫荧光技术,同时孵育FAM45A抗体和细胞器marker抗体,如CD63、Lamp1等,通过激光共聚焦显微镜确定FAM45A的细胞器定位。利用NH_4Cl碱性试剂处理细胞,使膜状细胞器变大,进一步研究内源性FAM45A在晚胞内体和溶酶体上的确切定位。二、FAM45A基因沉默后对细胞器表型和EFGR降解的影响1.构建FAM45A基因沉默细胞系包装FAM45A shRNA慢病毒颗粒,侵染Hela细胞,利用puromycin筛选出抗性细胞。利用q-PCR和Western Blotting(WB)分别检测FAM45A的mRNA表达和蛋白表达水平。2.研究FAM45A基因沉默后细胞器形态变化利用免疫荧光技术,分别孵育CD63和Lamp1抗体,观察FAM45A下调表达后对晚胞内体和溶酶体表型的影响;利用Lysotracker染料观察对酸性胞内体的变化。3.研究FAM45A基因沉默后对EGFR降解的影响用EGF刺激饥饿后的FAM45A基因沉默细胞系及对照组,提取0、10、90、150min总蛋白,利用Western Blotting检测EGFR降解速度的变化。结果:一、FAM45A的细胞器定位FAM45A蛋白主要定位于晚胞内体和溶酶体,进一步研究发现FAM45A定位于MVE中的胞内体囊泡(Intraluminal vesicles)上。二、FAM45A基因沉默后对细胞器表型和EFGR降解的影响1.构建成功FAM45A基因沉默细胞系,经q-PCR和WB检测,FAM45A的mRNA和蛋白表达水平均显着下降。2.FAM45A基因沉默后会导致CD63标记的晚胞内体的分布更靠近细胞核,Lamp1标记的溶酶体变大。3.FAM45A下调表达后导致EGFR降解变慢。结论:1.FAM45A定位于晚胞内体和溶酶体膜上,FAM45A还定位于MVE中的胞内体囊泡(Intraluminal vesicles)上。2.FAM45A影响晚胞内体和溶酶体的定位以及EGFR的降解,说明FAM45A参与调控晚胞内体/溶酶体阶段的囊泡转运。(本文来源于《苏州大学》期刊2017-04-01）
郑毅[3]（2013）在《淀粉样前体蛋白通过其不同N端结构域调控自身转运与加工》一文中研究指出阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是一种破坏性的神经退行性疾病,折磨着全球数百万的患者。越来越多的生物化学和遗传学证据显示淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)在AD的发病机制中奠定了举足轻重的作用。生物化学上,不断积累的APP加工产物β-淀粉样肽(beta-amyloid peptide,Aβ)形成不可溶性聚集物,它是AD独特的病理特征;遗传学上,无论是APP点突变,还是野生型APP基因重复往往都会提高Aβ生成,这些都与一部分早发性家族型AD(familial AD,FAD)和脑淀粉样血管病息息相关。APP是Ⅰ型跨膜蛋白质,它类似于一种细胞表面受体,并包含一个大的胞外N端结构域和一个短的胞质尾。β-和γ-分泌酶依次切割APP并释放出神经毒性的Aβ,相反,α-分泌酶却从Aβ中间切割阻止其产生。此外,翔实的证据表明改变APP的分泌和内吞转运途径直接影响到APP自身与这些分泌酶的相互作用以及Aβ产生。虽然APP生成Aβ被广泛的研究,但是APP N端结构域贡献于Aβ产生的问题仍然难以捉摸。利用系统性删除策略,我们已经鉴定出四种新的候选APP模体,它们可以调节APP自身加工和Aβ生成。(1)删除APP ACIDIC结构域不仅促进α-分泌酶加工APP,而且同时抑制β-分泌酶BACE1对其加工,并产生较少的胞外Aβ和胞内 iAβ(intracellular Aβ,iAβ);(2)删除 APP CAPPD 结构域能提升 BACE1 和 α-分泌酶加工APP,且伴随着Aβ和iAβ的增加。它似乎是由于缺乏APP CAPPD能增强其与BACE1的作用。与此相反,仅删除CAPPD结构域的α3螺旋将极大的减弱BACE1和α-分泌酶加工APP;(3)剔除RC结构域后,APP与BACE1的作用得到强化,并进一步提高了 BACE1和α-分泌酶对其加工。缺少RC结构域的APP加工呈现两种不同的效应,一方面增加Aβ,而另一方面却减少iAβ;(4)去除APP JMD结构域不仅抑制BACE1处理APP,而且促进非BACE1依赖性的β-分泌酶加工APP。另外,非BACE1依赖性的β-分泌酶切割APP位点在Aβ的N端之外,大概位于APPRC结构域内。正因为如此,所以能产生N端延长的长形式Aβ。这样的切割位点大概有三个,并可以被APPJMD结构域所调节。接着我们试图描绘APP N端嵌合体的转运路线。我们构建了一系列的限定APP于某特定亚细胞器加工的转运突变体。实验结果揭示分泌和内吞途径的缺陷将会削弱Aβ和iAβ的产生,而且iAβ的生成并不依赖内吞体途径。因此,我们利用iAβ作为APP亚细胞定位的指标。根据iAβ变化水平,删除APP ACIDIC或者RC结构域将阻止APP退出TGN,而删除CAPPD结构域会促进APP向内吞体定位。此外,我们还将APP整个胞外N端结构域替换成红色荧光蛋白质mCherry,并且在APP胞质尾添加增强型绿色荧光蛋白质EGFP,从而产生双色荧光蛋白质标记的APP嵌合体mC99G。mC99G能模拟α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶以及caspase加工APP的情形。mC99G、C99G和APP695G具有类同的亚细胞定位。γ-分泌酶抑制剂DAPT处理后,尽管mC99G的mCherry信号与APP695G相似,但是mC99G的EGFP信号表现的更像C99G,即大量EGFP信号聚集在质膜上。细胞表面的生物素标记显示质膜处的聚集组分主要为CTFα-EGFP,这表明α-分泌酶介导的CTFβ-EGFP向CTFα-EGFP转化可能主要发生在质膜处。鉴于mC99G的代谢物水平接近C99G对应物,故认为APP胞外结构域对其自身转运与加工非常关键。另外,mC99G也可以作为一种APP加工研究的有用工具。作为应用,我们发现mC99G及其衍生物能通过exosome分泌至胞外环境中。(本文来源于《兰州大学》期刊2013-10-01）
罗燕,程建兵,谭晓华,尹小菲,杨磊[4]（2012）在《叁磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究》一文中研究指出目的检测叁磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域。方法采用重迭区扩增基因拼接法构建叁磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量。结果激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上。CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC50分别为33.18、32.84、33.45、34.29μmol.L-1,与转染野生型叁磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC50为33.96μmol.L-1)无显着差异,均高于空载体转染对照组(IC50为19.01μmol.L-1)。转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC50为19.95μmol.L-1,与空载体对照组无显着差异,显着低于野生型叁磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组。原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失叁磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型叁磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致。结论成功构建了5个叁磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上。突变体(除胞外第6环外)仍然具有一定的抗砷性,提示叁磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域。(本文来源于《中国药学杂志》期刊2012年23期）
张慧[5]（2012）在《TAT蛋白转运结构域介导的重组蛋白诱导成体细胞重编程》一文中研究指出诱导干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS或iPSCs)的建立在再生医学领域有着极大的应用潜力。但是,在该技术应用于临床之前,安全与效率是其必须应对的重要问题。众多研究致力于推进以上问题的解决：介导重编程因子转染供体细胞的方法由最初的整合型病毒(逆转录病毒、慢病毒)到非整合型病毒(腺病毒),继而发展到无病毒(如PB转座子系统、episome),直至穿膜肽介导的目的因子融合蛋白直接转运至细胞内。09年4月,Zhou等人利用11精氨酸穿膜肽介导四因子融合蛋白建立了小鼠蛋白iPS细胞系(protin-iPS, p-iPS),同年5月Kim等人利用同方法建立了人p-iPS。由于蛋白诱导iPS彻底排除了外源遗传物质,被认为是目前为止最安全的iPS诱导方法。但是,以上的非整合型的诱导方法效率低、耗时长、不稳定,增加了细胞变异的可能,限制了iPS在临床和研究方面的应用。TAT-PTD是迄今为止应用最为广泛的转膜肽,大量研究表明该系统能够介导多种融合蛋白高效转染不同种类的细胞且重折迭后的外源蛋白多具有生物学活性。我们尝试检测TAT-PTD转导系统是否可以促进蛋白iPS细胞系的建立。在本工作中,我们运用TAT蛋白转导结构域构建了TAT-PTD介导的蛋白转运系统。通过原核表达His-TAT-Sox2/Oct4/Klf4/c-Myc/Nanog等多能因子融合蛋白；从TAT融合蛋白转染条件、工作浓度、孵育时间等方面优化转染效果,并检测融合蛋白在细胞内的稳定性；在多细胞系上测试TAT-目的蛋白的转染效果以测定所得优化条件的稳定性和通用性。在所得条件下,于成体细胞重编程系统中比较TAT和11精氨酸(11R)蛋白转导结构域的异同,并探索基于蛋白转导结构域的重编程因子(reprogramming factor, RF)重组蛋白诱导iPS的条件。我们发现：TAT和11R融合重编程因子具有转录活性,在荧光素报告系统中能够激活其对应的下游靶基因的报告基因。TAT-RFs在转录活性上要优于相应的11R-RFs,但弱于相应的病毒因子。在我们构建的“3病毒+1蛋白”重编程系统中,TAT-RF能够一定程度上替代相应病毒因子的作用,同时利用该实验系统最终确定各TAT-转录因子在重编程过程中的工作条件,确定了TAT-转录因子融合蛋白(4因子)诱导iPS的诱导策略和具体条件：四个TAT-RFs因子(各50nM工作浓度,每次孵育2h)每48h孵育HFFs细胞至第17天。遗憾的是,在以上实验条件下,我们并没有获得iPS状克隆(OCT4, NANOG和AP阳性)。这个结果暗示TAT-RFs的转录活性或许相较对应病毒因子较弱。我们又进行了进一步的探索：增加TAT-mNanog和联合使用小分子组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA来增强重组蛋白的重编程活性。在此方法下,两周即可出现与iPS形态相似的克隆。经检测,这些克隆具iPS形态学特征,呈AP染色阳性,在转录水平和蛋白水平上表达多能相关基因。这说明TAT介导的融合蛋白转录因子在较短时间内起始了人成体细胞HFFs的重编程过程,且AP阳性克隆得率与病毒诱导iPS的效率相当。我们的工作的兴趣点在于：利用不同系统中(如从荧光素报告系统,“3病毒+1蛋白”重编程系统)摸索PTD-融合蛋白转染条件、工作浓度、孵育时间等方面的合适条件,探索优化蛋白iPS诱导策略。针对蛋白转录因子转录活性可能低于相应病毒转录因子这一制约蛋白-iPS应用的瓶颈,我们增加TAT-mNanog和联合使用小分子组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA来增强重组蛋白的重编程活性,从而在细胞水平上(AP染色,多能因子在转录水平和蛋白水平的表达)证明说明TAT介导的融合蛋白转录因子在较短时间内起始了人成体细胞HFFs的重编程过程,且AP阳性克隆得率与病毒诱导iPS的效率相当。我们的工作对TAT融合重编程因子在重编程过程中的系统检测,可以为建立具临床应用价值和不含外源遗传物质的人iPSC的获得提供依据。(本文来源于《华东师范大学》期刊2012-09-01）
赵宇,武军华,贾培媛,吴少平,高珊[6]（2011）在《反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用》一文中研究指出目的研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将TAT,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因。将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白。同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照。在20%O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性。小鼠尾静脉注射不同融合蛋白(10 mg.kg-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性。结果由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织。TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20%O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1%O2细胞及组织中。结论 TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜。引入ODD,20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1%O2细胞和组织中,说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中。(本文来源于《中国药理学与毒理学杂志》期刊2011年05期）
田伟,余多慰[7]（2010）在《牛阴离子交换蛋白1和生电碳酸氢钠协同转运蛋白亲水结构域的克隆·表达和纯化》一文中研究指出[目的]表达和纯化牛阴离子交换蛋白1(AE1)和生电碳酸氢钠协同转运蛋白(NBCe1)的亲水结构域。[方法]根据AE1和NBCe1的亲水结构域设计引物,通过PCR扩增牛AE1和NBCe1的亲水结构域,通过原核表达系统,以E.coliBL21(DE3)为表达宿主,经IPTG诱导,表达重组的牛AE1和NBCe1的亲水结构域融合蛋白,并采用金属螯合层析法对目的蛋白进行纯化。15%SDS-PAGE分析目的蛋白的表达、分布和纯度。[结果]PCR扩增了牛AE1和NBCe1的亲水结构域;IPTG诱导后,成功的表达了目的蛋白;目的蛋白主要存在大肠杆菌的胞浆中,可以被较好的纯化。[结论]牛AE1和NBCe1的亲水结构域蛋白的表达为制备抗体和研究膜载体蛋白的调节机理提供了条件。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2010年01期）
孙占华,王世珍,黄萱,许淼,隋森芳[8]（2008）在《镁离子转运蛋白CorA间质结构域删除分析》一文中研究指出为了研究CorA的镁离子转运机理,对大肠杆菌CorA的间质结构域区进行了删除突变分析,并利用酵母突变体互补技术进行了突变体活性测定。以酿酒酵母质膜镁离子转运系统敲除突变体菌株CM66及其基因型对照菌株CM52为宿主菌,建立了大肠杆菌CorA转运活性测定体系。结果显示:大肠杆菌CorA间质结构域N-端起始的24个残基对于CorA在酵母质膜中的表达或维持其本身正确构象发挥重要作用,CorA M124到D154段的部分残基在CorA介导的镁离子转运过程中起到重要作用。(本文来源于《清华大学学报(自然科学版)》期刊2008年06期）
孙占华,王世珍,黄萱,许淼,隋森芳[9]（2008）在《镁离子转运蛋白CorA间质结构域删除分析》一文中研究指出为了研究CorA的镁离子转运机理,对大肠杆菌CorA的间质结构域区进行了删除突变分析,并利用酵母突变体互补技术进行了突变体活性测定。以酿酒酵母质膜镁离子转运系统敲除突变体菌株CM66及其基因型对照菌株CM52为宿主菌,建立了大肠杆菌CorA转运活性测定体系。结果显示:大肠杆菌CorA间质结构域N-端起始的24个残基对于CorA在酵母质膜中的表达或维持其本身正确构象发挥重要作用,CorAM124到D154段的部分残基在CorA介导的镁离子转运过程中起到重要作用。(本文来源于《清华大学学报(自然科学版)网络.预览》期刊2008年06期）
王海珍,许予明,陈奎生,李惠翔,张红新[10]（2007）在《反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运》一文中研究指出目的探讨HIV-1反式激活蛋白(TAT)的蛋白转导结构域(PTD)介导绿色荧光蛋白(EGFP)在小鼠体内的跨膜转运作用。方法采用PCR及克隆技术构成表达载体pET28a-TAT-EGFP,在大肠杆菌中表达TAT-EGFP融合蛋白,将纯化后的融合蛋白注入小鼠尾静脉,取脑、心肌、肝、脾和肾等器官冰冻切片,荧光显微镜下观察融合蛋白在组织中的分布。结果表达和纯化了分子量为28KD的TAT-EGFP融合蛋白,在小鼠的肝、心肌、脑、肾和脾等组织切片荧光检测呈阳性。结论TAT可介导EGFP在广泛组织内的跨膜转导,这一研究为外源活性大分子物质进入组织细胞提供了一个新的途径。(本文来源于《中国现代医学杂志》期刊2007年10期）
转运结构域论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
DENN(differentially expressed in normal and neoplastic cells)结构域是一种进化高度保守的结构域,主要功能是作为Rab蛋白的鸟苷酸交换因子(GFF)。Rab蛋白是一类通过招募特异的效应分子控制囊泡识别转运的小G蛋白,做为细胞内的分子开关,在细胞内膜泡运输过程中发挥重要作用。FAM45A是一种真核生物保守基因,存在于阿米巴、海胆、昆虫和脊椎动物中,但功能未知。通过生物信息学预测,FAM45A蛋白与DENN家族蛋白有相似性,提示可能参与膜转运过程。利用荧光蛋白和免疫荧光标记,我们发现FAM45A蛋白主要定位于晚胞内体和溶酶体,进一步研究发现FAM45A定位于多囊泡胞内体(multiple vesicular endosome,MVE)中的胞内体囊泡(Intraluminal vesicles),提示FAM45A参与细胞内物质囊泡运输中的晚胞内体/溶酶体阶段转运通路。FAM45A基因沉默后,会导致细胞的晚胞内体分布更靠近细胞核,并且EGFR降解变慢,说明FAM45A影响了细胞信号介导的胞吞途径。综上所述,我们发现FAM45A是一种新的调节细胞囊泡运输过程的蛋白。目的:研究FAM45A在囊泡转运中的功能方法:一、FAM45A的细胞器定位1.构建Citrine-FAM45A融合表达载体,研究FAM45A的细胞器定位构建pCitrine-FAM45A融合表达载体,转染Hela细胞使之过表达带有绿色荧光的FAM45A蛋白,同时共转染红色荧光标记细胞器marker,如EEA1、Lamp1等,利用激光共聚焦显微镜确定FAM45A的细胞器定位。为了观测FAM45A在胞内体囊泡上的定位,利用apilimod处理细胞,使膜状细胞器变大,进一步观察FAM45A在晚胞内体和溶酶体上的确切定位。2.研究内源性FAM45A的细胞器定位利用免疫荧光技术,同时孵育FAM45A抗体和细胞器marker抗体,如CD63、Lamp1等,通过激光共聚焦显微镜确定FAM45A的细胞器定位。利用NH_4Cl碱性试剂处理细胞,使膜状细胞器变大,进一步研究内源性FAM45A在晚胞内体和溶酶体上的确切定位。二、FAM45A基因沉默后对细胞器表型和EFGR降解的影响1.构建FAM45A基因沉默细胞系包装FAM45A shRNA慢病毒颗粒,侵染Hela细胞,利用puromycin筛选出抗性细胞。利用q-PCR和Western Blotting(WB)分别检测FAM45A的mRNA表达和蛋白表达水平。2.研究FAM45A基因沉默后细胞器形态变化利用免疫荧光技术,分别孵育CD63和Lamp1抗体,观察FAM45A下调表达后对晚胞内体和溶酶体表型的影响;利用Lysotracker染料观察对酸性胞内体的变化。3.研究FAM45A基因沉默后对EGFR降解的影响用EGF刺激饥饿后的FAM45A基因沉默细胞系及对照组,提取0、10、90、150min总蛋白,利用Western Blotting检测EGFR降解速度的变化。结果:一、FAM45A的细胞器定位FAM45A蛋白主要定位于晚胞内体和溶酶体,进一步研究发现FAM45A定位于MVE中的胞内体囊泡(Intraluminal vesicles)上。二、FAM45A基因沉默后对细胞器表型和EFGR降解的影响1.构建成功FAM45A基因沉默细胞系,经q-PCR和WB检测,FAM45A的mRNA和蛋白表达水平均显着下降。2.FAM45A基因沉默后会导致CD63标记的晚胞内体的分布更靠近细胞核,Lamp1标记的溶酶体变大。3.FAM45A下调表达后导致EGFR降解变慢。结论:1.FAM45A定位于晚胞内体和溶酶体膜上,FAM45A还定位于MVE中的胞内体囊泡(Intraluminal vesicles)上。2.FAM45A影响晚胞内体和溶酶体的定位以及EGFR的降解,说明FAM45A参与调控晚胞内体/溶酶体阶段的囊泡转运。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转运结构域论文参考文献
[1].陈江淮.结核分枝杆菌ABC转运蛋白COG1732底物结合结构域的晶体学研究[D].兰州大学.2017
[2].张康宁.DENN结构域蛋白FAM45A在囊泡转运中的功能[D].苏州大学.2017
[3].郑毅.淀粉样前体蛋白通过其不同N端结构域调控自身转运与加工[D].兰州大学.2013
[4].罗燕,程建兵,谭晓华,尹小菲,杨磊.叁磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究[J].中国药学杂志.2012
[5].张慧.TAT蛋白转运结构域介导的重组蛋白诱导成体细胞重编程[D].华东师范大学.2012
[6].赵宇,武军华,贾培媛,吴少平,高珊.反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用[J].中国药理学与毒理学杂志.2011
[7].田伟,余多慰.牛阴离子交换蛋白1和生电碳酸氢钠协同转运蛋白亲水结构域的克隆·表达和纯化[J].安徽农业科学.2010
[8].孙占华,王世珍,黄萱,许淼,隋森芳.镁离子转运蛋白CorA间质结构域删除分析[J].清华大学学报(自然科学版).2008
[9].孙占华,王世珍,黄萱,许淼,隋森芳.镁离子转运蛋白CorA间质结构域删除分析[J].清华大学学报(自然科学版)网络.预览.2008
[10].王海珍,许予明,陈奎生,李惠翔,张红新.反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运[J].中国现代医学杂志.2007