牛分枝杆菌mpb51-mpb63融合基因重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

论文摘要

牛结核病是对人类健康、畜牧业发展造成严重影响的一种慢性消耗性传染病,被世界动物卫生组织归为B类疫病。卡介苗（BCG）是由牛分枝杆菌制成的减毒活菌苗,是目前唯一被广泛认可的用于预防结核病的疫苗。而研究表明,BCG的保护效力对年龄具有依赖性,保护力随着年龄的增长而减弱;同时,BCG无法应用于患有免疫缺陷类疾病的个体,也会使牛结核菌素皮试（Tuberculin skin test,TST）反应呈阳性,干扰牛结核病的检测。因此迫切需要新型预防牛结核病的疫苗。人5型腺病毒（Ad5）是一种E1区缺失的复制缺陷型病毒表达载体,只能在HEK293细胞中进行繁殖扩增,插入外源基因的腺病毒穿梭载体,在HEK293细胞中能够通过同源重组整合到腺病毒载体基因组中,并包装重组腺病毒,最终重组腺病毒能够在HEK293细胞中大量表达外源蛋白。MPB51与MPB63是牛分枝杆菌两种主要分泌蛋白,具有良好的免疫保护性,是开发牛结核病疫苗的理想候选抗原。因此本研究Ad5为载体,构建牛分枝杆菌mpb51-mpb63融合基因重组腺病毒,并通过小鼠模型研究重组腺病毒表达的融合蛋白MPB51-MPB63的免疫原性,为研制牛结核病新型疫苗奠定基础。本研究以pMD-51-63质粒为模板,对融合基因mpb51-mpb63进行PCR大量扩增,纯化后用Hind III和EcoR I酶切并回收,再与腺病毒穿梭载体pacAd5CMV K-NpA连接,构建pacAd5 CMV-51-63重组穿梭质粒。将重组穿梭质粒pacAd5 CMV-51-63与腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100用Pac I限制性内切酶分别进行线性化,在转染试剂LipoFiter?的作用下,共转染入细胞HEK293细胞内进行重组腺病毒的包装,从而获得重组腺病毒rAd5 CMV-51-63。运用反转录PCR（RT-PCR）验证融合基因mpb51-mpb63转录水平的表达情况,进一步应用间接免疫荧光试验（IFA）和Western Blot检测融合基因mpb-51-mpb63蛋白水平的表达情况。大量扩增重组腺病毒rAd5 CMV-51-63并纯化,使用TCID50法测定纯化后的rAd5 CMV-51-63病毒的滴度。将rAd5 CMV-51-63重组腺病毒、rAd5CMV K-NpA、PBS缓冲液、BCG对7周龄雄性小鼠采用肌肉注射的方法进行免疫,两周后加强免疫,再两周后处死小鼠,使用流式细胞术检测小鼠脾内T淋巴细胞亚群与IL-2,IFN-γ等细胞因子的分泌水平;使用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中IgG水平,从而分析重组腺病毒rAd5 CMV-51-63表达的融合蛋白MPB51-MPB63的免疫原性。本研究成功地获得了融合基因mpb51-mpb63,酶切纯化后成功地构建了重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV-51-63。pacAd5 CMV-51-63和pacAd5 9.2-100线性化后共转染,通过基因组PCR鉴定,证明在HEK293中成功地构建出重组腺病毒rAd5 CMV-51-63。又经RT-PCR、IFA及Western Blot确认,MPB51-MPB63融合蛋白在重组腺病毒rAd5 CMV-51-63中获得了表达。重组腺病毒rAd5CMV-51-63免疫小鼠后,流式检测结果显示,重组腺病毒rAd5 CMV-51-63免疫组脾细胞中CD4+T细胞的比例较rAd5 CMV K-NpA组、PBS组和BCG组均略高,但无统计学差异（P>0.05）;CD8+T细胞的比例略低于BCG组,高于空载腺病毒组,但差异并未显著（P>0.05）,显著高于PBS组,差异显著（P<0.05）;产生IL-2的细胞比例低于BCG组,且显著高于空载腺病毒组与PBS组,差异显著（P<0.05）;产生IFN-γ的细胞比例略低于BCG组,差异不显著（P>0.05）,显著高于PBS组与空载腺病毒组,差异显著（P<0.05）。利用酶联免疫吸附试验检测到重组腺病毒rAd5 CMV-51-63免疫组小鼠血清中IgG抗体水平显著高于PBS组与空载腺病毒组（P<0.05）。可见,重组腺病毒rAd5 CMV-51-63能够诱导小鼠体内产生一定水平的细胞免疫和体液免疫,为牛结核病新型疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董阳

导师: 姜秀云

关键词: 牛结核病,重组腺病毒,融合基因

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

分类号: S852.4

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000082

总页数: 54

文件大小: 1486K

下载量: 31

相关论文文献

• [1].重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体的构建及鉴定[J]. 遵义医学院学报 2017(02)
• [2].血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(24)
• [3].不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达[J]. 中国人兽共患病学报 2008(09)
• [4].反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF的构建与鉴定[J]. 济宁医学院学报 2011(02)
• [5].细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒[J]. 新疆医科大学学报 2009(12)
• [6].受磷蛋白重组腺病毒的制备与鉴定[J]. 医学研究杂志 2016(10)
• [7].口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重组腺病毒质粒的构建[J]. 湖北农业科学 2017(16)
• [8].表达小反刍兽疫病毒F基因重组腺病毒的构建及对小鼠的免疫原性[J]. 中国预防兽医学报 2011(04)
• [9].小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒可控制慢性HBV感染[J]. 南方医科大学学报 2017(11)
• [10].犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估[J]. 中国生物工程杂志 2014(01)
• [11].包载人基质金属蛋白酶组织抑制因子1重组腺病毒微球的制备及其表征[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2011(34)
• [12].VEGF特异siRNA重组腺病毒构建及其对K562细胞增殖的抑制作用[J]. 第三军医大学学报 2009(13)
• [13].携带凋亡素基因重组腺病毒的制备及诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究[J]. 肿瘤学杂志 2015(07)
• [14].局部应用脂联素基因重组腺病毒对骨缺损修复的影响[J]. 华西口腔医学杂志 2015(04)
• [15].重组腺病毒HBV preS2/S-AD5的构建及生物安全性初步研究[J]. 山东大学学报(医学版) 2009(05)
• [16].HPV16,18,58-mE67重组腺病毒的构建及克隆表达[J]. 免疫学杂志 2008(04)
• [17].携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(07)
• [18].小鼠骨桥蛋白重组腺病毒的体外构建及表达[J]. 生命科学仪器 2019(01)
• [19].乙型肝炎病毒全基因组1.3倍体重组腺病毒的构建与表达[J]. 重庆医科大学学报 2014(07)
• [20].重组腺病毒pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-hSnail1质粒的构建[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志 2009(04)
• [21].O型口蹄疫多基因重组腺病毒的构建及其免疫原性[J]. 中国兽医学报 2009(10)
• [22].可抑制I型胶原表达的siRNA重组腺病毒的构建[J]. 华南理工大学学报(自然科学版) 2013(12)
• [23].表达小反刍兽疫病毒H基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫原性的试验[J]. 中国兽医杂志 2011(07)
• [24].表达猪CD3 ε蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性测定[J]. 中国兽医杂志 2008(06)
• [25].骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及诱导成骨的研究[J]. 中国骨肿瘤骨病 2008(05)
• [26].融合表达白细胞介素10与卵清蛋白重组腺病毒口服变应原疫苗的构建及鉴定[J]. 中华临床免疫和变态反应杂志 2018(03)
• [27].重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达[J]. 检验医学与临床 2017(22)
• [28].大鼠前列腺特异膜抗原基因重组腺病毒诱导小鼠特异性抗体的研究[J]. 四川大学学报(医学版) 2011(02)
• [29].靶向性重组腺病毒对裸鼠肝癌种植瘤的治疗作用[J]. 中国普外基础与临床杂志 2011(07)
• [30].人TSHR289基因重组腺病毒的制备与鉴定[J]. 江苏大学学报(医学版) 2016(04)

标签：牛结核病论文;  重组腺病毒论文;  融合基因论文;