钟小斌
（广西锦莹药业有限公司广西南宁530219）
【摘要】目的：探讨对通脉颗粒微生物限度检查法验证。方法：建立通脉颗粒的微生物限度检验方法。采用常规法对样品进行方法验证。结果：五种规定试验菌的回收率均不低于70%，可用于通脉颗粒的微生物限度检验。结论：确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。
【关键词】通脉颗粒；微生物限度检查；方法验证。
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）07-0229-02
通脉颗粒具有活血通脉。用于缺血性心脑血管疾病，动脉硬化，脑血栓，脑缺血，冠心病，心绞痛。含有丹参、川芎、葛根等中药成分。根据其制剂用药途径和制法，细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌——大肠埃希菌检查。经实验研究，确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证，符合《中国药典》2010年版《中国药典》一部附录ⅧC有关微生物限度检查法有关规定，方法可行。
1.实验仪器、试药
1.1实验菌种
枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。由中国医学微生物菌种保藏管理中心提供。
1.2样品
通脉颗粒（批号：130101、130501、130601）生产厂家：广西锦莹药业有限公司
1.3培养基及稀释剂
营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（BL），改良马丁培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基，pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液等。
1.4仪器
培养箱、冰箱、微波炉、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器等。
2.细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证
2.1菌液制备
取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加10ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。
2.2供试液的制备方法
常规法：取样品10g，用pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液制成1∶10的供试液；取1∶10的供试液1ml注皿。
2.3回收率试验
试验组：同2.2，另分别取各试验菌50～100CFU，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h。
菌液组：取试验菌50～100CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定所加入的试验菌数，平行制备2个平皿。
供试品对照组：同2.2，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，霉菌和酵母菌培养48～72h，测定供试品本底菌数。
2.4方法的确定
选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验，结果：金黄色葡萄球菌回收率为93%，白色念珠菌回收率为86%，表明通脉颗粒对细菌、真菌没有抑制作用，采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液作为稀释剂无抑菌作用，对实验无干扰。
2.5细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
取3个批号通脉颗粒样品，细菌数、霉菌及酵母菌数按常规法进行加菌回收率试验，结果见表1。
三个批号样品的验证试验结果表明，以常规法进行通脉颗粒细菌数、霉菌及酵母菌数测定，五种规定试验菌的回收率均大于70%，符合《中国药典》的规定，方法可行。确定通脉颗粒细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。
3.控制菌检验方法的建立及验证
菌液制备同2.1。
3.1大肠埃希菌检查方法
常规法：取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10～100CFU，35℃培养24～48h。取培养物0.2ml接种至含5mlMUG培养基的试管中，35℃培养24h左右，366nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果；另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝（EMB）平板，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。
3.2大肠埃希菌试验结果
经胆盐乳糖（BL）培养基培养后，试验组与阴性对照组相比较有明显的变化，试验组有明显产酸产气现象，结果如表2。
4.结语
根据上述实验结果，拟定通脉颗粒微生物限度检查法标准正文如下：
微生物限度照微生物限度检查法（《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ）。
取本品10g，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1∶10的供试液。
细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌取1∶10的供试液，采用常规法，依法检查，应符合规定。
细菌数每1g不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数每1g不得过100cfu，大肠埃希菌每1g不得检出。
5.三批通脉颗粒的微生物限度检查
按上述所建立的通脉颗粒微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果见表3。
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