低聚葡萄糖氧化酶的基因克隆、表达与酶学性质

论文摘要

低聚葡萄糖氧化酶（Gluco-oligosaccharide oxidase,EC1.1.99.B3,GOOX）可特异性氧化葡萄糖及其通过α-1,4或β-1,4糖苷键连接构成的七糖及以下低聚糖,生成相应的醛糖酸。GOOX在糖酸制备及生物检测等领域有重要应用,但目前仅有三种GOOX被研究报道,开发新的GOOX对相关工业领域有实际应用价值。本研究对来自黑曲霉基因组和枯草芽胞杆菌基因组的低聚葡萄糖氧化酶基因进行了克隆表达与酶学性质解析,获得了如下结果:从枯草芽胞杆菌基因组中筛查到1个疑似编码低聚葡萄糖氧化酶的开放阅读框,在基因组不同位置克隆获得两段不同长度基因:bsgoox-L和bsgoox-S,二者的大小分别是1443 bp和1356 bp,同时在黑曲霉基因组中筛查到1个疑似编码低聚葡萄糖氧化酶的开放阅读框,angoox;进一步通过氨基酸序列比对可知,Angoox和Bsgoox分别与来源于A.piperis CBS 112811和Bacillus velezensis来源的低聚葡萄糖氧化酶具有较高相似性,相似度分别为97.26%和79.27%,二者皆有一个FAD结合域和黄素结构域,属于低聚葡萄糖氧化酶家族。提取黑曲霉总RNA反转录为cDNA作为模板,同时提取枯草芽胞杆菌基因组作为模板,成功将angoox、bsgoox-L、bsgoox-S在毕赤酵母中异源表达,并获得重组菌,通过摇瓶发酵,获得重组低聚葡萄糖氧化酶,酶活为5、3.9、3.5 mU/mL;进一步通过硫酸铵沉淀、脱盐和凝胶过滤层析,Bsgoox-L和Bsgoox-S均正常表达酶蛋白,且同时具有酶活力。Angoox、Bsgoox-L、Bsgoox-S的纯化倍数和得率分别为:19.2 和 42.2%、14.1 和 39.8%、18.7 和 33.2%。进一步分析其酶学性质和底物特异性。低聚葡萄糖氧化酶Angoox的最适温度和最适pH分别为:75℃和9.0,在55℃-85℃和pH 5.0-10.0下具有较好的稳定性;Bsgoox-L与Bsgoox-S在酶学性质方面一致,其最适温度和最适pH值,分别为:80℃和8.0,在50℃-85℃和pH 5.0-9.0下具有良好的稳定性。Ca2+和EDTA对酶活有抑制作用,Na+、Cu2+、K+对两种酶均有一定的促进作用,上述两种酶液均显示出对底物不同的偏好性。Angoox对低聚麦芽糖显示出更为良好的底物特异性,Bsgoox对蔗糖具有更好的底物特异性。Angoox和Bsgoox均具有更宽的底物谱。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苑馨瑶

导师: 王正祥

关键词: 低聚葡萄糖氧化酶,克隆与表达,黑曲霉,枯草芽胞杆菌,酶学性质

来源: 天津科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 天津科技大学

分类号: Q55;Q78

DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000255

总页数: 62

文件大小: 5349K

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