一、SARS-CoV核衣壳蛋白重组表达及单克隆抗体特性鉴定（论文文献综述）
马珍珍,李蓉芳,向苗,阿月,何庆华[1]（2021）在《新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备》文中认为目的制备新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）。方法根据公布的新冠病毒全基因组序列,构建其核衣壳蛋白的表达载体pET-28a-N,并转化至EscherichiacoliBL21（DE3）进行原核表达,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）及Western blot鉴定纯化后的核衣壳蛋白重组抗原的特异性,并免疫Balb/c系小鼠,基于杂交瘤融合技术筛选获得可持续分泌新冠病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的细胞株,并基于ELISA及生物膜层干涉（biofilm layer interference, BLI）技术鉴定单克隆抗体的特异性和亲和力。结果基于大肠杆菌原核表达获得新冠病毒核衣壳蛋白的重组抗原,其纯度可达90%,筛选获得7株可分泌特异性结合新冠病毒核衣壳蛋白的杂交瘤细胞株,经Western blot、ELISA及分子相互作用分析等方法证实所获得的单克隆抗体与核衣壳蛋白具有优良的结合特异性和结合活性,其中的7E11、7E8单克隆抗体与核衣壳蛋白抗原的亲和力常数分别为1.69×10-9、2.031×10-9 mol/L,可作为抗体元件应用于新冠病毒的快速免疫分析领域。结论本研究获得高特异性的SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原及其单克隆抗体。
杨韧[2]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中提出冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
曲园园[3]（2021）在《人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体筛选与抗体功能研究》文中指出严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）是一种具有包膜的单股正链RNA病毒,属于β-冠状病毒。新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）,是由SARS-CoV-2感染人体所导致的疾病。COVID-19的全球大流行对人类健康构成严重威胁,同时也为病毒突变提供了大量机会。SARS-CoV-2刺突蛋白（S）上的突变可对SARS-CoV-2的感染性、致病性产生较大影响。中和抗体可以有效阻断SARS-CoV-2的感染,但目前已有多种SARS-CoV-2突变株对已上市的单克隆抗体逃逸,因此开发具有广谱中和活性的单克隆抗体,以及研究识别不同表位的协同作用抗体,是未来SARS-CoV-2治疗性抗体开发的方向。本研究筛选得到了 12株单克隆抗体,并对抗体的亲和力、中和活性等生物学功能进行评价,同时也评价了抗体对SARS-CoV-2突变株的中和活性,最后得到了 2株高亲和力,可有效中和多种突变株的中和性抗体。本研究从COVID-19疫情早期恢复期患者的外周血淋巴细胞中扩增得到抗体基因,成功构建Fab噬菌体抗体库。抗体库库容较高,多样性良好,满足抗体筛选的基本需要。本研究使用SARS-CoV-2 S蛋白的三个片段,包括RBD（Receptor Binding Domain,RBD）、S1和S2对抗体库进行筛选。经3轮筛选过程共获得12株序列不同的特异性针对SARS-CoV-2 S蛋白的人源单克隆抗体。经ELISA鉴定,9株抗体与RBD结合,3株与S2结合,未筛选到与S1蛋白N端结构域（Nterminal domain,NTD）结合的抗体。在9株RBD特异性抗体中,两株抗体（F61、H121）具有高亲和力、高中和活性;一株抗体（A199）具有高亲和力,但无中和活性。表明结合于RBD的抗体不一定为中和抗体,RBD蛋白上存在非中和表位。9株RBD特异性抗体可根据其识别的抗原表位被分为三种类型。其中一种以F61为代表,能够识别位于位于G446-S494范围内的具有高中和活性的线性血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2,ACE-2）竞争表位。另一种以H121为代表,识别与ACE-2结合位点不重叠的位于RBD蛋白侧面的中和表位。这表明不与ACE-2竞争的抗体也可能具有中和活性。最后一种抗体A199识别一种与ACE-2结合位点的非重叠,且不具有中和活性的表位。由于目前多种SARS-CoV-2突变株带有S蛋白突变,本研究评价了9株RBD特异性抗体对SARS-CoV-2 S蛋白单氨基酸突变的中和效果,F61和F163可有效中和多种S蛋白单氨基酸突变株。F61和H121可有效中和B.1.1.7和B.1.351,可作为突变株的候选治疗抗体。F61和H121的混合物可更有效的中和SARS-CoV-2野生株、B.1.1.7株和B.1.351株,该混合物具有更广泛的中和效果,可避免免疫逃逸发生。综上所述,本研究筛选得到了2株（F61和H121）具有高亲和力、高中和活性的、识别不同抗原表位单克隆抗体。这两株抗体可有效中和包括B.1.1.7和B.1.351在内的多种突变株。二者的混合物可更有效的中和SARS-CoV-2野生株、B.1.1.7株和B.1.351株,可避免免疫逃逸的发生。这两株抗体可作为突变株的候选治疗抗体,并为当前和未来的疫苗设计、治疗性抗体开发以及SARS-CoV-2及其新变种的抗原诊断提供了指导。
杨扬[4]（2021）在《新冠病毒入胞途径及天然小分子抑制剂的发现与研究》文中研究表明目的:新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）暴发一年多以来,已经给人类的生命与健康带来了不可挽回的损失,也对世界各国的经济造成了巨大的影响。了解SARS-CoV-2侵染宿主细胞的过程对抗病毒感染药物的设计和研发具有战略性的意义。基于此,本研究拟构建SARS-CoV-2及其流行变异株的假病毒系统,以研究SARS-CoV-2的入胞途径,筛选抗SARS-CoV-2感染的天然小分子抑制剂并研究其作用机制。此外,构建SARS-CoV-2小鼠感染模型,并利用假病毒系统进行验证。方法:1.双报告假病毒系统的构建:（1）刺突蛋白表达载体的构建与鉴定:通过序列优化合成、点突变等分子生物学的手段获得目的片段,连接到真核表达载体上,获得包含SARS-CoV-2及其变异株,以及SARS-CoV、MERS-CoV的刺突蛋白质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及测序保证质粒的正确性;（2）假病毒的包装及鉴定:利用慢病毒三质粒系统包装SARS-CoV-2及其变异株以及SARS-CoV、MERS-CoV的双报告（绿色荧光蛋白及萤火虫荧光素酶）假病毒,采用超滤的方法进行浓缩,利用western blot检测假病毒的刺突蛋白,通过感染实验检测假病毒的感染能力并测定假病毒滴度,利用重组蛋白血管紧张素转化酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2,ACE2）-Fc和ACE2-his对假病毒刺突蛋白的功能进行验证。2.SARS-CoV-2入胞途径的研究:（1）利用激光共聚焦成像技术观察SARS-CoV-2假病毒入胞后的定位;（2）通过假病毒感染抑制实验研究各种入胞途径的化学抑制剂对假病毒入胞的影响;（3）通过入胞途径相关蛋白的显性抑制/显性激活突变体与人血管紧张素转化酶2（human ACE2,hACE2）质粒的共转染实验,研究参与SARS-CoV-2入胞过程的相关蛋白。3.抗SARS-CoV-2感染的天然小分子抑制剂的筛选:（1）初筛:通过SARS-CoV-2假病毒感染抑制实验对一个含89种植物源天然小分子化合物库进行初步筛选;（2）候选分子抗SARS-CoV-2感染活性的评价:通过CCK-8法检测候选分子的细胞毒性,确定安全作用浓度,通过观察绿色荧光细胞数量及检测细胞荧光素酶活性分析候选分子抗SARS-CoV-2感染的活性;（3）候选分子抗SARS-CoV-2感染机制研究:通过不同时间点给药研究候选分子具体作用阶段,利用共聚焦成像技术观察候选分子是否影响SARS-CoV-2假病毒入胞后的定位,通过western blot及实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,q RT-PCR）方法检测候选分子对SARS-CoV-2假病毒结合和内吞的影响,通过膜融合抑制实验分析候选分子对SARS-CoV-2假病毒膜融合的影响,通过胞外/胞内钙离子功能抑制实验研究钙离子对膜融合的影响,及其对候选分子抗SARS-CoV-2假病毒感染活性的影响。4.SARS-CoV-2小鼠感染模型的建立:通过胸腔注射携带hACE2的重组腺相关病毒9载体（Recombinant Adeno-associated Virus 9,rAAV9）构建肺脏高表达hACE2的小鼠模型;利用SARS-CoV-2假病毒感染该小鼠模型,来验证该小鼠模型的可用性。结果:1.通过慢病毒三质粒系统成功构建了高滴度的SARS-CoV-2原始病毒株及其多种变异株、SARS-CoV、MERS-CoV的假病毒。（1）Western blot结果证明了刺突蛋白成功包装到假病毒中;（2）重组蛋白ACE2-Fc和ACE2-his能够抑制SARS-CoV-2假病毒对宿主细胞的感染,验证了SARS-CoV-2假病毒结合ACE2的能力。以上结果表明了这些假病毒可用来模拟刺突蛋白介导的病毒侵染宿主细胞的过程。2.关于SARS-CoV-2入胞途径的研究结果:（1）通过激光共聚焦成像技术验证了SARS-CoV-2假病毒能够利用核内体依赖途径进入宿主细胞,并定位于核内体;（2）利用多种入胞途径的化学抑制剂及相关蛋白显性抑制/激活突变体,发现SARS-CoV-2假病毒可通过网格蛋白依赖途径及P21-活化激酶1（P21-activated kinase 1,Pak1）、Rac1依赖的巨胞饮途径侵染宿主细胞,同时受ADP核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor,Arf6）的调控。3.关于SARS-CoV-2天然小分子抑制剂筛选的研究结果:（1）基于假病毒系统筛选出甲基莲心碱具有潜在的广谱抗冠状病毒感染活性,包括抗SARS-CoV-2原始病毒株及其多种变异株（D614G变异株、N501Y/D614G变异株、英国变异株501Y.V1、南非变异株501Y.V2及巴西突变株501Y.V3）感染活性及抗SARS-CoV和MERS-CoV感染活性。（2）在抗SARS-CoV-2假病毒感染方面,甲基莲心碱的作用效果要优于其类似物异莲心碱和莲心碱。（3）作用机制研究发现新冠病毒与SARS-CoV、MERS-CoV一样,其膜融合阶段是钙离子依赖的。甲基莲心碱通过阻断宿主细胞的钙离子通道来抑制刺突蛋白介导的膜融合,进而抑制SARS-CoV-2假病毒的感染。4.关于建立SARS-CoV-2小鼠感染模型的研究结果:利用胸腔注射rAAV9-hACE2成功构建了SARS-CoV-2易感小鼠模型,SARS-CoV-2假病毒感染该小鼠模型,荧光素酶从第7天开始逐渐表达,第14天达到稳定且至少能够持续5周。免疫组化结果验证了该小鼠模型肺脏hACE2的高表达。结论:本研究利用假病毒系统发现SARS-CoV-2能够利用网格蛋白依赖途径及Pak1、Rac1依赖的巨胞饮途经侵染宿主细胞,并受Arf6的调控。同时,利用假病毒系统从植物源天然小分子化合物库中筛选得到一种具有广谱抗冠状病毒感染的双苄基异喹啉类生物碱—甲基莲心碱。甲基莲心碱通过抑制钙离子依赖的病毒包膜与核内体膜的融合发挥抗感染作用。以上结果为开发广谱抗冠状病毒感染的药物提供了一定的线索和理论依据。此外,成功构建了rAAV9-hACE2小鼠模型,为在动物水平评价SARS-CoV-2侵染抑制剂（如小分子和抗体等）和疫苗的保护效果提供了较为简单的替代模型。
武奇[5]（2021）在《IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究》文中研究指明传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要表现为呼吸道与肾脏疾病。IBV目前仍是危害养禽业的重要病原体之一,给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在控制IB方面扮演着重要作用,IBV抗原的不断变异严重制约了现有的疫苗研发策略和血清学诊断。S蛋白是含有丰富中和抗原表位的表面蛋白,也是病毒进入宿主细胞的关键蛋白。但是目前对于S蛋白功能的认识及其与宿主细胞的互作还知之甚少。因此,本研究围绕IBV防控关键技术的开发,从S蛋白广谱中和表位鉴定及S蛋白与宿主细胞互作两个方面进行了研究。具体内容如下:1、传染性支气管炎病毒S蛋白新的关键抗原表位鉴定本研究首先利用软件对IBV S蛋白进行分析,根据S蛋白序列的抗原性、亲水性、表面抗原指数、保守性等指标,选取并人工合成五条抗原性和亲水性好、高度保守的多肽。通过多肽和血清交叉反应,证明五条多肽均与IBV血清有反应原性,其中Pep1的反应性最好,可以与检测的5个血清型中的4个血清型血清有很好的交叉反应性,仅仅不与New cluster型毒株CK/CH/2010/JT1的血清发生交叉反应。人工合成CK/CH/2010/JT1株的该段多肽序列,命名Pep6。通过对多肽序列比较分析,发现Pep1与Pep6序列存在5个氨基酸差异。多肽血清交叉反应结果显示Pep6不仅可以与CK/CH/2010/JT1血清反应,同时与所有检测血清均发生交叉反应。为了确定影响抗原性改变的关键氨基酸,对多肽进行截短和单个氨基酸突变,最后确定16R氨基酸是决定抗原表位广谱性的关键氨基酸。对NCBI数据库中所有的全基因毒株进行序列分析,发现传统的Mass型毒株均是16K毒株,而目前在中国流行的QX型,TW-1型等毒株均是16R突变株,进一步分析发现,16R突变株自20世纪90年代开始出现,随后发展成为流行优势株,目前在全球各大洲均有分布。本研究鉴定了一个广谱的抗原表位,并证明了 16R氨基酸是该抗原表位具有广谱性的关键。这为新型广谱疫苗的研发和检测方法的建立提供了一定理论指导。2、检测IBV抗体多肽ELISA方法的建立及初步应用本实验室在前期的IBV流行病学调查过程中发现,现有的商品化IBV抗体检测试剂盒,不能很好的检测出新型IBV变异株的血清抗体。利用Pep6抗原表位多肽作为包被抗原,建立检测IBV抗体的pELISA方法。本研究首先对检测条件进行优化,确定pELISA最佳反应条件为:最佳包被浓度0.63 μg/mL;血清最佳稀释度为1:200;血清最佳孵育时间为60 min;酶标抗体最佳孵育时间60 min;底物最佳反应时间20 min。确定pELISA的临界值为0.185。批间和批内重复性检测结果显示变异系数均小于10%,具有很好的重复性。特异性检测结果表明pELISA其他禽类病毒阳性血清均不发生非特异性反应。以IFA为参考方法,测定了 250份临床血清样品,结果显示,pELISA的敏感性、特异性和准确性分别为99.14%、94.12%和98.80%,显着高于商品化试剂盒。为评估pELISA在检测IBV疫苗引起的免疫应答中的适用性,本研究测定了 IBVH52、4/91疫苗免疫后不同时间点采集的血清,结果显示pELISA最早在疫苗接种后7 d就能检测出IBV特异性抗体,而商品化试剂盒在免疫后14 d才能检测出IBV特异性抗体。进一步分析发现,pELISA检测出的阳性率明显高于商品化的ELISA试剂盒,提示本研究建立的pELISA在检测IBV抗体和评价IBV疫苗方面具有一定的应用价值。3、应用pELISA替代中和实验评估IBV疫苗免疫应答的初步研究鸡群中血清的中和抗体是反映鸡群免疫状况的主要指标,也是评价疫苗免疫效果的关键指标之一。传统上用中和试验测定血清中和抗体,但中和实验操作复杂,技术程度较高,制约了疫苗应用后的效率评价。然而,目前还没有简单、快速的检测IBV中和抗体的替代方法。为此,探究了 pELISA作为一种潜在替代中和实验评价IBV疫苗的免疫应答的可能。首先制备Pep6的多抗血清,ELISA结果显示,多肽血清与多肽能发生特异性反应。病毒与血清的交叉中和实验结果显示Pep6的多抗血清能够中和IBV病毒,中和效价为1:8,表明Pep6含中和抗原表位。随后,应用pELISA与中和实验比较检测IBV 阳性血清,结果显示血清中和效价与pELISA效价具有很好的正相关性。进一步比较检测了 M41、H52、CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 毒株免疫/攻毒后不同时间点采集的血清,结果显示免疫/攻毒后血清的中和效价和ELISA效价均随免疫时间逐渐升高。各毒株血清的中和效价与pELISA效价的具有明显的正相关性,总相关系数达到0.83。该方法的建立为临床基层IBV疫苗免疫效果评价提供了技术条件。4、IBV S1蛋白与宿主细胞膜蛋白互作的研究IBV S蛋白在病毒感染复制过程起关键作用,通常S1与识别宿主受体并结合细胞相关,而S2促进病毒囊膜与细胞膜融合。尽管IBV是最早发现的冠状病毒,目前对IBV S1与宿主细胞互作的认识仍非常有限,还没有鉴定出IBV的蛋白受体,同时对于IBV入胞机制仍知之甚少。为此本研究构建了正确表达S1-IgGFc融合蛋白的真核质粒pCAGGS-S1-IgGFc,利用Protein G纯化柱纯化了 S1-IgGFc融合蛋白,然后应用细胞膜提取试剂盒提取CEK细胞的膜蛋白,将纯化的融合蛋白与CEK细胞膜蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）,SDS-PAGE银染结果显示,与对照相比发现了 3条差异条带。将差异条带送质谱测序,共鉴定出GRP78、ANXA2、HSPA9、Vimentin等4种宿主蛋白与IBV S1蛋白互作,提示这些蛋白可能在病毒感染细胞发挥某种作用,为进一步探究IBV与宿主细胞膜蛋白的互作机制研究提供一定的材料和理论基础。5、GRP78蛋白促进IBV在CEK细胞中的复制GRP78蛋白又称HSPA5蛋白,是热休克蛋白家族的成员之一。传统上认为GRP78是一种ER伴侣蛋白,目前GRP78蛋白因在多种病毒的感染过程中发挥重要作用而被人们所熟知。在上一部分研究的基础上,通过Co-IP实验,进一步确定了 IBV S1蛋白与GRP78蛋白确实存在相互作用。本研究用抗GRP78多克隆抗体封闭CEK细胞,抑制GRP78蛋白的表达,结果发现抗GRP78多克隆能够有效抑制IBV M41在CEK细胞中的复制。进一步用siRNA干扰实验证明,当CEK细胞表面的GRP78的表达被抑制时,IBVM41的感染也被显着抑制。非易感细胞重建实验结果提示,不同浓度的GRP78真核质粒（0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg）转染CEF细胞,随着转染质粒浓度不断升高,IBVM41感染CEF细胞的感染能力逐渐增强,成明显的正相关。综上所述,GRP78蛋白在IBV感染CEK细胞过程中扮演了重要角色,该GPR78可能促进IBV进入宿主细胞。
吕海峰[6]（2021）在《犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用》文中进行了进一步梳理犬冠状病毒（Canine CoronavirusCCoV）是一种有囊膜的、单链正股RNA病毒。CCoV感染可导致幼犬胃肠炎的典型临床症状,如食欲不振、腹泻和呕吐等,发病率和死亡率较高。CCoV基因组全长约30 kb,3’端编码4种结构蛋白,分别为刺突蛋白（S）,包膜蛋白（E）,膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。M蛋白是一种膜结构糖蛋白,在包膜蛋白中含量最高,是病毒组装和形成的关键成分,含有B细胞识别表位。编码M蛋白的基因高度保守,与其他冠状病毒的M基因同源性较低,因此,M蛋白成为犬冠状病毒检测和诊断的主要靶标之一。犬胃肠炎可由多种病原体引起,包括病毒、细菌或寄生虫。最常见的病毒性肠炎病原体除了冠状病毒（CCoV）,还有犬细小病毒（CPV）,犬腺病毒2型（CAV-2）、犬瘟热病毒（CDV）等。因此,快速的病毒学检测对控制犬病毒性肠炎疾病至关重要。为了研制出适用于犬冠状病毒快速诊断的胶体金免疫层析试纸条,本研究制备筛选了 2株犬冠状病毒M蛋白特异单抗杂交瘤细胞,对不同单抗IgG亚类的纯化方法进行了比较,建立了犬冠状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备工艺,该试纸条具有良好的特异性和较高的敏感性。本文内容包括以下三个部分:1、犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定为制备抗犬冠状病毒（CCoV）特异单克隆抗体,用纯化的CCoV为抗原4次免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞用聚乙二醇（PEG1500）进行细胞融合,通过间接免疫荧光试验（IFA）筛选抗体阳性杂交瘤细胞。经三次克隆化,获得2株能稳定分泌抗CCoV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H11、2G3,其抗体效价在体外连续传代40代稳定。单抗Ig亚类鉴定结果表明,2H11单抗为IgG3,2G3单抗为IgG1亚类。IFA和Western blot分析均表明,2H11、2G3单抗特异识别CCoV M蛋白（28-32 kDa）。2H11、2G3杂交瘤培养上清的IFA效价均为1:1000,ELISA效价均≥1:105。单抗特异性试验结果表明,这些单克隆抗体与犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPIV）等均无交叉反应。CCoV M蛋白特异单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,为CCoV鉴定和相关诊断方法的建立奠定了坚实的基础。2、小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究为了纯化小鼠腹水中的单抗隆抗体,分三个批次,制备了 2G3、2H11两株杂交瘤的小鼠腹水。分别采用饱和硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、亲和层析、超离透析法对两株单抗进行纯化处理,分析对比蛋白浓度、纯度、效价以及回收率。结果表明不同Ig亚类的单抗,适用的纯化方法不同。2G3单抗（IgG1亚类）最适纯化方法为亲和层析,虽然亲和层析法回收率较低,但纯度高。2H11单抗属于IgG3亚类,辛酸处理导致IgG3破坏,亲和层析时蛋白G亲和柱与IgG3结合不紧密,结果洗脱下来的单抗蛋白浓度和抗体效价低,因此,辛酸-硫酸铵法、亲和层析法不适合2H11单抗的纯化。2H11单抗最适纯化方法选择为超离透析法。3、犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备为了制备胶体金免疫层析试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,选择单抗2G3作为金标抗体标记胶体金,经过优化,金标最佳pH为9.0,最佳蛋白浓度为100 μg/mL。单抗2H11作为检测抗体,以1mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线（T线）,兔抗鼠IgG作为质控抗体,以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线（C线）。特异性试验证明,试纸条与CDV、CAV、CPIV和CPV等无交叉反应;敏感性试验表明,试纸条可以检测到CCoV含量至少达到102.8TCID50/mL。对临床粪便样本的检测,实验室制备的试纸条与进口试纸条的检测符合率为1 00%。本研究成功制备了检测CCoV的胶体金免疫层析试纸条,对早期诊断、预防和控制CCoV具有重要的应用价值。
陈霁瑶[7]（2021）在《动脉炎病毒和冠状病毒3C样蛋白酶切割NEMO的分子机制》文中提出动脉炎病毒科和冠状病毒科同属套式病毒目。这两个科的病毒均编码一种3C样蛋白酶(3C-Like protease,3CLpro),也称主蛋白酶,负责将病毒编码的多聚蛋白前体切割成成熟的非结构蛋白,在病毒的复制进程中发挥关键作用。同时,该蛋白酶还能利用其切割活性切割宿主蛋白,尤其是IFN产生和信号转导的关键分子,发挥免疫调节作用。以前的研究表明,动脉炎病毒和冠状病毒的3C样蛋白酶均可切割I型干扰素产生通路中的关键蛋白激酶NEMO（NF-κB essential modulator）,但不同的动脉炎病毒或冠状病毒切割NEMO的位点存在一定差异。为了系统了解不同的动脉炎病毒和冠状病毒识别和切割NEMO的差异及其作用机制,本研究以动脉炎病毒和冠状病毒3CLpro切割NEMO为切入点,选择严重危害动物或者人类健康的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、马动脉炎病毒（EAV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV、SARS-CoV-2）、鼠冠状病毒（MHV）为研究对象,探讨它们编码的3CLpro调控IFN产生的分子机制。具体内容如下:1.动脉炎病毒PRRSV和EAV nsp4切割NEMO的多个位点抑制干扰素产生NF-κB必需调节蛋白（NEMO）是干扰素信号通路的关键分子,前期文献报道PRRSV非结构蛋白nsp4(编码3CLpro)能通过切割NEMO的第349位谷氨酰胺（E349）抑制IFN-β产生。但是,本研究通过双荧光素酶实验发现其切割后片段NEMO（1-349）仍具有诱导IFN-β产生的能力,并且PRRSV nsp4能进一步抑制NEMO（1-349）激活IFN-β,提示E349位的切割并没有使NEMO丧失诱导IFN-β的能力,可能还存在其它的切割位点。Western blot实验进一步证实PRRSV nsp4和EAV nsp4均能切割NEMO的多个位点,而且PRRSV和EAV感染细胞均能导致内源性NEMO表达降低。通过构建NEMO的一系列突变体,证实PRRSV nsp4和EAV nsp4均可切割NEMO的E166、E171、E349位点;同时,EAV nsp4还可以切割一个额外的位点Q205。如预期一样,除NEMO（1-349）外,其它切割后片段均丧失诱导IFN-β产生的能力。进一步的结构模拟分析发现,PRRSV nsp4和EAV nsp4的底物识别口袋S1位存在差异,推测S1口袋可能是导致识别差异的关键。上述研究结果表明,动脉炎病毒PRRSV和EAV的nsp4均需要切割NEMO的多个位点以拮抗IFN-β产生。2.冠状病毒SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5切割NEMO的能力不同前期研究发现α-冠状病毒PEDV nsp5(编码3CLpro)和δ-冠状病毒PDCoV nsp5能切割NEMO的单个位点Q231,然而关于β属冠状病毒是否切割NEMO尚不清楚。本研究发现SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5能切割NEMO的三个位点（E152、Q205、Q231）。值得关注的是,SARS-CoV-2 nsp5切割NEMO的能力强于SARS-CoV nsp5。通过序列比对和结构比较发现,在nsp5的S2底物识别口袋附近区域（第44-50位氨基酸）,存在一个氨基酸的差异。其中,SARS-CoV-2 nsp5的第46位氨基酸为丝氨酸（S）,而SARS-CoV nsp5对应的氨基酸为丙氨酸（A）,该位点的差异可能导致了二者切割NEMO效率的不同。进一步采用点突变和体外酶活实验,证实SARS-CoV-2 nsp5 S46A突变体切割NEMO的能力明显变弱,SARS-CoV nsp5 A46S突变体切割NEMO的能力明显增强,表明第46位氨基酸对nsp5的切割强度起至关重要的作用。由于SARS-CoV-2 nsp5切割NEMO的能力强于SARS-CoV nsp5,推测SARS-CoV-2 nsp5拮抗干扰素的能力强于SARS-CoV nsp5。双荧光结果证实了此猜测,且发现这种差异是由于第46位氨基酸的不同所致。此外,进一步的研究表明多种冠状病毒的蛋白酶均可以靶向NEMO的不同位点,且属于β属lineage A分支的另外两种病毒蛋白酶靶向NEMO时呈现了与SARS-CoV-2 nsp5不同的切割情况。3.冠状病毒MHV nsp5通过切割NEMO和MDA5而抑制IFN-β的产生进一步分析了与SARS冠状病毒同属β-冠状病毒但属于不同分支的MHV（属于β-冠状病毒属lineage A）切割NEMO的情况,意外发现MHV nsp5能切割NEMO的5个位点（Q145、E152、Q180、Q205、Q231）,且依赖于其自身蛋白酶活性,提示MHV nsp5的识别口袋具有更大的包容性,能识别和切割更多不同底物,结构分析也证实了这一推测。值得注意的是,除了切割NEMO外,MHV nsp5还能切割干扰素信号通路的模式识别受体MDA5,其切割位点为MDA5的Q818,被切割的MDA5片段MDA5（1-818）和MDA5（818-1025）均丧失诱导IFN-β产生的能力。上述结果表明,MHV nsp5切割NEMO的模式更加复杂,而且可以切割干扰素信号通路中的其它分子,发挥协同拮抗IFN产生的作用。总之,本研究系统阐述了动脉炎病毒（PRRSV、EAV）和冠状病毒（SARS-CoV、SARS-CoV-2、MHV）3C样蛋白酶切割NEMO的差异及其与天然免疫信号通路的关系,揭示了不同病毒3C样蛋白酶识别宿主蛋白的分子基础,为阐明病毒进化、致病机制和药物开发提供了新的线索。
肖琦,何后军,江宁,曾川,顾俊,田梦婷,王培霞,于晓梦,黄冬艳,甘平,唐玉新,叶昱[8]（2021）在《新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定》文中认为【目的】当前,新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）导致的疫情在全球大流行,严重危害人类的生命健康。研究拟制备并鉴定针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）的单克隆抗体,为SARS-CoV-2新型快速检测方法的创制奠定基础。【方法】纯化原核表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,经过4次免疫后将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,并通过western blot和间接免疫荧光试验鉴定抗体的反应性。【结果】经3次亚克隆,试验获得了2株能够稳定分泌抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D11和8G6;并且制备的抗体与真核表达的SARS-CoV-2 N蛋白反应原性良好。【结论】研究制备的单克隆抗体能够用于SARS-CoV-2的检测。
杨洵[9]（2021）在《体外制备HBV cccDNA的策略研究》文中提出第一部分:体外制备HBV cccDNA的策略研究目的:探索一种便捷、快速的体外合成HBV cccDNA的方法,在细胞层面验证其功能性,为研究临床HBV耐药基因型的cccDNA功能提供有力的工具。方法:根据HBV rcDNA的特殊结构,设计分别以负链为模板和以正链为模板的PCR引物,对HBV基因组进行两段PCR扩增,两段PCR产物作为HBV DNA体外环化构建cccDNA的原料。以Gibson Assembly无缝克隆技术为基础,对该方法的预混液配方作出一定改良后,尝试用于体外制备HBV cccDNA。通过该方法构建的HBV cccDNA产物经酚氯仿抽提纯化后,转染肝癌细胞系（Huh7,Hep G2）,经过5-7天培养后分离细胞和培养基。提取细胞中的HBV复制中间体,通过实时荧光定量PCR测定病毒复制的拷贝数;通过ELISA方法对培养基上清中的HBV分子标志物HBeAg、HBsAg进行测定。将该方法应用于临床耐药样本,制备耐药基因型的环状DNA,用于后续功能分析研究。结果:成功建立一种在体外直接构建环状的HBV cccDNA的方法,两个截短的HBV DNA片段通过改良Gibson无缝克隆组装的方法在体外成功合成完整的HBV cccDNA。体外合成的cccDNA转染细胞后具备HBV的生物学功能,细胞分泌表达HBeAg、HBsAg等相应的HBV分子标志物,与已报道的一步法扩增HBV全长DNA后经酶切、自连接环化再转染的方法相比更加迅速、便捷;改良后的自制Gibson反应液与商品化试剂相比成本更为低廉。结论:成功建立体外合成HBV cccDNA的方法,有希望应用于临床大批量耐药样本的基因型分析。第二部分SARS-CoV-2病毒相关蛋白的体外表达及功能鉴定目的:构建包含SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区基因的原核表达质粒,转化入大肠杆菌并进行诱导培养,获得功能性的重组RBD蛋白;构建包含SARS-CoV-2衣壳蛋白N基因的pPIC9K重组质粒,转化入毕赤酵母并进行诱导培养,获得功能性的重组N蛋白方法:（1）RBD蛋白的表达与纯化:分析SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区域的DNA序列,通过生物信息软件对该序列中的稀有密码子进行替换优化,优化后的RBD DNA全序列在体外人工合成,并插入到pGEX6P-1及pET28a原核表达载体中,构建出RBD重组质粒。将RBD重组质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞后进行菌液PCR鉴定阳性重组菌,选择阳性克隆菌株放大培养并添加IPTG进行外源蛋白的诱导表达,亲和层析法纯化RBD蛋白,使用SDS-PAGE、Westen Blot、Pulldown、ITC、ELISA等方法检测蛋白表达并验证其生物活性。（2）核衣壳（Nucleocapsid）蛋白的表达与纯化:分析SARS-CoV-2核衣壳蛋白的DNA序列并在体外人工合成到pPIC9K真核表达载体中,获得pPIC9K/N重组质粒。将pPIC9K/N重组质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞后进行菌液PCR鉴定阳性重组菌,选择阳性克隆扩大培养,用甲醇诱导表达外源蛋白,亲和层析纯化重组N蛋白,使用SDSPAGE、Western Blot检测蛋白表达。结果:pGEX6P-1/RBD表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,经鉴定为可溶性的重组GST-RBD蛋白。GST-RBD蛋白在体外能够与人ACE2蛋白结合,并具较强的亲和力;HIS-RBD蛋白在pET28a/RBD表达菌中多以包涵体形式存在,经纯化复性后,产量更高,且经ITC鉴定,能与ACE2发生特异性结合,亲和力高达129 nmol/L;N蛋白在GS115中成功实现分泌表达,在培养基上清中检测到大量N蛋白。结论:通过在大肠杆菌中诱导表达的方法,成功获得有功能的重组RBD蛋白,该重组蛋白具体与人ACE2受体结合的功能,可用于新冠病毒抗病毒药物研究和疫苗开发等多方面工作。
杨泽宁[10]（2021）在《SARS-CoV-2的N蛋白在感染过程中促进G3BP2与TRIM25相互作用抑制RLRs信号通路激活》文中进行了进一步梳理2020年SARS-CoV-2病毒的全球大流行给全世界带来了前所未有的公共卫生健康安全问题,并且对全世界的经济造成了巨大的冲击。全面了解该病毒的感染特征,尤其是针对病原体本身的生物学特征及其与宿主细胞免疫系统相互作用的研究对于揭示SARS-CoV-2的致病机理具有重要意义。现在很多研究和临床报告的研究表明SARS-CoV-2的感染会对机体的天然免疫及之后的适应性免疫动员产生抑制作用,在这个过程中病毒与宿主细胞的相互作用所产生了一系列分子事件,包括病毒基因组复制、结构蛋白和非结构蛋白对细胞内天然免疫分子的调控等,都将对机体抗病毒免疫的启动产生影响。已有的关于SARS-CoV的研究提示病毒结构蛋白中膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）是对固有免疫能产生的抑制作用,现在已经有多篇文献报道SARS-CoV-2的M蛋白也存在天然免疫抑制的作用,但关于N蛋白的研究还鲜有报道,本实验拟对SARS-CoV-2的N蛋白在感染过程中对天然免疫的影响进行进一步的探究。本文首先通过SARS-CoV-2感染16HBE细胞的体外实验,对SARS-CoV-2感染和增殖特性进行了探究,结果中我们发现SARS-CoV-2在16HBE细胞上的早期增殖能力较弱,我们通过Real-time PCR检测ISG15、CXCL-10、NF-κB、IFN-α和IFN-β表达量的改变和用Western Blot检测IRF3、TBK1和NF-κB磷酸化的改变,发现随着病毒感染进程的推进RLRs信号通路会出现被抑制的现象。之后我们在HEK293T细胞中过表达了不同SARS-CoV-2病毒蛋白组分,检测他们对IFN-β产生的影响,结果表明N蛋白作为SARS-CoV-2结构蛋白的一员能够抑制IFN-β的产生。利用免疫共沉淀实验我们发现SARS-CoV-2的N蛋白能够与TRIM25相互作用抑制RLRs信号通路的激活。同时,我们发现G3BP2蛋白能同时与TRIM25和N蛋白发生相互作用。进一步的实验我们发现N蛋白的出现能够起到促进G3BP2与TRIM25相互作用的功能。为了进一步探究G3BP2在RLRs信号通路中起到的作用,我们在A549细胞中过表达G3BP2,通过相关基因的核酸水平改变和相关蛋白的磷酸化水平改变发现RLRs信号通路的激活受到了抑制,并且过表达的G3BP2能够与胞内本身的TRIM25发生相互作用。我们猜测G3BP2或通过与TRIM25相互作用抑制了 RLRs信号通路的激活,于是我们利用siRNA敲低细胞中的G3BP2,结果显示当细胞中的G3BP2被敲低后,能够促进RLRs信号通路的激活,TBKI、IRF3和NF-κB的磷酸化水平明显高于对照细胞,但RLRs过度激活后IFN-β的产生似乎受到了抑制,因此我们推测G3BP2的或许对RLRs信号通路的激活和调节还存在其他重要的作用。在进一步的恒河猴的体内感染实验中,我们发现感染SARS-CoV-2中后期的恒河猴体内的NK细胞数量会受到抑制,这表明了 SARS-CoV-2的确能够抑制机体的固有免疫的激活。对感染后的恒河猴鼻咽部和肺部组织切片进行免疫荧光实验,我们也发现了病毒N蛋白与促进G3BP2与TRIM25募集和结合相关。上述研究结果提示,进一步阐明N蛋白抑制RLRs途径活化的机制,对于了解SARS-CoV-2肺部感染致病机制和病毒核衣壳蛋白在免疫逃逸中的作用具有一定的指导作用。
二、SARS-CoV核衣壳蛋白重组表达及单克隆抗体特性鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SARS-CoV核衣壳蛋白重组表达及单克隆抗体特性鉴定（论文提纲范文）
（1）新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 新冠病毒N蛋白原核表达载体的构建、表达与鉴定 |
| 1.3.2 动物免疫 |
| 1.3.3 免疫动物的抗体效价测定 |
| 1.3.4 新冠病毒N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1.3.5 新冠病毒N蛋白单克隆抗体的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新冠病毒N蛋白表达载体的验证、原核表达及纯化鉴定 |
| 2.1.1 N蛋白表达载体的验证 |
| 2.1.2 N蛋白的原核表达及纯化鉴定 |
| 2.2 间接ELISA法测定小鼠血清的多克隆抗体效价 |
| 2.3 杂交瘤细胞阳性克隆株的初步筛选 |
| 2.4 稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 结论与讨论 |
（2）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体筛选与抗体功能研究（论文提纲范文）
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1. COIVD19流行概况 |
| 2. SARS-CoV-2基因特征和病毒相关蛋白 |
| 2.1 SARS-CoV-2的基因特征 |
| 2.2 SARS-CoV-2相关蛋白 |
| 2.3 SARS-CoV-2的生命周期 |
| 2.4 SARS-CoV-2的组织噬性和诱发的机体免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2的主要突变株及其影响 |
| 3.1 SARS-CoV-2的主要突变株 |
| 3.2 突变点对SARS-CoV-2的影响 |
| 4. 现有抗体药物及其特征 |
| 4.1 现有抗体药物 |
| 4.2 单克隆抗体药物存在的问题 |
| 第一节 人源抗SARS-CoV-2 Fab噬菌体抗体库的构建与单克隆抗体筛选 |
| 绪论 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞、菌株、噬菌体和质粒 |
| 1.2 抗原和单克隆抗体 |
| 1.3 Fab抗体基因扩增所用引物 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 培养基 |
| 1.6 仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 人源抗SARS-CoV-2 Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 2.3 噬菌体抗体库的富集 |
| 2.4 Fab抗体原核表达及阳性克隆筛选鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 人源抗SARS-CoV-2病毒Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 3.2 人源抗SARS-CoV-2抗体库的富集筛选 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二节 人源抗SARS-CoV-2 S蛋白基因工程抗体功能及表位研究 |
| 绪论 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 载体、细胞、蛋白、病毒 |
| 1.2 培养基、抗体和试剂盒 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验方案与技术路线 |
| 2.2 人源抗SARS-CoV-2 S蛋白IgG抗体表达载体的构建 |
| 2.3 人源抗SARS-CoV-2 IgG全抗体的功能鉴定 |
| 2.4 SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体抗原表位研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 IgG全抗体在EXPI293F中表达 |
| 3.2 人源抗SARS-CoV-2 S蛋白IgG全抗体的功能鉴定 |
| 3.3 SARS-CoV-2 S蛋白抗原表位研究 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三节 SARS-CoV-2突变对基因工程抗体的影响研究 |
| 绪论 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 载体、细胞、蛋白、病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验方案与技术路线 |
| 2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.3 微量中和试验(CPE法) |
| 2.4 假病毒中和实验 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 SARS-CoV-2 S蛋白突变位点分析 |
| 3.2 S蛋白氨基酸单点突变对抗体结合活性影响 |
| 3.3 S蛋白单点突变对抗体中和活性的影响 |
| 3.4 突变株B.1.1.7和B.1.351对F61和H121中和活性影响评价 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）新冠病毒入胞途径及天然小分子抑制剂的发现与研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 新冠病毒双报告假病毒系统的建立 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.2.3 主要耗材 |
| 1.2.4 质粒、感受态与细胞系 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 刺突蛋白表达载体的构建 |
| 1.3.2 假病毒的包装与鉴定 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 刺突蛋白表达载体的构建 |
| 1.4.2 假病毒的鉴定 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 新冠病毒入胞途径的初步研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料及设备 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要耗材 |
| 2.2.4 化学抑制剂、显性抑制/激活突变体及细胞系 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 通过激光共聚焦观察SARS2(D614G)pp入胞后的定位 |
| 2.3.2 利用化学抑制剂研究新型冠状病毒入胞途径 |
| 2.3.3 利用显性抑制/显性激活突变体研究新型冠状病毒入胞途径 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SARS2(D614G)pp入胞后的定位分析 |
| 2.4.2 利用化学抑制剂研究新型冠状病毒入胞途径 |
| 2.4.3 利用显性抑制/显性激活突变体研究新型冠状病毒入胞途径 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 新冠病毒感染天然小分子抑制剂的筛选及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料及设备 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要耗材 |
| 3.2.4 天然小分子化合物库与细胞系 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 天然小分子化合物库的初步筛选 |
| 3.3.2 甲基莲心碱细胞毒性检测 |
| 3.3.3 甲基莲心碱抗SARS2pp感染活性评价 |
| 3.3.4 甲基莲心碱、莲心碱、异莲心碱抑制SARS2pp感染活性的比较 |
| 3.3.5 甲基莲心碱抑制新冠病毒变异株、SARS-CoV、MERS-CoV假病毒感染活性评价 |
| 3.3.6 甲基莲心碱抑制SARS2pp感染机制研究 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 天然小分子化合物库的初步筛选 |
| 3.4.2 系统评价甲基莲心碱体外抗SARS2pp感染活性 |
| 3.4.3 甲基莲心碱、莲心碱和异莲心碱抑制SARS2pp感染活性的比较 |
| 3.4.4 甲基莲心碱抗新冠病毒主要变异株及SARS-CoV、MERS-CoV假病毒感染活性的评价 |
| 3.4.5 甲基莲心碱抗SARS2pp感染的机制研究 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 新冠病毒假病毒小鼠感染模型的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料及设备 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要耗材 |
| 4.2.4 动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 rAAV9-hACE2 小鼠模型的建立 |
| 4.3.2 SARS2(D614G)pp的包装与浓缩 |
| 4.3.3 SARS2(D614G)pp感染小鼠 |
| 4.3.4 小鼠在体荧光素酶活性检测 |
| 4.3.5 免疫组化检测rAAV9-hACE2 在小鼠肺脏的转导 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 新冠假病毒感染小鼠模型的建立 |
| 4.4.2 免疫组化验证rAAV9-hACE2 在小鼠肺脏的转导 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 附表 |
| 附录B 综述 冠状病毒入胞机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（5）IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现和分类 |
| 1.2 IBV的形态 |
| 1.3 IBV的理化特征 |
| 1.4 IBV培养特性 |
| 1.5 IBV致病性 |
| 1.6 IBV生活周期 |
| 2 IBV分子生物学特性 |
| 2.1 IBV基因组 |
| 2.2 IBV主要编码蛋白及功能 |
| 2.3 IBV毒株分型 |
| 3 IBV流行病学 |
| 3.1 自然宿主 |
| 3.2 实验室宿主 |
| 3.3 传播方式 |
| 3.4 IBV流行现状 |
| 4 IBV变异机制 |
| 4.1 点突变 |
| 4.2 基因缺失或插入 |
| 4.3 同源重组 |
| 5 诊断技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学检测 |
| 综述二 IBV疫苗研究进展 |
| 1 疫苗接种 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 接种时间 |
| 1.3 疫苗接种程序 |
| 2 疫苗的应用 |
| 2.1 喷雾疫苗接种 |
| 2.2 凝胶疫苗接种 |
| 3 疫苗接种后的保护评价 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 纤毛停滞 |
| 3.3 qRT-PCR |
| 3.4 血清中和抗体水平评价 |
| 综述三 IBV S蛋白研究进展及与宿主细胞互作研究进展 |
| 1 IBV S蛋白研究进展 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 IBV S蛋白功能 |
| 1.4 影响病毒吸附的宿主因素 |
| 2 IBV与宿主互作的研究进展 |
| 2.1 病毒感染对细胞凋亡的影响 |
| 2.2 病毒感染过程中自噬的激活 |
| 2.3 冠状病毒感染与天然免疫反应 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 IBV S蛋白关键抗原表位的鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒、多肽和血清样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要试剂配方 |
| 1.4 多肽库合成 |
| 1.5 IBV毒株EID_(50)测定 |
| 1.6 IBV S蛋白序列保守性和抗原性比较分析 |
| 1.7 pELISA实验步骤 |
| 1.8 IDEXX检测试剂盒实验步骤 |
| 1.9 IBV S2蛋序列比较分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 IBV S蛋白抗原性和保守性分析 |
| 2.2 多肽与IBV阳性血清的交叉反应 |
| 2.3 多肽抗原性关键氨基酸的确定 |
| 2.4 16R变异株的流行情况 |
| 3 讨论 |
| 第二章 检测IBV抗体多肽酶联免疫吸附试验(pELISA)方法建立及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 pELISA方法步骤 |
| 1.5 pELISA方法条件的优化 |
| 1.6 pELISA方法性能的评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 Pep6与不同基因型毒株的血清具有很好的反应性 |
| 2.2 pELISA抗体检测方法条件的优化 |
| 2.3 pELISA临界值、重复性和特异性测定 |
| 2.4 pELISA性能的评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pELISA评价疫苗免疫效力的潜在作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 ELISA方法实验步骤 |
| 1.4 多肽血清的制备 |
| 1.5 血清中和滴度的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 多肽血清中和效果 |
| 2.2 pELISA与中和实验比较测定血清抗体滴度 |
| 2.3 免疫血清pELISA滴度与中和滴度的相关性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 IBV S1蛋白互作蛋白的宿主蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒总RNA提取 |
| 1.5 真核表达载体的构建 |
| 1.6 CEK细胞的制备 |
| 1.7 质粒转染 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.9 Western-blot |
| 1.10 S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 1.11 CEK细胞膜蛋白提取 |
| 1.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.13 SDS-PAGE(银染) |
| 1.14 质谱 |
| 2 结果 |
| 2.1 sp-S1-IgGFc片段PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒转染IFA鉴定FJ14S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.4 激光共聚焦鉴定重组S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.5 Western blot鉴定重组融合蛋白S1-IgGFc的表达 |
| 2.6 重组S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.8 质谱鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 GRP78蛋白协助IBV感染宿主细胞 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 真核质粒构建 |
| 1.7 CEKC的制备 |
| 1.8 质粒转染 |
| 1.9 共聚焦鉴定真核蛋白表达 |
| 1.10 免疫沉淀(IP) |
| 1.11 抗体封闭实验 |
| 1.12 siRNA干扰 |
| 1.13 GRP78转染293T重建实验 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶切鉴定构建的真核表达载体 |
| 2.2 共聚焦鉴定蛋白表达 |
| 2.3 GRP78蛋白与IBV S1蛋白的互作 |
| 2.4 多克隆抗体封闭CEK细胞膜表面GRP78蛋白抑制IBV复制 |
| 2.5 siRNA干扰GRP78的表达能抑制IBV的复制 |
| 2.6 非易感细胞感染实验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 犬冠状病毒研究进展 |
| 前言 |
| 1.1 犬冠状病毒分类地位 |
| 1.2 病毒形态与结构 |
| 1.3 基因组结构 |
| 1.4 病毒感染的临床表现及病理变化 |
| 1.5 治疗与预防 |
| 1.6 犬冠状病毒诊断技术 |
| 1.7 免疫胶体金检测技术及其在兽医领域的应用 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第2章 犬冠状病毒M蛋白单抗隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第3章 小鼠腹水单克隆抗体纯化方法的比较研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第4章 犬冠状病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）动脉炎病毒和冠状病毒3C样蛋白酶切割NEMO的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 动脉炎病毒简介 |
| 1.1.1 动脉炎病毒分类 |
| 1.1.2 动脉炎病毒基因组特征 |
| 1.1.3 动脉炎病毒nsp4 的结构及识别特点 |
| 1.2 冠状病毒简介 |
| 1.2.1 冠状病毒分类 |
| 1.2.2 冠状病毒基因组结构 |
| 1.2.3 冠状病毒的复制 |
| 1.2.4 冠状病毒nsp5 的结构特点 |
| 1.3 抗病毒天然免疫应答 |
| 1.3.1 动脉炎病毒与天然免疫 |
| 1.3.2 冠状病毒与天然免疫 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株与菌株 |
| 3.1.2 质粒及载体 |
| 3.1.3 质粒构建,RNA提取和western blot相关试剂 |
| 3.1.4 抗体及转染相关试剂 |
| 3.1.5 细胞及细菌培养相关试剂配制 |
| 3.1.6 缓冲液及试剂配制 |
| 3.1.7 主要实验仪器及设备 |
| 3.1.8 生物学软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 表达质粒的构建 |
| 3.2.2 脂质体介导的质粒转染 |
| 3.2.3 双荧光素酶实验 |
| 3.2.4 Western blot实验 |
| 3.2.5 RNA的提取及mRNA水平定量检测 |
| 3.2.6 蛋白表达及纯化 |
| 3.2.7 原代PAM细胞的分离 |
| 3.2.8 病毒增殖 |
| 3.2.9 病毒滴度的测定 |
| 3.2.10 FRET蛋白酶活检测 |
| 3.2.11 氨基酸的序列比对以及蛋白酶与底物复合物结构分析 |
| 3.2.12 统计学方法 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 动脉炎病毒PRRSV nsp4和EAV nsp4 通过切割NEMO多个位点来抑制干扰素的产生 |
| 4.1.1 PRRSV nsp4 切割NEMO产生的片段1-349 仍具有诱导IFN-β的能力 |
| 4.1.2 PRRSV nsp4 抑制NEMO(1-349)诱导的IFN产生 |
| 4.1.3 PRRSV nsp4和EAV nsp4 切割NEMO的多个位点 |
| 4.1.4 PRRSV和 EAV感染宿主细胞均能导致内源性NEMO的减少 |
| 4.1.5 PRRSV nsp4和EAV nsp4切割NEMO的三个相同位点分别为E166/E171/E349 |
| 4.1.6 EAV nsp4 能通过识别P1-Q切割NEMO |
| 4.1.7 NEMO切割后生成片段丧失诱导IFN的能力 |
| 4.1.8 解析动脉炎病毒nsp4 切割NEMO差异的结构基础 |
| 4.1.9 PRRSV和 EAV nsp4 复合物结构模拟及分析 |
| 4.2 冠状病毒SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5 切割NEMO的差异机制 |
| 4.2.1 SARS-CoV-2 nsp5 和SARS-CoV nsp5 均能切割NEMO的多个位点 |
| 4.2.2 SARS-CoV-2 nsp5 切割NEMO的两个位点为Q231、Q205 |
| 4.2.3 SARS-CoV-2 nsp5 能通过识别E152 切割NEMO |
| 4.2.4 SARS-CoV nsp5 切割NEMO的位点为E152、Q205、Q231 |
| 4.2.5 残基Ser46对SARS-CoV-2 nsp5 介导的NEMO的切割 |
| 4.2.6 S46/A46 作为SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5 催化活性的“强弱”开关 |
| 4.2.7 SARS-CoV-2 nsp5 抑制干扰素能力强于SARS-CoV nsp5 |
| 4.3 MHV nsp5 抑制干扰素的作用机制 |
| 4.3.1 MHV nsp5 切割NEMO的5 个位点 |
| 4.3.2 MHV感染能导致内源性NEMO的减少 |
| 4.3.3 MHV nsp5 切割NEMO的位点为Q145、E152、Q180、Q205、Q231 |
| 4.3.4 MHV nsp5 抑制干扰素的产生 |
| 4.3.5 MHV nsp5 可以靶向MDA5 抑制干扰素的产生 |
| 4.3.6 MHV nsp5 切割MDA5 的位点为Q818位 |
| 4.3.7 MHV nsp5切割MDA5 使其丧失诱导干扰素的能力 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 动脉炎病毒PRRSV和 EAV nsp4 切割NEMO多个位点 |
| 5.1.2 冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV nsp5 切割NEMO的效力不同 |
| 5.1.3 MHV nsp5 通过切割NEMO和 MDA5 抑制干扰素的产生 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物、细胞、质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SARS-Co V-2 N重组蛋白的表达和纯化 |
| 1.2.2 小鼠免疫和细胞融合 |
| 1.2.3 间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞 |
| 1.2.4 单克隆抗体的反应原性鉴定 |
| 1.2.5 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的纯化结果 |
| 2.2 间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞 |
| 2.3 WB鉴定单克隆抗体对SARS-Co V-2 N重组蛋白的反应性 |
| 2.4 间接免疫荧光鉴定单克隆抗体对真核表达SARS-Co V-2 N蛋白的作用 |
| 2.4 单克隆抗体的亚型鉴定结果 |
| 3 小结 |
（9）体外制备HBV cccDNA的策略研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 体外制备HBV cccDNA的策略 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SARS-CoV-2病毒相关蛋白的体外表达及功能鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 利用新的分子克隆策略合成HBV cccDNA的探讨 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）SARS-CoV-2的N蛋白在感染过程中促进G3BP2与TRIM25相互作用抑制RLRs信号通路激活（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 1.1 SARS-CoV-2病毒基本特征 |
| 1.1.1 SARS-CoV-2病毒的流行和危害 |
| 1.1.2 SARS-CoV-2病毒的预防与治疗 |
| 1.1.3 SARS-CoV-2病毒的遗传学特征 |
| 1.1.4 SARS-CoV-2病毒的生物学特征 |
| 1.2 SARS-CoV-2与固有免疫 |
| 1.2.1 固有免疫 |
| 1.2.2 SARS-CoV-2感染与固有免疫反应 |
| 1.2.3 SARS-CoV-2对固有免疫Ⅰ型干扰素的调节作用 |
| 1.3 三基序蛋白(TRIM)家族 |
| 1.3.1 三基序蛋白(TRIM)家族 |
| 1.3.2 三基序蛋白(TRIM)与固有免疫 |
| 1.4 G3BPs蛋白家族 |
| 1.4.1 G3BPs蛋白家族 |
| 1.4.2 G3BPs蛋白家族与固有免疫 |
| 1.5 本课题研究的意义、目的及策略 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 工程菌 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 试剂 |
| 2.1.7 仪器 |
| 2.1.8 实验耗材 |
| 2.1.9 质粒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 16HBE、293T和A549细胞的复苏 |
| 2.2.2 16HBE、293T和A549细胞的传代 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 SARS-CoV-2病毒的扩增 |
| 2.2.6 SARS-CoV-2病毒CCID50的测定 |
| 2.2.7 SARS-CoV-2病毒相关蛋白克隆的构建 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.9 组织切片免疫光实验 |
| 2.2.10 SARS-CoV-2病毒相关蛋白的转染表达 |
| 2.2.11 Western Blot实验(WB) |
| 2.2.12 免疫共沉淀实验(IP) |
| 2.2.13 SARS-CoV-2病毒细胞感染实验 |
| 2.2.14 Poly (I:C)刺激实验 |
| 2.2.15 Real-time PCR检测实验 |
| 2.2.16 siRNA转染敲低实验 |
| 2.2.17 SARS-CoV-2病毒标准品的制备 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 SARS-CoV-2感染人支气管上皮细胞16HBE的特征 |
| 3.2 SARS-CoV-2在16HBE细胞中的增殖动力学分析 |
| 3.3 SARS-CoV-2感染16HBE细胞引起较弱的NLRP3炎性复合体的天然免疫动员 |
| 3.4 SARS-CoV-2感染抑制RIG-I-like受体信号通路 |
| 3.5 病毒N蛋白参与了SARS-CoV-2感染后对胞内RIG-I-like受体信号通路的抑制 |
| 3.5.1 SARS-CoV-2各组分对IFN-β的产生的影响 |
| 3.5.2 SARS-CoV-2的N蛋白抑制RIG-I-like受体信号通路 |
| 3.6 SARS-CoV-2的N蛋白通过与细胞TRIM25和G3BP2的相互作用干扰了天然免疫的动员 |
| 3.6.1 N蛋白相互作用蛋白检测 |
| 3.6.2 N蛋白与TRIM25和G3BP2存在直接相互作用 |
| 3.6.3 TRIM25和G3BP2与N蛋白结合区域的检测 |
| 3.6.4 N蛋白对TRIM25与G3BP2蛋白表达量的影响 |
| 3.6.5 SARS-CoV-2感染细胞后病毒N蛋白会募集G3BP2与TRIM25 |
| 3.6.6 G3BP2过表达抑制RIG-I-like受体信号通路 |
| 3.6.7 N蛋白促进G3BP2与TRIM25结合并抑制IFN-β的产生 |
| 3.6.8 G3BP2减少会促进RIG-I-like受体信号通路的激活 |
| 3.6.9 G3BP2的缺少会影响细胞内I型干扰素的产生 |
| 3.7 恒河猴SARS-COV-2感染实验 |
| 3.7.1 SARS-CoV-2感染对恒河猴固有免疫反应激活存在干扰 |
| 3.7.2 恒河猴SARS-CoV-2感染实验N蛋白会募集G3BP2与TRIM25 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 英文缩略词表 |
| 7.2 主要溶液配置表 |
| 8 致谢 |
| 9 发表着作 |
四、SARS-CoV核衣壳蛋白重组表达及单克隆抗体特性鉴定（论文参考文献）
- [1]新型冠状病毒核衣壳蛋白抗原的重组表达及其单克隆抗体的制备[J]. 马珍珍,李蓉芳,向苗,阿月,何庆华. 食品安全质量检测学报, 2021
- [2]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [3]人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体筛选与抗体功能研究[D]. 曲园园. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [4]新冠病毒入胞途径及天然小分子抑制剂的发现与研究[D]. 杨扬. 军事科学院, 2021
- [5]IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究[D]. 武奇. 扬州大学, 2021
- [6]犬冠状病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其在胶体金检测试纸条上的应用[D]. 吕海峰. 扬州大学, 2021
- [7]动脉炎病毒和冠状病毒3C样蛋白酶切割NEMO的分子机制[D]. 陈霁瑶. 华中农业大学, 2021(02)
- [8]新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 肖琦,何后军,江宁,曾川,顾俊,田梦婷,王培霞,于晓梦,黄冬艳,甘平,唐玉新,叶昱. 江西农业大学学报, 2021(03)
- [9]体外制备HBV cccDNA的策略研究[D]. 杨洵. 重庆医科大学, 2021(01)
- [10]SARS-CoV-2的N蛋白在感染过程中促进G3BP2与TRIM25相互作用抑制RLRs信号通路激活[D]. 杨泽宁. 北京协和医学院, 2021(02)