长双歧杆菌遗传与表型多样性及其与免疫调节功能的相关性研究

论文摘要

双歧杆菌是人体肠道菌群中一类重要的微生物,一些双歧杆菌与其宿主之间存在复杂的相互作用。某些特定的双歧杆菌菌株已被证明具有拮抗肠侵袭性致病菌、抑制结直肠癌、抑制炎症性肠病以及缓解便秘等功能。长双歧杆菌是婴儿和成人肠道菌群中存在最广泛的一种双歧杆菌,本研究从比较基因组分析、体外特性和体内功能（缓解结肠炎）三个方面对其多样性进行了研究,得出主要结论如下:（1）基于高通量测序技术,分析了不同地区、年龄、民族和性别人群的肠道微生物组成,及双歧杆菌的组成。多元统计分析的结果显示,不同地区、年龄、民族的人群在菌群组成上存在差异;通过随机森林分析法,发现双歧杆菌的是不同人群之间差异较大的一个属,其中西藏当雄地区藏族人群的样品中双歧杆菌的丰度显著高于其他地区和民族人群的样品,儿童样品中双歧杆菌的丰度显著高于成年样品;不同性别人群的肠道微生物组成没有显著差异。双歧杆菌的高通量分析结果显示,长双歧杆菌是所有人群肠道中相对丰度最高的双歧杆菌,其平均相对丰度达34.30%;地区、年龄和民族因素对肠道中双歧杆菌组成具有影响,其中西藏当雄的样品中B.kashiwanohense的相对丰度显著高于其他地区的样品,壮族人群的样品中齿双歧杆菌的相对丰度显著高于其他民族,儿童样品中假小链双歧杆菌和短双歧杆菌的相对丰度显著高于其他年龄人群的样品。通过与标准菌株的基因组序列进行比对、构建进化树,明确了45株长双歧杆菌的亚种分类,其中42株属于长双歧杆菌长亚种、2株属于长双歧杆菌婴儿亚种、1株菌属于长双歧杆菌猪亚种。基于全基因的进化分析结果表明,相同亚种的菌株并没有明显的按照宿主年龄、地区、民族和性别等信息出现聚类的现象。（2）全基因序列比对结果显示,在45株长双歧杆菌的基因组中存在7个集中变异区,主要包括一些与碳水化合物转运、代谢以及多糖合成相关的基因或基因组簇。碳水化合物代谢相关基因的比较分析表明,长双歧杆菌长亚种和婴儿亚种的糖基水解酶基因的组成存在亚种间差异,而在菌株水平则没有发现成规律性的差异;而糖基转移酶基因的组成相对保守,在亚种水平和菌株水平均没有发现明显差异。菌株体外特性的分析表明,不同来源菌株的生物学特性存在差异。在体外生长特性方面,当菌株在MRS液体培养基中厌氧培养时,儿童来源菌株的生长速率相对较慢,延迟期为6-8 h,而老人源的菌株生长速率相对较快,延迟期为4-6 h;菌株对数末期活菌数的计数结果也显示,儿童来源菌株的CFU值显著低于老人源的菌株(分别为8.89±0.32 log10CFU/mL和9.22±0.28 log10CFU/mL)。糖发酵试验的结果显示,45株长双歧杆菌中有2株不能利用阿拉伯糖并且可以利用D-葡萄糖醛酸酯（HEN46-8和M2-03-F02-27）,进一步说明这两株菌属于长双歧杆菌婴儿亚种,其他菌株属于长双歧杆菌长亚种,与基因组比对结果相一致。另外,我们发现儿童来源的18个菌株中有14个可以发酵甘露糖,而成年人来源的27菌株中仅有6个可以利用甘露糖。发酵上清液中短链脂肪酸的测定结果表明,乙酸是长双歧杆菌所产生的唯一种类的短链脂肪酸。分析不同菌株产胞外多糖的能力,发现儿童来源的菌株产荚膜多糖的能力总体上低于成年人来源的菌株,特别与老年人来源菌株的差异具有显著性（13.84±12.55 mg/g和24.67±15.22 mg/g）。胞外多糖合成基因簇的分析结果表明,产荚膜多糖能力较弱的菌株（10 mg/g以下）,其EPS基因簇中糖基转移酶的数量显著少于高产荚膜多糖的菌株,糖基转移酶的数量与荚膜多糖产量之间具有相关性。（3）比较分析了不同长双歧杆菌对DSS诱导的结肠炎的缓解作用。结肠炎造模结束后,CCFM688、CCFM756、CCFM760、HAN42-10、M2-06-F01-M5-3、GX13-2、HAN30-6、YS108R干预组的疾病活动指数（DAI）显著低于模型组。炎症因子的分析结果表明,CCFM688、CCFM756、CCFM760、HAN42-10、HUB37-A12、M2-06-F01-M5-3、HAN30-6、HAN4-25、YS108R干预组的IL-6水平与模型组相比,呈显著下降的趋势。紧密连接蛋白表达水平的测定及结肠组织切片的分析结果表明,CCFM688、CCFM756、CCFM760、HAN30-6、HAN42-10、M2-06-F01-M5-3、YS108R、HUB37-A12对结肠炎造成的结肠结构损伤具有显著的保护作用;而HEN27-6、HUB2-25、M2-C-F01-14干预组的结肠粘膜层的正常结构完全被破环。在干预结肠炎效果较好的菌株中,除YS108R产黏性多糖外,其他菌株都具有较弱的产荚膜多糖的能力;而干预效果较差的菌株则具有较强的产荚膜多糖的能力。（4）提取长双歧杆菌的菌体表面成分,通过细胞模型对菌体不同成分的免疫调节功能进行分析。长双歧杆菌发酵上清液对LPS刺激的HT-29细胞没有显著的抑炎和保护作用。所有被测试的荚膜多糖中,只有YS108R的荚膜多糖对LPS刺激的HT-29细胞具有抑炎作用,其他菌株的荚膜多糖对则没有显著的抑炎作用。所有菌株的S-层蛋白都可以显著降低由LPS诱导的IL-8表达量的增加。将S-层蛋白与荚膜多糖以不同比例进行混合后,共同处理LPS刺激的HT-29细胞,结果显示,非黏性荚膜多糖的加入会对S-层蛋白的抑炎作用起到干扰。（5）将产黏性多糖的长双歧杆菌YS108R用于发酵的制作,并分析了YS108R发酵乳对结肠炎的干预作用。YS108R制作的发酵乳制品具有较低的乳酸析出率和较高的持水性（2.17%和21.46%）,可以改善发酵乳外观的稳定性和质构特性。使用YS108R与商品发酵剂混合发酵制作的发酵乳可以改善YS108R单菌发酵对产品风味的不良影响,同时还可提高产品的口感。对DSS诱导的结肠炎小鼠的干预实验表明,长双歧杆菌YS108R发酵乳可以从抑制炎症、维持肠道屏障功能以及调节肠道菌群3个方面改善DSS诱导的结肠炎。

论文目录

摘要

Abstract

缩略符号对照表

第一章绪论

1.1 肠道微生物与人体生理健康

1.2 双歧杆菌的多样性

1.2.1 双歧杆菌的种类及分布

1.2.2 双歧杆菌多样性的研究方法

1.2.3 影响肠道双歧杆菌组成的因素

1.3 长双歧杆菌的多样性及其基因组学

1.4 长双歧杆菌的主要生理功能及菌株间差异

1.4.1 长双歧杆菌的主要生理功能

1.4.2 长双歧杆菌对结肠炎的改善作用及其免疫调节作用的菌株间差异

1.5 长双歧杆菌的应用

1.6 立题意义及研究内容

1.6.1 立题意义

1.6.2 主要研究内容

第二章不同人群肠道菌群及长双歧杆菌多样性的分析

2.1 前言

2.2 材料与设备

2.2.1 主要试剂

2.2.2 培养基

2.2.3 主要仪器设备

2.3 实验方法

2.3.1 样品采集

2.3.2 粪便总DNA的提取

2.3.3 16SrRNA和GroEL基因扩增子高通量测序及数据分析

2.3.4 粪便样品中双歧杆菌的分离纯化、鉴定和保藏

2.3.5 长双歧杆菌全基因组的测序、组装和生物信息学分析

2.3.6 统计分析

2.4 结果与讨论

2.4.1 基于16SrRNA序列的肠道菌群分析

2.4.2 基于GroEL基因的双歧杆菌组成多样性分析

2.4.3 粪便样品中长双歧杆菌的分离、纯化

2.4.4 长双歧杆菌比较基因组学分析

2.5 本章小结

第三章长双歧杆菌功能基因和体外特性的比较分析

3.1 前言

3.2 材料与设备

3.2.1 主要试剂

3.2.2 培养基

3.2.3 主要仪器设备

3.3 实验方法

3.3.1 直系同源基因分析

3.3.2 共线性分析

3.3.3 COG功能基因注释

3.3.4 全基因组序列比对

3.3.5 双歧杆菌体外特性的分析

3.4 结果与讨论

3.4.1 长双歧杆菌直系同源基因分析

3.4.2 长双歧杆菌COG功能基因组成的比较分析

3.4.3 长双歧杆菌全基因组序列比对

3.4.4 碳水化合物代谢相关基因的比较分析

3.4.5 胞外多糖合成基因簇的分析

3.4.6 S-层蛋白基因的比对分析

3.4.7 长双歧杆菌菌株特性的比较分析

3.5 本章小结

第四章不同长双歧杆菌对结肠炎的改善作用

4.1 前言

4.2 材料与设备

4.2.1 菌株与细胞株

4.2.2 实验动物

4.2.3 主要试剂

4.2.4 主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 双歧杆菌的培养

4.3.2 细胞实验设计

4.3.3 动物实验设计

4.3.4 细胞培养上清液及动物血清中细胞因子的测定

4.3.5 结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）的测定

4.3.6 结肠组织细胞因子和紧密连接蛋白表达水平的测定

4.3.7 结肠组织病理切片的制作、苏木素-伊红（HE）染色和组织损伤评分

4.3.8 结肠粘液层的阿利新蓝染色

4.3.9 统计分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 长双歧杆菌对炎症状态肠上皮细胞炎症因子表达的影响

4.4.2 长双歧杆菌对结肠炎小鼠的改善作用

4.5 本章小结

第五章不同长双歧杆菌免疫调节差异性的机制分析

5.1 前言

5.2 材料与设备

5.2.1 菌株与细胞株

5.2.2 主要试剂

5.2.3 主要仪器

5.3 实验方法

5.3.1 双歧杆菌的培养

5.3.2 无细胞发酵液的准备

5.3.3 荚膜多糖的提取

5.3.4 菌体S-层蛋白的提取

5.3.5 HT-29细胞的培养

5.3.6 炎症状态细胞的诱导

5.3.7 细胞培养上清液中炎症因子的测定

5.3.8 HT-29细胞中炎症因子及紧密连接蛋白表达水平的检测

5.3.9 统计分析

5.4 结果与讨论

5.4.1 不同菌株发酵上清液对炎症状态HT-29细胞的影响

5.4.2 不同菌株荚膜多糖对炎症状态HT-29细胞的影响

5.4.3 不同菌株S-层蛋白对炎症状态HT-29细胞的免疫调节作用

5.4.4 长双歧杆菌胞外多糖影响S层蛋白的免疫调节作用

5.5 本章小结

第六章产黏性胞外多糖长双歧杆菌YS108R在发酵乳中的应用及其对结肠炎的改善作用

6.1 前言

6.2 材料与设备

6.2.1 菌株

6.2.2 主要试剂

6.2.3 主要仪器

6.3 实验方法

6.3.1 发酵乳的制备

6.3.2 发酵乳理化指标的测定

6.3.3 电子鼻分析

6.3.4 感官品评

6.3.5 动物实验设计

6.3.6 结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）活性的测定

6.3.7 血清中细胞因子的测定

6.3.8 结肠组织中细胞因子和紧密连接蛋白表达水平的RT-PCR测定

6.3.9 结肠组织切片的制作和观察

6.3.10 16SrRNA基因V3-V4区扩增子高通量测序和粪便菌群的分析

6.3.11 统计分析

6.4 结果与讨论

6.4.1 发酵乳理化特性的分析

6.4.2 YS108R发酵乳对结肠炎的影响

6.5 本章小结

主要结论与展望

主要结论

展望

论文创新点

致谢

参考文献

附录1:作者在攻读博士学位期间发表的论文

附录2:用于比较基因组学分析的基因组信息

附录3:不同长双歧杆菌S-层蛋白基因相应的氨基酸序列比对

附录4:长双歧杆菌C11A10B和YS108R基因组比对圈图

文章来源

类型: 博士论文

作者: 闫爽

导师: 陈卫

关键词: 长双歧杆菌,多样性,比较基因组,结肠炎,免疫调节,胞外多糖,层蛋白

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS201.3

总页数: 122

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