终末分化论文_徐长禄,赵艳红,马艺戈,王冰蕊,王鼎

导读:本文包含了终末分化论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,红细胞,甲基,多核,胞嘧啶,信号,骨关节炎。

终末分化论文文献综述

徐长禄,赵艳红,马艺戈,王冰蕊,王鼎^[1]（2019）在《利用生物信息学方法解析自噬相关基因在人体红细胞终末分化各阶段的动态表达》一文中研究指出为了探究自噬相关基因在人体红细胞终末分化各阶段的表达概况,利用生物信息学方法对人体终末分化各阶段红细胞转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)数据中自噬相关基因的表达进行提取并分析。结果表明,自噬相关基因在红细胞终末分化各阶段呈现不同的表达模式;在红细胞终末分化的早期,超过50%的自噬相关基因呈现高表达状态;原始红细胞及早幼红细胞中高表达的自噬相关基因富集的生物学过程主要包括细胞自噬及其调节、蛋白质的磷酸化及囊泡的运输,而线粒体自噬相关基因主要在中幼红细胞及晚幼红细胞阶段高表达。研究发现,自噬相关基因在人体红细胞终末分化各阶段的表达呈现动态变化;不同阶段的红细胞中高表达的自噬相关基因及其富集的生物学过程均不同。(本文来源于《生物技术进展》期刊2019年03期）

郭燕^[2]（2019）在《Brd4/c-myc/hTert分子轴调控在VPA促进As_2O_3诱导HL60细胞终末分化中的作用机制研究》一文中研究指出背景:急性白血病(Acute leukemia,AL)是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病,发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞大量的增殖,蓄积于骨髓并抑制正常造血,广泛浸润肝、脾、淋巴结等髓外脏器。多数表现为贫血、出血、感染和浸润等征象。目前国内根据受累的细胞类型,AL通常可以分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。据不完全统计,我国AML的发病率约为1.62/10万,而ALL则约为0.69/10万。一般成人以AML多见。急性白血病若不经治疗,平均生存期仅3个月左右,短者甚至在诊断数天后即发生死亡。自1986年开始,我国学者相继证实全反式维甲酸(ATRA)或叁氧化二砷(As203)对PML/RARα阳性的急性早幼粒细胞白血病(APL)诱导分化治疗有效,且获得很好的临床治疗效果。而PML/RARα阴性的其他类型AML目前仍只能选择化疗或造血干细胞移植,但反复化疗只能使不足40%的患者长期生存,而造血干细胞移植虽改善部分患者预后,但因花费大、移植相关死亡率高,总体有效率仍不理想。因此,白血病的诱导分化治疗业已成为国内外研究的热点之一。诱导分化疗法的主要特点是选择性诱导白血病细胞分化成熟后自然凋亡/死亡,而对正常组织细胞没有明显毒副作用,从理论上讲,该种治疗模式将成为人类治疗白血病最为理想的方法之一。受到ATRA或As203成功治疗PML/RARα阳性的APL案例的鼓舞,新的分化诱导剂在开发研究方面也取得了较大进展。例如维生素衍生物、细胞因子、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitor,HDACi)、DNA甲基化酶抑制剂、化疗药物、药用植物提取物和植物生长调节素等。然而,截止到目前为止,除ATRA和As203成功应用于临床治疗APL外,单独使用上述新型诱导分化剂均没有取得令人鼓舞的效果,更多的是倾向于不同诱导分化剂之间的联合应用,以期增强疗效、减少耐药、降低毒副作用等。其中,在新型诱导分化药物中,组蛋白去乙酰化酶抑制剂HDAC抑制因子是重要的一类诱导剂。其主要的理论依据是核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化是基因转录表达过程中重要的调控方式,组蛋白末端的乙酰化状态在组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰基酶(HDACs)的作用下保持着动态平衡,与染色质的结构调节和转录活性状态密切相关,与肿瘤的发生密切相关。因此,包括HDAC抑制因子在内的不同诱导分化剂的联合应用,将成为肿瘤细胞诱导分化治疗的新思路、新途径。根据以往的研究报道,上述诱导分化治疗的结果主要表现为分化或凋亡两种现象,其主要的分子机制在于降解或抑制特异性PML/RARα融合蛋白。我们在前期的体外实验中,发现了两个有趣的现象,一是小剂量As203(0.25-0.5umol/L以下)均可以诱导NB4(PML/RARα表达阳性)和HL60细胞(PML/RARα阴性)发生部分分化现象,而HDAC抑制因子VPA或TSA可以诱导这咱部分分化向终末分化转变。二是ATRA或高剂量As2O3均可以诱导NB4和HL60细胞分别发生终末分化或凋亡的发生。那么这种ATRA或As2O3同样可以诱导PML/RARα阴性HL60细胞发生明显细胞终末分化的事实,说明传统的“PML/RARα融合蛋白降解”学说并不能成为它们作用的唯一的分子机制,应该存在着其它诱导分化的机制途径。而我们建立的HDAC抑制因子VPA促进小剂量As2O3诱导HL60细胞由部分分化向终末分化的转变的预实验结果,为深入探讨其诱导分化的分子机制提供了很好的体外细胞模型。因此,下一步研究的重点在于如何重新选择分子机制研究的切入点。已知BRD(a double bromodomain-containing protein)是bromodomain BET家族的成员,主要包含两个溴基结构的蛋白,可以优势结合乙酰化的染色质从而启动基因转录。BET家族特异性阻滞剂JQ1介导的Brd4活性抑制,导致白血病细胞的增殖受到抑制,提高荷瘤小鼠的生存率。部分学者进一步发现,Brd4抑制剂JQ1抑或是Brd4的shRNA均可以显着抑制c-myc调控基因的表达。因此,我们推测Brd4可能在VPA促进小剂量As203诱导HL60细胞发生终末分化的过程中发挥作用。重点探讨Brd4是否通过调控c-myc而影响白血病细胞的增殖和分化现象,而c-myc蛋白是否进一步影响下游基因hTert的表达变化。Brd4/c-myc/hTert分子轴的研究结果,将为新型终末分化诱导剂筛选、关键分子靶向治疗提供新的依据,并进一步创新和丰富粒系分化新理论。目的:在建立HDAC抑制因子VPA促进小剂量As2O3诱导PML/RARα阴性HL60细胞由部分分化向终末分化的转变的预实验基础上,依据BRD4参与白血病细胞增殖分化过程的实验结果,重点探讨Brd4是否通过调控myc而影响白血病细胞的增殖和分化现象,而c-myc蛋白是否进一步影响下游基因hTert的表达变化。率先揭示Brd4/c-myc/hTert分子轴在白血病细胞发生分化过程中的作用,进一步创新和丰富粒系分化新理论,为白血病治疗提供新的干预靶点。方法:首先应用VPA、As2O3及两者联合诱导PML/RARα阴性HL-60细胞发生分化,或部分分化向终末分化模型的转变,然后采用CCK8实验测定不同药物及浓度对细胞增殖的影响,瑞氏-吉姆萨检测细胞分化流式细胞仪检测HL60细胞的周期和CD11b分化抗原。NBT实验和细胞表面分化抗原CD11b作为观察药物对细胞的分化的影响;RT-PCR方法检测目的基因的mRNA水平变化;Western blot检测目的蛋白的表达水平;ChIP实验检测Brd4对c-myc或c-myc对hTert靶基因启动子的结合变化。BALB/Nude荷瘤小鼠进行药物抗白血病作用的研究。结果:无论是0.5 μmol/L的As2O3、1mmol/L VPA或者0.5 μmol/L As2O3+1mmol/L VPA均能抑制HL-60细胞的增殖,并呈现时间依赖性。0.5 μmol/L As203+1mmol/L VPA诱导第2天时,G0/G1期增加,S期降低,与对照组比较,G2/M期变化不明显。Wright-Gimesa染色观察,CD11b分化抗原表达,以及NBT还原实验均证实诱导分化模型建立成功,并以两种药物联合诱导HL-60细胞分化的能力更强(P<0.05)。0.5μmol/LAs2O3+1mmol/L VPA协同诱导48h后,HL-60细胞中的Brd4和c-myc基因表达水平逐渐降低,正常对照组表达变化不大。0.5μmol/L As2O3+1mmol/L VPA协同诱导48h后,HL-60细胞中的Brd4蛋白表达水平逐渐降低,伴随c-myc蛋白表达降低。在siRNA作用后siBrd4表达降低,c-myc蛋白表达也降低。说明Brd4和c-myc之间存在正相关。收集siBrd4干扰与As2O3+VPA协同药物对CD11b表达的影响,siBrd4干扰或其与As2O3+VPA协同药物协同干扰后,细胞表面表达CD11b表达明显升高。为了证实Brd4对c-myc调控是否具有靶向性,当细胞处于对数期生长时,用0.5 μmol/LAs2O3、1mmol/L VPA或As2O3+VPA诱导白血病细胞。ChIP实验结果表明,Brd4可以结合c-myc 3启动子对靶细胞的分化发挥靶向调控作用,c-myc可以结合hTert的启动子对靶细胞分化发挥靶向调控作用。体内实验中,As2O3+VPA明显抑制体内荷瘤的生长,并与分化的发生和终末分化后凋亡有关。结论及意义:在首先采用VPA促进小剂量As2O3诱导PML/RARα阴性HL60细胞发生终末分化转变的基础上,率先揭示Brd4/c-myc/hTert分子轴在这种终末分化转变中的作用,提出非传统“PML/RARα融合蛋白降解”的分子机制。不仅创新和丰富粒系分化新理论,也为白血病治疗提供新的干预靶点。(本文来源于《山东大学》期刊2019-03-01）

王耀美^[3]（2018）在《甲基胞嘧啶加双氧酶3(TET3)在红系终末分化中的作用及机制研究》一文中研究指出研究背景和目的:红细胞分化是一个需要精细严谨调控的复杂过程,正常的红系分化过程可以分为叁个阶段:早期分化,终末分化和网织红细胞成熟。既往关于红系分化调控机制的研究主要集中阐释了细胞因子和转录因子的作用和机制,如促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)及其受体(EPO Receptor,EPOR)通路和GATA1、KLF1等红系分化关键转录因子。近年来研究发现在哺乳类动物基因组中DNA甲基化/去甲基化作为重要的表观遗传修饰方式之一在造血干细胞自我更新等过程中起到重要的调控作用,但在红系分化过程中的作用尚不清楚。TET家族是介导DNA去甲基化的关键酶,本课题组前期RNA-seq结果发现TET3是红系终末分化阶段表达最高的TET家族成员,且随着分化进行表达逐渐上升,提示TET3在红系终末分化中可能起到重要作用。因此,本课题拟分选红系终末分化阶段各期有核红细胞,通过DNA甲基化测序建立DNA甲基化动态谱,联合运用多组学研究手段和功能基因组学研究方法进一步探讨TET3在人红系分化各特定阶段的调控作用和分子机制,以期明确TET3介导的DNA去甲基化在人红系终末分化过程中的阶段性调控作用及分子机制。此外,本研究构建了在红系细胞中特异性敲除Tet3的小鼠模型(Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠),利用该小鼠模型,进一步在体内水平验证了Tet3在红系发育进程中的调控作用。本研究的结果为深入理解红系分化调控机制提供新的思路和理论基础。研究方法:(1)利用课题组已建立的分选纯化人类红系终末分化过程中各特定阶段有核红细胞的方法得到纯化的各特定阶段有核红细胞,进行增强型简化代表性亚硫酸盐测序法(Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing,ERRBS)检测,分析人类红系终末分化过程中基因甲基化动态变化,建立动态甲基化谱。(2)为研究TET3在人红系分化中的作用,我们分离得到脐带血CD34+造血干细胞后,利用慢病毒转染敲低TET3表达,诱导向红系定向分化,通过quantitative real-time PCR检测敲低效率,以流式细胞技术检测红系分化进程、细胞凋亡及脱核效率,通过细胞计数绘制生长曲线,并以细胞甩片观察细胞及细胞核形态。(3)分选纯化对照组和TET3敲低组红系终末分化过程中各个阶段有核红细胞提取RNA,建立c DNA库,进行RNA-seq检测,利用生物信息学软件Tophat2、HTSeq和DESeq2对测序结果进行质量检测、序列比对、基因表达水平分析和基因表达差异分析等,建立TET3敲低后各特定阶段有核红细胞的转录谱。(4)分析对照组和TET3敲低组转录谱,查阅文献比对差异表达基因功能,发现TET3敲低后晚期有核红细胞表达下降基因前十位中的KLHDC8B基因与细胞的有丝分裂关系密切,提示其可能参与了晚期有核红细胞细胞核形态以及脱核的改变。进一步我们通过功能缺失和获得实验,构建KLHDC8B sh RNA载体和过表达载体,用Quantitative real-time PCR和Western Blot检测敲低效率和过表达水平,在红系分化的晚期,利用流式检测脱核率,细胞甩片观察并定量分析KLHDC8B敲低后以及TET3敲低联合KLHDC8B过表达时双核或多核细胞比例的变化。(5)运用质谱方法检测TET3敲低后晚期有核红细胞5-m C和5-hm C的改变;运用甲基化特异酶切分析法以及Me DIP-real time PCR检测TET3敲低后KLHDC8B启动子甲基化状态的变化。此外,我们还运用ATAC-seq检测TET3敲低后红系分化晚期细胞染色质易接近性的改变,以期明确TET3敲低后是否通过影响染色质的易接近性从而影响特定基因的表达。(6)根据课题组前期建立的分选纯化小鼠体内红系终末分化过程中各个阶段有核红细胞的方法得到纯化的各个阶段的有核红细胞,进行HELP(Hpall tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR)检测。利用生物信息学方法分析已建立的转录组数据库,观察Tet家族成员在小鼠红系终末分化进程中的表达趋势,构建在红系干祖细胞阶段Tet3被特异性敲除的小鼠模型,检测野生型和Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠在正常情况下和应激情况下外周血常规变化趋势,同时检测其骨髓各期红细胞变化以及脾脏变化。结果:(1)红系发育过程是一个受到精密调控且呈多阶段变化的过程,因此,我们分选出人红系分化过程中各特定阶段有核红细胞,进行ERRBS检测,结果发现全基因组出现累积性的去甲基化改变,而且是一个动态变化的过程,不同分化阶段细胞向下一阶段细胞分化时基因甲基化改变不完全相同。(2)通过对课题组前期获得的RNA-seq数据分析发现,在人类红系终末分化过程中,TET家族中TET3的表达水平最高且随着分化进行逐渐升高。因此,我们推测TET3在人类红系发育中可能起到重要的调控作用。(3)利用本实验室已建立的原代CD34+造血干细胞定向红系分化方法,以慢病毒感染进行TET3敲低,发现TET3敲低后引起红系从早期分化向终末分化过程延迟,但是并未被阻滞;分化过程中细胞增殖减少并伴有细胞凋亡增加;细胞脱核减少且晚期细胞中双核或多核细胞增多。(4)由于TET3在晚期有核红细胞中表达最高,并且我们发现TET3敲低后晚期有核红细胞中出现双核或多核现象且脱核受到明显影响。因此,为了进一步探讨TET3敲低后双核以及多核增多等的相关机制,我们分别分选出对照组和TET3敲低组红系终末分化各特定阶段有核红细胞,进行了RNA-seq检测,运用Tophat2、HTSeq和DESeq2等生物信息学软件对测序结果进行分析,主要成分分析(principle component analysis,PCA)结果显示对照组和TET3敲低组各自的相同阶段有核红细胞转录组测序结果一致性高。相同阶段的有核红细胞中,对照组和TET3敲低组存在明显的差异,尤其是Poly期和Ortho期,差异最明显,这与TET3敲低后表型主要出现在晚期以及TET3在晚期表达最高的数据均是一致的。对表达差异基因分析发现TET3敲低后主要影响了红系终末分化中晚期有核红细胞内基因的表达,而且与有丝分裂相关的KLHDC8B基因表达下调位居前列,结合KLHDC8B与霍奇金淋巴瘤患者“镜影细胞”形成相关,我们推测KLHDC8B的下调可能与晚期有核红细胞的双核或多核现象相关。(5)慢病毒转染敲低KLHDC8B的表达后对红系分化以及增殖无明显影响,但引起红细胞脱核率明显降低且晚期有核红细胞中双核或多核细胞明显增多,这与TET3敲低后出现的晚期有核红细胞表型一致;之后我们在TET3敲低的情况下进行了KLHDC8B的过表达补救实验,补救实验发现KLHDC8B表达恢复后可以使双核或多核现象明显减少。(6)为了探讨TET3如何影响KLHDC8B的表达,首先我们利用质谱对红系发育各特定阶段细胞进行了5-m C和5-hm C的检测,结果发现TET3敲低后原始红细胞(Proerythroblasts,Pro)、早期早幼红细胞(Early Basophilic erythroblasts,Early Baso)、晚期早幼红细胞(Late Basophilic erythroblasts,LateBaso)和中幼红细胞(Polychromatic erythroblasts,Poly)阶段5-m C水平没有明显改变,然而在晚幼红细胞(Orthochromatic erythroblasts,Ortho)阶段基因TET3敲低组与对照组相比5-m C水平变化虽然没有显着统计学差异(P=0.053),但是其水平确有明显升高。5-hm C水平因基数太低检测不出明确结果;之后我们对KLHDC8B的特异位点甲基化状态进行了检测,结果显示KLHDC8B启动子内Cp G到以及启动子片段均未发生甲基化修饰;由于TET3可以影响染色质的开闭,为了研究TET3敲低后是否影响了晚期红细胞染色质的开闭,我们进行了ATAC-seq的检测,ATAC-seq结果显示在30259个合并区域仅仅发现了329个差异表达峰,这使得我们在分子功能,生物学过程和细胞组成聚类分析时没有足够的富集。分析KLHDC8B的位点亦没有发现明显的染色质易接近性差异。这结果提示TET3敲低后不影响KLHDC8B基因位点的染色质易接近性。但是鉴于我们仅对晚幼红细胞进行了ATAC-seq分析,不排除TET3对早期有核红细胞如早幼红细胞和中幼红细胞的染色质易接近性有影响。另外上述结果也提示TET3通过间接作用对KLHDC8B的表达进行调控,但是由于我们尝试了目前市售所有TET3抗体,均不能有效识别人类红系分化过程中细胞内的TET3蛋白,因此无法进行免疫共沉淀等以检测TET3是否通过调控其他蛋白的表达从而引起KLHDC8B表达的下调,后续我们会对此进行进一步的研究。(7)分选小鼠红系终末分化各特定阶段有核红细胞进行HELP检测,结果发现小鼠体内红系终末分化中基因启动子区也出现去甲基化趋势,而且调节去甲基化的Tet家族中Tet3的表达最高且随着分化进行逐渐升高,这与人类红系发育各特定阶段有核红细胞TET3表达结果一致;因此,进一步研究Tet3在小鼠红系发育中的调控作用对研究红系发育的表观遗传调控将会起到重要的作用。(8)由于Tet3敲除具有胚胎致死性,因此,我们利用Cre/Loxp重组酶系统建立了红系条件性Tet3敲除鼠即Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠,该小鼠模型可以实现仅在红系细胞内敲除Tet3。经PCR以及电泳检测Epor-GFPCre Tet3条件性敲除小鼠建立成功后,定期检测Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠与野生型小鼠在正常情况下外周血常规进行比较发现没有明显区别。有文献报道Tet3在应激条件下起到重要的调控作用,因此,我们对小鼠进行了腹腔注射苯肼(Phenylhydrazine,PHZ),使小鼠出现急性贫血,进入应激状态。经观察发现,与野生型小鼠进行对比,Epor-GFP-Cre Tet3条件性敲除小鼠外周血红细胞计数,血红蛋白,红细胞压积,网织红细胞计数恢复减慢,骨髓中Orthro期细胞比例明显增多,网织红细胞和成熟红细胞比例明显减少,Pro,Baso和Poly期细胞无明显变化,并且脾脏明显增大,这些结果提示Tet3可能在应激情况下对红系晚期细胞发育起到重要的调控作用。结论:(1)人类和小鼠红系终末分化中全基因组呈现累积性去甲基化变化;(2)TET家族在人类和小鼠红系终末分化中均是TET3表达最高,且随着分化的进行逐渐升高;(3)TET3敲低后人类红系终末分化过程中细胞增殖减慢,凋亡增加,出现双核或多核现象并且脱核率减少;(4)TET3敲低后通过下调KLHDC8B的表达使得晚期有核红细胞中出现明显增多的双核或多核细胞;(5)TET3敲低后引起Orthro期细胞5-m C明显升高;KLHDC8B启动子区没有甲基化修饰,TET3对其染色质易接近性的作用有待进一步研究;(6)在小鼠红系进行Tet3条件性敲除后影响应激情况下红系发育。(本文来源于《郑州大学》期刊2018-03-01）

万小满,闫继红^[4]（2018）在《TGF-β信号通路与软骨终末分化及骨关节炎》一文中研究指出骨关节炎(OA)是一种慢性退行性关节疾病,在中老年人群中发病率高,严重者可致残,从而影响人们的生活质量。其病理改变涉及关节整体结构,包括关节软骨破坏,软骨下骨硬化,骨赘形成以及滑膜增生等~([1])。目前已知的有关病因主要与年龄、性别、力学压力(肥胖)以及创伤有关~([2])。然而有关骨关节炎发生的精确的分子机制目前还不完全清楚。(本文来源于《中国实验诊断学》期刊2018年02期）

崔申申,解学敏,王南宇,吕湘^[5]（2017）在《IFN-γ促进红系终末分化》一文中研究指出目的探索IFN-γ对体外红系终末分化的调节作用。方法用real-time PCR法检测IFN-γR1/R2在血红素(hemin)诱导K562细胞红系分化过程中的表达变化。以IFN-γ处理hemin诱导的K562细胞和人脐血CD34+细胞来源的红系细胞,用real-time PCR检测红系分化标志物CD235a和CD71表达。用联苯胺染色展现IFN-γ处理的K562细胞中血红蛋白含量,通过Western blot和real-time PCR检测红系相关转录因子GATA1和NFE2的表达。结果 Hemin诱导下分化的K562细胞中IFN-γR1/R2 mRNA先减少后增高,IFN-γ促进K562及造血干祖细胞红系分化晚期CD71及CD235a的表达,增加联苯胺阳性染色率。IFN-γ对红系分化的促进作用具有时间依赖性。机制研究表明IFN-γ可促进红系关键转录因子NFE2的表达。结论 IFN-γ促进K562细胞及人脐血造血干祖细胞的红系终末分化。(本文来源于《基础医学与临床》期刊2017年07期）

范家铭^[6]（2017）在《非经典Wnt信号通路在小鼠肝干细胞干性、增殖和终末分化中对经典Wnt信号通路的调控作用》一文中研究指出背景:肝脏在生物体内具有重要的代谢、外分泌和内分泌等多重功能,肝脏的生理功能异常可以导致其高死亡率。肝脏是高度再生的器官,在损伤期间可依赖所含干细胞被激活,通过自我复制完全恢复功能。经典的Wnt/β-catenin信号在肝再生发育过程中,参与调节胎肝细胞的增殖和分化。但是,可能的非经典Wnt信号通路在这个过程中所起作用尚不清楚。目的:探讨非经典Wnt信号在经典Wnt信号通路参与的小鼠肝脏发育中,对胎肝细胞的增殖,干性及终末分化所起的作用。方法:首先我们在不同发育阶段(出生后0D,14D,28D,180D)的小鼠肝脏组织中,运用Real-time PCR检测已知的所有经典和非经典Wnt信号通路各组份的表达量。然后以可逆性永生化小鼠胎肝细胞系i HPx为实验对象,Real-time PCR检测Wnt信号通路各组分的表达情况。构建重组腺病毒过表达经典Wnt 1,2,3,3a,6,7a。β-catenin/TCF4/LEF萤光素酶活性报告基因TOP-luc用于检测经典Wnt1,2,3,3a,6,7a在i HPx细胞中对经典通路下游的激活情况。构建重组腺病毒过表达非经典Wnt 5a,9b,10a,10b,利用TOP-luc检测非经典Wnt5a,9b,10a,10b在i HPx细胞中与经典Wnt信号通路的作用。Real-time PCR检测非经典Wnt5a,9b,10a,10b刺激i HPx后,经典Wnt信号通路下游基因表达量的变化,以及小鼠肝干性标志物、终末成熟分化标志物和肝脏分化特异性标志物的表达量变化。WST-1实验检测不同Wnt对i HPx细胞增殖的影响。白蛋白报告基因Alb-reporter检测不同Wnt对i HPx细胞成熟分化的影响。考虑到i HPx细胞内永生化基因SV40T对实验结果的影响,利用重组腺病毒Ad Cre,对SV40T基因进行敲除,Real-time PCR检测刺激在SV40T敲除i HPx细胞中,过表达非经典Wnt5a,9b,10a,10b后,小鼠肝脏干性标志物、终末成熟分化标志物和肝脏分化特异性标志物的表达量变化。吲哚菁绿摄取实验(ICG)与过碘酸-希夫式反应/糖元储存实验(PAS)检测胎肝细胞在过表达Wnt3a,5a,9b,10a,10b以后的分化成熟程度。在i HPx细胞中过表达Wnt3a,5a,9b,10a,10b后,行裸鼠皮下异位瘤实验,对皮下包块行切片后HE染色及免疫组化,观察不同Wnt对i HPx细胞增殖及分化的影响,已经对经典通路关键因子β-catenin表达量的影响。结果:1.Real-time PCR结果显示在小鼠不同发育阶段(出生后0D,14D,28D,180D)的肝组织中,经典Wnt蛋白除Wnt7a外,均可被检测,晚期尤甚。非经典Wnt蛋白Wnt9b,10a,10b表达显着增高,与时间成正相关,在出生后28D达到顶峰。各受体、联合受体、受体拮抗剂、信号通路相关因子表达量与时间关系也各不相同。在去或不去SV40T的i HPx细胞中(GFP为对照组),相较于其它Wnt,非经典Wnt5a,9b,10a,10b以及经典Wnt3a依旧显着高表达,其余信号通路各组分表达与小鼠肝组织中的表达量情况大致相似。此部分结果提示,在小鼠肝发育过程中,除经典Wnt信号通路外,高表达的非经典Wnt5a,9b,10a,10b也可能参与其中。2.在i HPx细胞内分别过表达所有经典Wnt1,2,3,3a,6,7a,利用萤光素酶活性报告基因TOP-luc对的β-catenin/TCF4/LEF的活性检测进行检测,结果显示经典Wnt均可以激活i HPx细胞内的β-catenin/TCF4/LEF通路。挑选Wnt3a作为经典Wnt代表在i HPx细胞内过表达以后,联合分别过表达非经典Wnt5a,9b,10a,10b,β-catenin/TCF4/LEF的活性被抑制。在i HPx细胞内过表达Wnt5a,9b,10a,10b以后,Real-time PCR检测经典Wnt信号通路下游靶基因Axin2,Sox9d等的表达被抑制。以上结果提示:非经典Wnt5a,Wnt9b,Wnt10a和Wnt10b蛋白在小鼠肝发育过程中,具有微调经典Wnt蛋白抑制β-catenin/TCF4/LEF活性的作用。3.在i HPx细胞过表达Wnt3a,5a,9b,10a和10b以后,与GFP对照组相比,WST-1结果表明Wnt3a在不同时间点可促进i HPx细胞的增殖,而Wnt5a,9b,10a和10b抑制i HPx细胞的增殖。Real-time PCR结果提示在过表达非经典Wnt5a,9b,10a,10b以后,i HPx细胞内大部分干性相关基因被抑制,肝脏成熟相关基因表达增高。在含有白蛋白萤光素酶报告基因的i HPx-Alb reporter-luc细胞系内,过表达Wnt5a,9b,10a和10b以后,白蛋白的表达量亦增加。ICG和PAS实验结果提示过表达Wnt3a后,与GFP对照组相比无明显差异,而过表达Wnt5a,9b,10a和10b后,与GFP对照组相比i HPx细胞摄取吲哚菁绿和储存糖原的能力增强。该部分结果提示:经典Wnt3a可以促进i HPx细胞的增殖,而Wnt5a,Wnt9b,Wnt10a和Wnt10b可抑制细胞增殖,同时促进i HPx细胞的成熟分化。4.在去除SV40T的去永生化i HPx细胞中,Real-time PCR结果提示SV40T促进干性相关基因的表达,抑制成熟肝相关基因的表达。在去除SV40T的i HPx细胞中过表达Wnt5a,9b,10a,10b后,Real-time PCR结果提示i HPx细胞干性相关基因被抑制,成熟肝相关基因高表达。去除SV40T的i HPx细胞内过表达不同Wnt,ICG实验与PAS实验结果与前一致。该部分结果提示:永生化基因SV40T可维持i HPx细胞干性,抑制其成熟分化,去或不去永生化后的i HPx细胞,不同Wnt信号对其作用并无明显差异。5.在不同Wnt刺激的i HPx细胞裸鼠皮下成瘤试验中,HE染色结果提示,过表达Wnt3a实验组的i HPx细胞,细胞核大深染,细胞质少且淡然,细胞生长状态较5a,9b,10a,10b组旺盛。免疫组化结果提示,Wnt3a实验组PCNA阳性着色显着高于GFP实验组,而Wnt5a,9b,10a,10b实验组阳性着色低于GFP组。β-catenin阳性着色在Wnt3a组显着高于GFP对照组,而Wnt5a,9b,10a,10b实验组的阳性着色低于GFP对照组,提示经典Wnt3a激活β-catenin,而经典Wnt5a,9b,10a,10b抑制β-catenin活性。该部分实验结果提示,在体内过表达Wnt3a可激活经典β-catenin通路刺激i HPx细胞的增殖,而Wnt5a,9b,10a,10b抑制经典β-catenin通路抑制i HPx细胞的增殖综上所述,非经典Wnt蛋白5a,9b,10a,10b在经典Wnt3a参与的调节小鼠肝发育过程中,抑制肝干细胞的增殖与干性,促进肝干细胞的终末分化。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2017-05-01）

孙龙云^[7]（2017）在《DNA甲基结合蛋白2调节少突胶质前体细胞终末分化的作用及机制》一文中研究指出目的探究DNA甲基结合蛋白(MeCP)2调节少突胶质前体细胞(OPCs)终末分化的作用及机制。方法 (1)采用Western印迹方法观察MeCP2沉默对OPCs分化成熟的影响;(2)运用甲基特异性聚合酶链反应(PCR)(BSP)和定量实时PCR(qRT-PCR)探究少突终末标志物内转录因子Sry相关Box17因子(SOX)10、DNA甲基结合蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘脂蛋白(PLP)甲基化和表达变化。结果与正常细胞相比,在MeCP2沉默的OPCs中,与OPCs分化成熟相关2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)重组蛋白表达明显上调,同时SOX10、MBP、MAG、PLP表达均明显上调;但呈现低甲基化水平。结论 MeCP2沉默可促进OPCs终末分化标志物的表达及甲基化水平的降低,从而促进OPCs成熟分化。(本文来源于《中国老年学杂志》期刊2017年08期）

谢伟,谭平先,孙炜,包杰^[8]（2016）在《二甲双胍对骨肉瘤MG-63细胞形态、凋亡和终末分化的影响分析》一文中研究指出目的:研究二甲双胍对骨肉瘤MG-63细胞的形态、凋亡和终末分化的影响,分析其与磷酸腺苷激活的蛋白激酶活性及胚胎干细胞标志物Nanog、Oct4表达情况的相关性。方法:选取人骨肉瘤MG63细胞作为研究对象,利用悬浮球生长实验将其诱导为骨肉瘤干细胞,随机将培养的细胞分为实验组和对照组,实验组培养细胞给予二甲双胍处理,观察处理前后骨肉瘤干细胞的形态及分化能力,分析二甲双胍对骨肉瘤干细胞凋亡的影响,并比较干细胞标志物Nanog及Oct4的阳性率,检测二甲双胍作用前后骨肉瘤干细胞中磷酸腺苷激活的蛋白激酶AMPK、雷帕霉素靶蛋白m TOR以及核糖体蛋白S6激酶p70S6K信号通路的表达情况。结果:实验组培养细胞的Nanog阳性率为45.2%,Oct4阳性率为74.7%;对照组培养细胞的Nanog阳性率为73.5%,Oct4阳性率为95.3%;两组培养细胞的Nanog及Oct4的阳性率比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。实验组培养细胞的磷酸腺苷激活的蛋白激酶AMPK相对表达量明显高于对照组,雷帕霉素靶蛋白m TOR以及核糖体蛋白S6激酶p70S6K的相对表达量明显低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:二甲双胍可破坏骨肉瘤细胞的形态,抑制其分化,作用机制可能与Nanog及Oct4表达的下调、AMPK的激活有关。(本文来源于《北方药学》期刊2016年12期）

王伟财,包柏成,Jeremy,J·Mao,凌均棨,周晨^[9]（2016）在《Suv39h1结合Lhx8表观遗传调控成牙本质细胞终末分化》一文中研究指出目的:明确牙发育早期,组蛋白甲基转移酶Suv39h1在牙源性间充质中的表达谱,并与已明确的同源盒基因Lhx8的表达谱比较;探讨Suv39h1和Lhx8间是否存在相互作用;揭示Suv39h1和Lhx8相互作用调控成牙本质细胞终末分化的机制。材料与方法:使用冰冻切片原位杂交(ISH)和石蜡切片免疫组化(IHC)检测Suv39h1在小鼠出生后3天(P3)牙胚中的表达;使用Suv39h1抗体进行Co-IP证实Suv39h1与Lhx8(本文来源于《2016国际口腔及颅颌前沿研究研讨会暨全国口腔生物医学年会论文汇编》期刊2016-11-04）

鲍全伟^[10]（2016）在《Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞终末分化及骨折重塑期中的作用及机制研究》一文中研究指出研究背景:越来越多的研究发现,经典的Wnt/β-catenin信号通路在骨发育及骨量调节过程中发挥着重要作用,激活Wnt/β-catenin可得到骨量增加的表型,而抑制Wnt/β-catenin活性骨量减少,这显示出在低骨量疾病的治疗中拥有良好的前景。成骨细胞是骨发育过程中最主要的功能细胞,而骨细胞是骨组织中含量最多的细胞成分。因而我们认为有必要在成骨细胞及骨细胞特异性的激活Wnt/β-catenin来观察其对骨量的影响。有意思的是本研究发现无论是在成骨细胞还是骨细胞中持续激活Wnt/β-catenin后虽然骨量显着增多但出现骨矿化差,胶原形成不佳等骨质量下降的表型。其导致骨质量下降的机制尚无相关研究报道,鉴于矿化主要发生在成骨细胞终末分化阶段,我们认为有必要观察持续激活Wnt/β-catenin对成骨细胞终末分化的影响及探讨可能机制。另外,骨折的愈合过程近似于胚胎时期骨形成过程。近年来多项研究发现Wnt/β-catenin信号通路在骨折愈合过程中同样发挥重要作用,增强该信号通路活性可促进骨折愈合,而降低该信号通路活性则会导致骨折愈合欠佳。骨折愈合过程大致可分为炎症血肿期、修复期、重塑期叁个阶段。其中重塑期所占比例最长,重塑的好坏也将直接导致骨折愈合的质量,但目前尚没有相关研究报道Wnt/β-catenin信号通路在重塑期中的作用。因而我们试图在骨折重塑期通过激活和敲除β-catenin来观察其对重塑期的影响。综上所述,目前已经证实Wnt/β-catenin信号通路在骨发育及骨折愈合过程中具有非常重要的作用,但是仍然存在许多问题。因此我们将进行下列实验:1、观察在成骨细胞中持续激活β-catenin对骨质量的影响并探讨其机制;2、建立小鼠胫骨骨折模型,并在骨折重塑期分别激活和敲除Wnt/β-catenin以观察对重塑期的影响及探讨其发生机制。实验方法:第一部分:Wnt/β-catenin在成骨细胞终末分化中的作用第一节:骨细胞中持续激活Wnt/β-catenin(oc CA-β-catenin)对骨量及骨质量的影响1.建立骨细胞特异性持续激活β-catenin小鼠模型,μ-CT、HE染色检测小鼠骨量变化;2.叁点弯曲试验测试小鼠长骨生物力学特性;3.免疫组织化学染色检测一型胶原(Col1a1)、FGF23的表达;第二节:成骨细胞中持续激活Wnt/β-catenin(ob CA-β-catenin)对成骨细胞终末分化的影响1.建立成骨细胞特异性持续激活β-catenin小鼠模型,采用叁点弯曲试验测试小鼠长骨生物力学特性;2.Masson,Sirius Red染色查看胶原形成及排列情况;3.硬组织切片von Kossa染色观察骨组织矿化情况;4.BrdU免疫组织化学和免疫荧光检测成骨细胞增殖情况,TUNEL法观察成骨细胞凋亡情况;5.利用免疫组织化学染色检测成骨细胞早期分化标志物Run X2、Osterix,晚期标志物Osteocacin、DMP1,一型胶原Col1a1,细胞周期相关因子c-myc、cyclin Y的表达情况,并检测Wnt/β-catenin信号抑制因子Dkk1的表达;6.小鼠长骨原代成骨细胞分离培养,于ob CA-β-catenin成骨细胞的培养基中加入外源性DKK1,成骨诱导后茜素红染色观察矿化水平;7.分离培养的成骨细胞提取总RNA及总蛋白分别进行实时定量PCR及Western Blot检测周期相关基因及蛋白质的表达水平。第二部分:Wnt/β-catenin信号通路在骨折重塑期中的作用1.繁育可在成骨细胞中分别激活和敲除β-catenin的基因小鼠;采用8周大小鼠建立骨折二期愈合模型,8周后取材;2.小鼠分组:高激活β-catenin组(HA-β-catenin)、低激活β-catenin组(LA-β-catenin)、敲除β-catenin组(β-catenin-KO),采用同窝野生型小鼠作为对照组(control),运用实时定量PCR检测骨痂处β-catenin水平;3.骨折后8W取材,X线摄片、μCT观察骨折愈合情况,HE染色观察骨痂形态,Sarfanin O染色观察骨痂处软骨含量,Masson,Siruis red染色观察骨痂处胶原情况;4.叁点应力实验检测骨折愈合质量;5.硬组织切片von Kossa染色观察骨痂处骨组织矿化情况;6.TRAP染色观察破骨细胞;7.免疫组化观察ALP、Runx2、OSX、OCN的表达情况;8.提取骨痂处总RNA实时定量PCR检测ALP、Runx2、OSX、OCN、DMP1、RANKL、OPG的表达;9.提取血清ELISA检测ALP、CTXⅠ水平。实验结果:一、持续激活β-catenin可使骨量增加但会造成成骨细胞终末分化障碍、骨质量下降,DKK1在此过程中发挥着重要作用第一节:骨细胞中持续激活β-catenin骨量增多、骨质量下降1.μ-CT、HE染色结果显示oc CA-β-catenin小鼠长骨骨量增加;2.叁点应力实验显示oc CA-β-catenin小鼠长骨断裂载荷及刚度较control组显着下降;3.Sirius染色显示oc CA-β-catenin小鼠长骨胶原排列紊乱;4.免疫组化染色显示oc CA-β-catenin小鼠长骨Col1a1,矿化相关指标FGF23表达下降;第二节:成骨细胞中持续激活β-catenin引起成骨细胞终末分化障碍、DKK1在此过程中发挥着重要作用1.叁点应力实验显示ob CA-β-catenin小鼠长骨断裂载荷及刚度较control组显着下降;2.ob CA-β-catenin小鼠长骨胶原排列紊乱,矿化差,Col1表达下降;3.免疫组化染色显示ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞早期分化指标Runx2、OSX表达上升,晚期分化指标OCN、Dmp1表达下降;4.ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞增殖增多而凋亡减少;5.ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞中细胞周期相关因子c-myc、cyclin D1、cyclin Y、CDK14的表达升高;6.在体外培养的成骨细胞中加入外源性DKK1后ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞细胞周期相关因子的表达下调至control组水平,矿化增强。二、Wnt/β-catenin信号通路在骨折重塑期需要被精确的调控1.X线检测发现与control组相比β-catenin-KO小鼠骨折处骨痂量显着减少,HA-β-catenin小鼠骨折处骨痂量明显增多,LA-β-catenin小鼠骨痂处骨量轻微增多,而Micro CT检测显示BV/TV值LA-β-catenin小鼠最大其次是Control组小鼠,再次是HA-β-catenin小鼠,β-catenin-KO小鼠最小;2.Sarfanin O染色显示HA-β-catenin小鼠骨痂处有软骨成分;3.Masson及Siruis red染色显示HA-β-catenin、β-catenin-KO小鼠骨痂处胶原减少,排列紊乱,而LA-β-catenin小鼠与control小鼠无明显差异;4.叁点应力试验表明断裂载荷及刚度值LA-β-catenin小鼠>control小鼠>HA-β-catenin小鼠>β-catenin-KO小鼠;5.硬组织切片von Kossa染色显示HA-β-catenin、β-catenin-KO小鼠骨痂处骨痂矿化差,而LA-β-catenin小鼠与control小鼠无明显差异;6.TRAP染色显示HA-β-catenin小鼠破骨细胞明显减少,β-catenin-KO小鼠破骨细胞显着增多,而LA-β-catenin小鼠与control小鼠无明显差异,血清ELISA检测CTXⅠ同样证实上述发现;7.免疫组化染色显示HA-β-catenin小鼠骨痂处ALP、Runx2、OSX表达较其他组高,而OCN表达下降,LA-β-catenin小鼠骨痂处的ALP、Runx2、OSX略高于control组、但OCN表达较其他组高,β-catenin-KO小鼠上述指标均降低,此外实时定量PCR也证实了上述指标的变化。结论:1.骨细胞及成骨细胞中持续激活β-catenin骨量增加但骨质量降低;持续激活β-catenin导致成骨细胞周期相关因子的表达上调,促使细胞一直处于增殖状态而无法脱出细胞周期进行分化,成骨细胞增殖增多使骨量增加而成骨细胞终末分化受阻,造成胶原形成不佳、矿化下降等骨质量下降表现。2.DKK1在成骨细胞终末分化的过程中发挥着重要作用,在成骨细胞分化晚期DKK1需表达上升使Wnt/β-catenin信号通路活性下降从而使成骨细胞脱出细胞周期继续分化。3.在骨折重塑期Wnt/β-catenin信号通路发挥着重要作用,但β-catenin水平需要被精确调控以促进骨折愈合,过高或过低β-catenin水平都不利于骨折愈合。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2016-04-01）

终末分化论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

背景:急性白血病(Acute leukemia,AL)是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病,发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞大量的增殖,蓄积于骨髓并抑制正常造血,广泛浸润肝、脾、淋巴结等髓外脏器。多数表现为贫血、出血、感染和浸润等征象。目前国内根据受累的细胞类型,AL通常可以分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。据不完全统计,我国AML的发病率约为1.62/10万,而ALL则约为0.69/10万。一般成人以AML多见。急性白血病若不经治疗,平均生存期仅3个月左右,短者甚至在诊断数天后即发生死亡。自1986年开始,我国学者相继证实全反式维甲酸(ATRA)或叁氧化二砷(As203)对PML/RARα阳性的急性早幼粒细胞白血病(APL)诱导分化治疗有效,且获得很好的临床治疗效果。而PML/RARα阴性的其他类型AML目前仍只能选择化疗或造血干细胞移植,但反复化疗只能使不足40%的患者长期生存,而造血干细胞移植虽改善部分患者预后,但因花费大、移植相关死亡率高,总体有效率仍不理想。因此,白血病的诱导分化治疗业已成为国内外研究的热点之一。诱导分化疗法的主要特点是选择性诱导白血病细胞分化成熟后自然凋亡/死亡,而对正常组织细胞没有明显毒副作用,从理论上讲,该种治疗模式将成为人类治疗白血病最为理想的方法之一。受到ATRA或As203成功治疗PML/RARα阳性的APL案例的鼓舞,新的分化诱导剂在开发研究方面也取得了较大进展。例如维生素衍生物、细胞因子、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitor,HDACi)、DNA甲基化酶抑制剂、化疗药物、药用植物提取物和植物生长调节素等。然而,截止到目前为止,除ATRA和As203成功应用于临床治疗APL外,单独使用上述新型诱导分化剂均没有取得令人鼓舞的效果,更多的是倾向于不同诱导分化剂之间的联合应用,以期增强疗效、减少耐药、降低毒副作用等。其中,在新型诱导分化药物中,组蛋白去乙酰化酶抑制剂HDAC抑制因子是重要的一类诱导剂。其主要的理论依据是核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化是基因转录表达过程中重要的调控方式,组蛋白末端的乙酰化状态在组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰基酶(HDACs)的作用下保持着动态平衡,与染色质的结构调节和转录活性状态密切相关,与肿瘤的发生密切相关。因此,包括HDAC抑制因子在内的不同诱导分化剂的联合应用,将成为肿瘤细胞诱导分化治疗的新思路、新途径。根据以往的研究报道,上述诱导分化治疗的结果主要表现为分化或凋亡两种现象,其主要的分子机制在于降解或抑制特异性PML/RARα融合蛋白。我们在前期的体外实验中,发现了两个有趣的现象,一是小剂量As203(0.25-0.5umol/L以下)均可以诱导NB4(PML/RARα表达阳性)和HL60细胞(PML/RARα阴性)发生部分分化现象,而HDAC抑制因子VPA或TSA可以诱导这咱部分分化向终末分化转变。二是ATRA或高剂量As2O3均可以诱导NB4和HL60细胞分别发生终末分化或凋亡的发生。那么这种ATRA或As2O3同样可以诱导PML/RARα阴性HL60细胞发生明显细胞终末分化的事实,说明传统的“PML/RARα融合蛋白降解”学说并不能成为它们作用的唯一的分子机制,应该存在着其它诱导分化的机制途径。而我们建立的HDAC抑制因子VPA促进小剂量As2O3诱导HL60细胞由部分分化向终末分化的转变的预实验结果,为深入探讨其诱导分化的分子机制提供了很好的体外细胞模型。因此,下一步研究的重点在于如何重新选择分子机制研究的切入点。已知BRD(a double bromodomain-containing protein)是bromodomain BET家族的成员,主要包含两个溴基结构的蛋白,可以优势结合乙酰化的染色质从而启动基因转录。BET家族特异性阻滞剂JQ1介导的Brd4活性抑制,导致白血病细胞的增殖受到抑制,提高荷瘤小鼠的生存率。部分学者进一步发现,Brd4抑制剂JQ1抑或是Brd4的shRNA均可以显着抑制c-myc调控基因的表达。因此,我们推测Brd4可能在VPA促进小剂量As203诱导HL60细胞发生终末分化的过程中发挥作用。重点探讨Brd4是否通过调控c-myc而影响白血病细胞的增殖和分化现象,而c-myc蛋白是否进一步影响下游基因hTert的表达变化。Brd4/c-myc/hTert分子轴的研究结果,将为新型终末分化诱导剂筛选、关键分子靶向治疗提供新的依据,并进一步创新和丰富粒系分化新理论。目的:在建立HDAC抑制因子VPA促进小剂量As2O3诱导PML/RARα阴性HL60细胞由部分分化向终末分化的转变的预实验基础上,依据BRD4参与白血病细胞增殖分化过程的实验结果,重点探讨Brd4是否通过调控myc而影响白血病细胞的增殖和分化现象,而c-myc蛋白是否进一步影响下游基因hTert的表达变化。率先揭示Brd4/c-myc/hTert分子轴在白血病细胞发生分化过程中的作用,进一步创新和丰富粒系分化新理论,为白血病治疗提供新的干预靶点。方法:首先应用VPA、As2O3及两者联合诱导PML/RARα阴性HL-60细胞发生分化,或部分分化向终末分化模型的转变,然后采用CCK8实验测定不同药物及浓度对细胞增殖的影响,瑞氏-吉姆萨检测细胞分化流式细胞仪检测HL60细胞的周期和CD11b分化抗原。NBT实验和细胞表面分化抗原CD11b作为观察药物对细胞的分化的影响;RT-PCR方法检测目的基因的mRNA水平变化;Western blot检测目的蛋白的表达水平;ChIP实验检测Brd4对c-myc或c-myc对hTert靶基因启动子的结合变化。BALB/Nude荷瘤小鼠进行药物抗白血病作用的研究。结果:无论是0.5 μmol/L的As2O3、1mmol/L VPA或者0.5 μmol/L As2O3+1mmol/L VPA均能抑制HL-60细胞的增殖,并呈现时间依赖性。0.5 μmol/L As203+1mmol/L VPA诱导第2天时,G0/G1期增加,S期降低,与对照组比较,G2/M期变化不明显。Wright-Gimesa染色观察,CD11b分化抗原表达,以及NBT还原实验均证实诱导分化模型建立成功,并以两种药物联合诱导HL-60细胞分化的能力更强(P<0.05)。0.5μmol/LAs2O3+1mmol/L VPA协同诱导48h后,HL-60细胞中的Brd4和c-myc基因表达水平逐渐降低,正常对照组表达变化不大。0.5μmol/L As2O3+1mmol/L VPA协同诱导48h后,HL-60细胞中的Brd4蛋白表达水平逐渐降低,伴随c-myc蛋白表达降低。在siRNA作用后siBrd4表达降低,c-myc蛋白表达也降低。说明Brd4和c-myc之间存在正相关。收集siBrd4干扰与As2O3+VPA协同药物对CD11b表达的影响,siBrd4干扰或其与As2O3+VPA协同药物协同干扰后,细胞表面表达CD11b表达明显升高。为了证实Brd4对c-myc调控是否具有靶向性,当细胞处于对数期生长时,用0.5 μmol/LAs2O3、1mmol/L VPA或As2O3+VPA诱导白血病细胞。ChIP实验结果表明,Brd4可以结合c-myc 3启动子对靶细胞的分化发挥靶向调控作用,c-myc可以结合hTert的启动子对靶细胞分化发挥靶向调控作用。体内实验中,As2O3+VPA明显抑制体内荷瘤的生长,并与分化的发生和终末分化后凋亡有关。结论及意义:在首先采用VPA促进小剂量As2O3诱导PML/RARα阴性HL60细胞发生终末分化转变的基础上,率先揭示Brd4/c-myc/hTert分子轴在这种终末分化转变中的作用,提出非传统“PML/RARα融合蛋白降解”的分子机制。不仅创新和丰富粒系分化新理论,也为白血病治疗提供新的干预靶点。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

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