徐周纬, 严尚学, 吴华勋, 陈镜宇, 张影[1]2017年在《G蛋白偶联受体激酶2活性和表达的调控及其在治疗恶性肿瘤中的作用》文中认为G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,广泛分布于各种组织中,能够特异性的使活化的G蛋白偶联受体(GPCRs)发生磷酸化及脱敏,从而终止GPCRs介导的信号传导通路。GRK2不仅能够调节GPCRs和非GPCRs,其自身活性和表达也可受到多种因素的调节。GRK2具有多种不同的生理及病理作用,其涉及的许多信号通路与恶性肿瘤的发生发展密切相关。
黄河飞[2]2016年在《GRK4对肾脏脂联素受体促尿钠排泄的调控在高血压中的作用研究》文中认为研究背景目前研究认为,高血压的发病机制涉及多个系统。脂肪组织作为重要的内分泌器官,所分泌的脂肪细胞因子如脂联素、瘦素以及生物活性物质如脂肪酸、前列腺素、血管紧张素原等,在心血管疾病的发生发展中起到了重要作用。脂肪细胞因子的表达以及功能失调,被认为是导致高血压发病的重要原因。在众多的脂肪细胞因子中,脂联素的作用尤其引人注目。脂联素与高血压的关系不仅得到临床结果的佐证,也得到实验动物结果的支持。临床研究发现血浆脂联素水平的改变与高血压密切相关。脂联素敲除小鼠在高盐诱导下表现为血压升高,利用腺病毒过表达脂联素可以降低肥胖小鼠的血压。尿钠重吸收增加,排泄受损是高血压发病中的重要部分,但是脂联素的肾脏作用、参与高血压发生的机制等尚不清楚。脂联素受体分为两个亚型:脂联素受体1(Adipo R1)以及脂联素受体2(Adipo R2)。Adipo R1和Adipo R2在全身广泛分布。研究显示脂联素的两个受体亚型在肾脏均有高表达,并且脂联素通过肾脏脂联素受体对肾脏的生理和病理调节起到了重要作用。我们初期研究也发现脂联素受体在RPT细胞中的表达;肾脏灌注脂联素发挥促尿钠排泄作用,但高血压状态下该作用受损。脂联素受体虽不属于G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs),但是却能被G蛋白偶联受体激酶(G protein coupled receptors kinases,GRKs)所磷酸化,其受体磷酸化是其功能改变的重要机制之一;既往的研究发现,在众多的GRK亚型中,GRK4活性增高早于高血压发生而出现,其在高血压中的作用受到人们关注。GRK4基因位于人类染色体4q16.3的位置,与原发性高血压相关。GRK4变异体出现的机率与血压增高程度明显相关。利用GRK4变异体对非洲加纳人原发性高血压的预测准确率达70%以上,而对日本人原发性高血压的预测准确率达94%。我们对多个研究中心的研究结果所做的Meta分析也显示GRK4变异体与高血压发生的关系密切。GRK4变异体叁个转基因小鼠均表现为高血压,GRK4?142V小鼠为显性高血压,A486和R65L小鼠在高盐负荷的情况下表现为盐敏感性高血压。以此我们推测GRK4有可能参与了肾脏脂联素受体的磷酸化,从而参与了高血压的进展。所以,针对性抑制肾脏GRK4的表达可作为增强尿钠排泄,从而改善高血压的有效尝试。综上所述,我们推测:脂联素具有利尿排钠作用,该作用在高血压状态下丧失;其丧失的原因归因于脂联素受体发生磷酸化导致受体失活,归因于肾脏GRK4表达和活性增高;抑制肾脏GRK4具有降血压作用。研究目的研究脂联素对肾脏利尿排钠的影响及在高血压发生发展中的作用。明确GRK4是否参与调控脂联素受体磷酸化从而对血压进行调节,超声微泡靶向沉默肾脏GRK4是否对SHR大鼠的血压和尿钠产生影响。研究内容和方法1.脂联素在肾脏尿钠排泄中的作用及其机制1.1采用免疫印迹以及免疫荧光染色的方法,观察脂联素2种受体Adipo R1和Adipo R2,在正常血压大鼠(Wista Kyoto rat,WKY)肾脏及RPT细胞上的表达。1.2利用WKY大鼠,通过单肾灌注不同浓度的脂联素,观察尿流量、尿钠排泄率、以及血压的变化以明确脂联素是否具有利尿作用。同时采用高温灭活脂联素蛋白活性的方法,以排除蛋白的渗透性利尿作用以及致敏作用。1.3在WKY的RPT细胞上,采用Na+-K+-ATP酶活性检测方法,观察脂联素作用不同浓度和时间后对Na+-K+-ATP酶活性的影响。1.4实验首先验证Adipo R1和Adipo R2的小干扰RNA(si RNA)的干扰效率,然后将Adipo R1和Adipo R2的si RNA转染至RPT细胞中,观察在脂联素受体受到抑制时,脂联素对Na+-K+-ATP酶的作用,以明确何种受体介导脂联素的作用。1.5采用Na+-K+-ATP酶活性测定技术,加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)抑制剂Compound C、一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,e NOS)抑制剂(NG-nitro-l-arginine methyl ester,L-NAME)初步筛选脂联素抑制Na+-K+-ATP酶活性的信号通路。然后,采用免疫印迹法进一步观察在脂联素作用后,磷酸化AMPK及其下游信号分子e NOS的磷酸化表达情况。2.脂联素受体表达下调及GRK4调控脂联素受体磷酸化导致脂联素促尿钠排泄作用受损2.1采用同WKY大鼠相同浓度梯度的脂联素,对SHR进行单肾灌注。观察尿流量、尿钠排泄率以及平均动脉压的改变。2.2采用自发性高血压大鼠(Spontaneous hypertensive rat,SHR)的RPT细胞,观察脂联素对Na+-K+-ATP酶的作用。2.3采用实时定量PCR观察,比较于WKY RPT细胞,脂联素两个受体基因在SHR RPT细胞上的表达情况,同时,免疫印迹方法检测脂联素受体的蛋白表达情况。2.4单肾灌注脂联素受体激动剂即小分子化合物Adipo Ron对SHR尿钠排泄影响,以进一步明确受损的脂联素利尿作用来源于脂联素受体的改变。2.5根据实验结果,设计脂联素两个受体的过表达质粒,提取质粒并在SHR的RPT细胞上转染,观察脂联素受体恢复表达后,脂联素对Na+-K+-ATP酶的作用。2.6利用免疫共沉淀的方法,观察在SHR的RPT细胞上,脂联素受体的磷酸化表达情况。2.7脂联素受体激动剂Adipo Ron灌注GRK4?142V转基因小鼠(相比较于GRK4?WT小鼠,该小鼠的GRK4活性增强),观察脂联素受体参与的利尿作用是否受损。2.8筛选有效的GRK4 si RNA。观察在SHR RPT细胞中,干扰GRK4表达后,脂联素受体磷酸化程度。3.GRK4超声微泡靶向治疗改善SHR脂联素受体磷酸化并调节尿钠排泄与血压3.1利用5-羧基荧光素(5-Carboxyfluorescein,FAM)标记的超声微泡对GRK4si RNA进行包裹。3.2将超声微泡注射到SHR,在肾脏进行超声微泡靶向破坏技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)释放出GRK4 si RNA。20天后,观察SHR血压以及24小时(hour,h)尿量、尿钠排泄率,以及肾功能指标和肾纤维化指标。3.3取UTMD传输GRK4 si RNA至SHR大鼠肾脏,采用免疫共沉淀方法,观察脂联素受体磷酸化情况。研究结果1.脂联素受体Adipo R1以及Adipo R2在肾脏近曲小管均有表达,特别是肾脏皮质,在RPT细胞表达丰富。Adipo R1的蛋白条带为43Kd,Adipo R2的蛋白条带为44Kd。2.脂联素对WKY大鼠具有促尿量和尿钠排泄的作用,该作用呈现浓度依赖性3.脂联素对WKY RPT细胞上的Na+-K+-ATP酶活性产生抑制作用,该作用呈现浓度和依赖性。4.为研究脂联素作用的特异性,采用si RNA在WKY RPT细胞中敲低Adipo R1和Adipo R2,结果发现脂联素对Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用消失。5.Na+-K+-ATP酶活性检测发现,加入AMPK阻断剂和e NOS阻断剂后,脂联素对Na+-K+-ATP酶活性的抑制作用消失。同时,脂联素增加了磷酸化AMPK以及e NOS的表达,同时采用AMPK阻断剂后,脂联素对e NOS磷酸化增强的作用消失,说明脂联素通过AMPK-e NOS信号途径对WKY RPT细胞上的Na+-K+-ATP酶活性产生抑制作用。6.脂联素的利尿作用在SHR中受损。脂联素对Na+-K+-ATP酶的抑制作用在SHR的RPT细胞中同样受损。脂联素的作用得到了脂联素受体激动剂Adipo Ron的佐证:即:Adipo Ron具有利尿作用,该作用在SHR丧失。7.SHR肾脏脂联素受体表达量低于对照WKY大鼠,但其受体的表达量改变难以解释其功能丧失,因为过表达Adipo R1和Adipo R2后,其利尿作用仍不能恢复,说明还有其它因素参与。由于脂联素受体的磷酸化影响受体功能,我们的研究发现SHR肾脏脂联素受体磷酸化水平升高,提示高磷酸化水平可能是脂联素受体功能下降的原因。8.为验证GRK4是否参与调控脂联素受体磷酸化过程,我们采用GRK4?142V转基因小鼠灌注脂联素受体激动剂,发现脂联素受体参与调节的利尿作用消失。在SHR的RPT细胞中采用GRK4 si RNA干扰后,脂联素受体Adipo R1和Adipo R2的磷酸化程度减弱。这说明GRK4参与调控了脂联素受体的磷酸化,而脂联素促尿钠排泄作用的受损和脂联素受体在SHR中发生磷酸化相关。9.采用微泡包裹GRK4 si RNA,在SHR的肾脏进行靶向定位超声破碎微泡,释放出的GRK4 si RNA对GRK4产生抑制作用,肾脏脂联素受体的磷酸化水平减弱,SHR大鼠尿钠排泄增加,血压下降。同时,SHR肾功能未受到影响,肾纤维化得到改善。结论脂联素具有促肾脏尿钠排泄作用,在高血压状态下,这一功能受损;检测发现脂联素受体表达下调,但过表达受体后并不能完全恢复脂联素功能。受体的磷酸化可能在其中发挥重要的作用;GRK4活性增高是脂联素受体高磷酸化的原因;UTMD传输GRK4 si RNA有效抑制肾脏GRK4表达,在SHR可发挥降低血压、利尿排钠作用。
李昂[3]2016年在《大鼠组织G蛋白偶联受体激酶4的表达特征及其新剪接变异体的克隆》文中认为目的:G蛋白偶联受体激酶(GRK)是一类能使G蛋白偶联受体(GPCR)快速脱敏(desensitization)的丝氨酸/苏氨酸激酶家族分子,其基本功能是特异性地磷酸化GPCR,使其快速脱敏与G蛋白解偶联,同时招募β–Arrestin并与之结合,从而阻断GPCR介导的信号转导通路。在哺乳动物中GRK家族共有7个成员,根据结构和功能的相似性分为3个亚家族,GRK4属于GRK4亚家族。在GRK家族中,GRK4的变异率最大,有多个剪接变异体,其组织表达呈高度选择特异性,参与多种疾病的致病机制,如原发性高血压、多巴胺受体介导的神经源性疾病、卵巢癌和乳腺癌等。目前,对于GRK4的了解知之甚少,而关于GRK4在组织器官的分布情况亦缺乏详尽的研究。因此,笔者选取大鼠作为实验动物模型来研究GRK4基因的表达特征及功能,以期为之后的深入研究奠定良好的基础。方法:1.大鼠组织GRK4的表达特征:1)用Trizol提取不同年龄段大鼠卵巢组织和同只大鼠主要组织总RNA,逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR技术从RNA水平检测GRK4的表达特征;2)用加入抑蛋白酶肽、亮抑酶酞、PMSF的RIPA蛋白裂解液提取组织总蛋白,采用Western免疫印迹技术从蛋白水平检测GRK4在不同年龄大鼠各组织中的表达情况。2.GRK4基因及其新剪接变异体的获取和克隆:根据GenBank里大鼠GRK4基因序列设计特异性全长扩增引物;根据Western blot检测结果,用Trizol提取大鼠睾丸和附睾组织总RNA,逆转录合成cDNA,二次PCR扩增出纯度较高的大鼠GRK4基因及其剪接变异体DNA,电泳鉴定;回收电泳琼脂糖凝胶中多个不同分子量的条带,TA克隆,蓝白斑筛选,随机选取阳性克隆经PCR鉴定后,小提质粒送测序;使用NCBI-BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将所得序列与Gen Bank中己有序列进行比对分析,使用NCBI-Spidey工具(http://www.nebi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey)在线分析有效序列各外显子组成及位置。结果:1.大鼠组织GRK4的表达特征:1)通过实时荧光定量PCR技术检测GRK4基因的表达情况,结果显示:(1)大鼠卵巢中GRK4基因的表达水平随卵巢发育成熟而变化;(2)GRK4基因主要表达于大鼠卵巢、肾脏、心和骨骼肌组织。2)通过Western blot检测GRK4蛋白的表达情况,结果显示GRK4在大鼠的胸腺、睾丸、附睾、心和脑组织有较高表达,不同发育阶段其表达情况也不同。2.使用PCR技术扩增出大鼠GRK4基因及其新剪接变异体,TA克隆后送测序,经过比对分析获得2个在GRK4开放阅读框架内的新剪接变异体,命名为GRK4 variant X1和GRK4 variant X2。结论:(1)从时间特异性角度,通过对不同年龄段卵巢组织的研究发现GRK4的表达水平随着卵巢组织的发育程度而变化,提示其与组织生长发育调控有关;从空间特异性角度,GRK4特异性地表达于大鼠睾丸、胸腺、心和脑组织中。(2)克隆获取大鼠睾丸、附睾组织中GRK4的DNA序列,与Genbank中已有序列比对分析后得到两个在GRK4开放阅读框内的新剪接变异体。这些发现为进一步深入研究GRK4的功能提供了很有价值的信息。
田芙蓉[4]2009年在《G蛋白βγ亚基影响G蛋白偶联受体磷酸化的作用研究》文中研究表明本实验研究了G蛋白βγ亚基(Gβγ)对G蛋白偶联受体激酶-2(GRK2)介导的G蛋白偶联受体,如毒蕈碱乙酰胆碱m2受体(mAChR2)和β2肾上腺素能受体(β2-AR)磷酸化的影响,证明G蛋白βγ亚基在调节G蛋白偶联受体激酶活性中有着重要作用。探讨G蛋白βγ亚基如何影响mAChR2和β2-AR受体磷酸化,引发涉及受体磷酸化的级联反应。揭示在G蛋白信号通路的作用中,Gβγ亚基复合物通过直接激活某些胞内靶分子可能存在新的调控分子机制。本实验首先利用亲和层析方法从大鼠脑中纯化了mAChR2;再通过DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-300 HR和Phenyl-Sepharose CL-4B叁个层析柱从猪脑中分离纯化了G蛋白;纯化的G蛋白与GTP作用后,使用一次Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析,成功分离了G蛋白α亚基与G蛋白βγ亚基。将纯化的G蛋白βγ亚基、G蛋白偶联受体激酶-2,[γ-p32]标记的ATP分别与mAChR2,β2-AR共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶片干燥后放射性自显影检测mAChR2磷酸化结果。之后将干燥凝胶片中放射性标记的磷酸化mAChR2蛋白带剪下,同位素液体闪烁计数器计数。实验结果显示:G蛋白βγ亚基在没有激动剂存在的情况下明显增强了mAChR2的磷酸化,也增强了β2-AR的磷酸化;氨甲酰胆碱明显增强mAChR2的磷酸化,而阿托品或肝素(GRK2抑制剂)完全阻断了mAChR2的磷酸化;mAChR2的磷酸化是依赖激活剂如氨甲酰胆碱作用发生的,这种依赖关系呈明显的剂量关系;特布他林增强β2-AR的磷酸化,而肝素完全阻断了β2-AR的磷酸化;这些结果证实氨甲酰胆碱对mAChR2,特布他林对β2-AR磷酸化的增强作用是选择性的作用结果。而G蛋白βγ亚基同时增强mAChR2和β2-AR的磷酸化的结果提示,G蛋白βγ亚基是通过上调GRK2活性增强mAChR2和β2-AR的磷酸化。我们的研究发现G蛋白βγ亚基对受体激酶GRK2有着重要的调节作用。说明Gβγ同Gα一样均可引起效应蛋白的激活,在细胞信号转导中起同样重要作用,共同介导一系列的生物学效应。
田艳君[5]2014年在《GRKs和β-arrestins在GPCRs信号转导中作用的实验研究》文中认为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是迄今为止发现的最大的细胞表面受体超家族，可将多种细胞外物理性和化学性信号传递至细胞内，并通过与其它信号转导通路相互作用来调控各种生理功能。配体与GPCRs结合后，不仅能激活异源叁聚体G蛋白，还可以引发G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinases, GRKs）参与GPCRs的磷酸化。通常情况下，抑制蛋白（β-arrestins）会迅速与磷酸化的GPCRs结合，削弱受体通过G蛋白对刺激物的应答作用。本实验拟以孤啡肽受体（opioid receptor-like1receptor, ORL1）及apelin受体（putative receptor protein related to AT1, APJ）为主要研究对象，分析GPCRs调节因子GRKs和β-arrestins在这两种受体信号转导中的作用，探讨GPCRs信号转导的作用途径和作用机制，为临床治疗提供新的策略和药物靶点积累资料。本实验采用分子克隆方法构建含人ORL1、APJ及其突变体以及GRKs的各种真核表达载体，转染人胚胎肾细胞（HEK293T细胞），利用生物发光共振能量转移（bioluminine-scence resonance energy transfer, BRET）、激光共聚焦扫描显微镜等技术实时、动态地研究活细胞中GRKs、β-arrestins与ORL1、APJ的相互作用特点。同时，借助酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测细胞表面受体表达水平，分析配体诱导的受体内化的特点。基因测序证实，一系列的重组真核表达质粒，包括ORL1-Venus、ORL1-Rluc、EGFP-ORL1、GRK2/3-Rluc以及APJ突变体APJ S335A-Rluc、APJ S345A-Rluc、APJS348A-Rluc、HA-APJ S348A等均构建正确，可用于细胞转染。经BRET检测，给予ORL1特异性激动剂N/OFQ后，ORL1既可以与Gαi/o结合，又能与GRK3、β-arrestin2产生相互作用，但与细胞膜定位蛋白Kra（sK-Ras）的作用则会明显减弱。BRET2结果显示，在apelin-13作用下，野生型APJ与GRK2和GRK5均可发生相互作用，突变体APJ S335A和APJ S345A出现与野生型类似的效应；而APJ S348A与GRK2和GRK5均不能产生BRET信号。ELISA实验表明：采用N/OFQ处理细胞30min后，细胞表面ORL1水平降低，尤其当GRK3或β-arrestin2存在时，ORL1受体水平降低更加显着（p＜0.01），ORL1出现明显内化；采用apelin-13孵育细胞30min后，野生型APJ出现明显内化，当β-arrestins存在时内化更显着；但突变体APJ S348A，即便有β-arrestins的存在，也未发现明显的内化现象。采用BRET技术研究ORL1和APJ的信号转导特点时发现，ORL1和APJ存在BRET现象，可形成二聚体，结果显示此二聚化是配体非依赖性的。激光共聚焦显微镜技术和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）检测也得到了一致的结果。实验结果提示，激动剂作用下，GPCRs不仅可以通过G蛋白依赖的信号转导途径发挥作用，还可经由G蛋白非依赖的信号转导途径影响受体的脱敏、内化、移位、运输等过程。在N/OFQ作用下，ORL1可以迅速与Gαi/o偶联；随着时间的延长，ORL1与细胞膜逐渐分离，而与GRK3以及β-arrestin2的相互作用增强。GPCRs的C末端是与GRKs和β-arrestins结合的主要部位，丝氨酸/苏氨酸残基是主要的磷酸化位点。本研究表明，348位丝氨酸（S348）是决定APJ脱敏、内化的关键磷酸化位点，该位点用丙氨酸替代后受体的脱敏、内化会受到显着抑制。另外，本实验还首次初步证实了ORL1和APJ存在稳定的异源二聚化作用。深入研究N/OFQ/ORL1系统和apelin/APJ系统的信号转导机制不仅可以帮助我们了解GPCRs信号转导通路的复杂性；同时，因为上述N/OFQ/ORL1系统和apelin/APJ系统在多种疾病的发生、发展过程中发挥关键作用，我们期待本研究中ORL1、APJ激活后信号转导通路的明晰能为疼痛、焦虑、心力衰竭、高血压等的临床治疗提供新的诊治途径，并为研发新型药物及其作用靶点提供实验依据。
蒋晞[6]2010年在《G蛋白偶联受体激酶在胚胎发育中调控作用的研究》文中研究说明G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)是细胞表面最大的一类受体超家族,它能够介导多种多样的配体信号,包括激素、神经递质、气味及其它小分子,调节广泛的生理功能和药物作用,同时也是多种疾病临床治疗的靶点。G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases, GRKs)是调节GPCR的一类关键的丝／苏氨酸激酶。它能够特异性结合被激动剂激活的受体,迅速磷酸化受体的胞内段,抑制受体的持续激活,介导受体内吞和脱敏。GRK有七种亚型(GRK1-7),分为叁个亚家族。其中研究较多的是GRK2和GRK5。这两类GRK广泛分布于全身多种器官,对多种GPCR具有选择性的调节作用,参与调节多种多样的生理现象和病理过程。GRK2和GRK5都拥有保守的催化结构域,同时也各有特点：GRK2是GRK家族中唯一一个基因缺失胚胎致死的成员,其作用机制尚不清楚；GRK5及其同亚家族成员因拥有一段核定位序列,而在细胞浆和细胞核均有分布,但其核内功能却尚未明确。以往的研究主要集中在GRK2和GRK5对分化、发育成熟的机体、组织的调节功能上,GRK在胚胎发育过程中的作用还研究得较少。明确GRK这类生理功能、信号通路的关键调节蛋白在胚胎发育中的作用,将有助于指导胚胎期用药,并且对于防止胚胎发育异常有着重要意义。我们的研究以斑马鱼为模型,结合人类细胞上的机制探讨,主要揭示GRK2和GRK5对胚胎发育的调控作用。研究发现：1、GRK2和GRK5在斑马鱼胚胎发育早期都有高表达；在斑马鱼胚胎中分别下调GRK2和GRK5,都会引起胚胎发育的缺陷。其中,GRK2下调引起胚胎早期发育迟滞和细胞周期G2／M期停滞；GRK5下调主要影响正常的胚胎造血。不仅过表达野生型的GRK2或GRK5能够缓解内源蛋白下调导致的发育缺陷,其激酶活性缺失的突变体K220R和K215R也有明显的缓解作用,提示：GRK对于胚胎早期发育的调控不依赖其激酶活性。2、酵母双杂交结果提示,GRK2可以与cyclin B1调节蛋白PTCH1相互作用；基因芯片结果提示,GRK5可能对调节造血的转录因子GATA2有调节作用。细胞实验证明,GRK2与PTCH1之间、GRK5与GATA2之间确实存在相互作用；并且通过免疫共沉淀筛查,找出了各自的结合位点。实验发现,包含GRK2与PTCH1结合位点的小片段BP对GRK2下调引起的胚胎早期发育迟滞和细胞周期G2／M期停滞均有明显的缓解作用,而结合功能缺失的突变体△312-379则没有这种效应；GRK5与GATA2结合功能缺失的点突变R216L不能缓解GRK5下调所引起的造血功能障碍,其包含结合位点的小片段M130甚至还有显性失活突变体的作用。提示,GRK2与GRK5分别通过结合PTCH1和GATA2调节胚胎发育。3、PTCH1的激动剂Hedgehog (ShhN)刺激促进GRK2结合PTCH1,减弱cyclinB1与PTCH1的相互作用。GRK2、K220R和BP都能促使cyclin B1与PTCH1解离,促进cyclin B1从细胞浆进入细胞核,而△312-379则不能。提示,GRK2通过与PTCH1相互作用,促使cyclin B1与PTCH1解离,促进cyclin B1回到细胞核内调节细胞周期、细胞增殖和胚胎发育。4、GRK5、K215R以及GRK2核定位的突变体NLS-GRK2均能促进GATA2在细胞核内积聚,并且增强GATA2的转录活性；而R216L和核定位缺陷的GRK5突变体NES-GRK5则不能。提示,GRK5主要通过结合GATA2,在核内积聚GATA2,促进GATA2的转录功能。综上所述,我们的研究发现了GRK2和GRK5在胚胎发育过程中、与成体不同的重要调节作用,探讨了两者各自的调节机制。其中,GRK2主要通过直接结合cyclin B1的调节蛋白PTCH1,从而促使cyclin B1与PTCH1解离,增加cyclinB1入核,促进cyclin B1介导的细胞周期和胚胎发育；GRK5则通过结合GATA2,使GATA2在核内积聚,增强GATA2的转录活性,促进造血干细胞的分化成熟和胚胎造血。我们的研究揭示了GRK在胚胎发育方面新的调节功能和激酶活性非依赖的调节通路。
王冬梅[7]2012年在《肾上腺髓质素和MrgC受体对μ阿片受体功能的调节—G蛋白机制》文中指出疼痛是防止损伤的一种保护性机制,但是病理性痛(包括炎性痛和神经病理性痛)却影响人们的生活质量。阿片是治疗疼痛最有效的药物,但是反复应用会产生耐受,限制其临床应用。因此研究疼痛和阿片耐受的机制具有重要意义,可以为治疗疼痛找到新的途径。本文研究结果显示：1. AM生物活性的增加参与了慢性应用吗啡伴随的痛觉过敏的形成和维持。慢性应用吗啡会通过激活μ-阿片受体和PKC信号通路引起AM上调。2.在CFA诱发的炎性痛中,AM会激活NO和CGRP。AM-NO-CGRP级联反应参与了CFA炎性痛引起的慢性痛觉过敏。脊髓背角AM的持续活动参与了吗啡耐受及其伴随的痛觉过敏。3. μ-阿片受体功能的改变即与G蛋白偶联关系的改变,可能是AM参与吗啡耐受的机制。4.激活Mrg受体可以调节脊髓背角μ-阿片受体与G蛋白的偶联关系,增加吗啡的抗伤害性效力。本文主要探讨了AM在吗啡耐受和炎症痛中的作用,以及AM和Mrg受体对μ-阿片受体的调制及其细胞学机制。获得了一些新的研究数据,可以为研究炎性痛和吗啡耐受的机制提供一些理论依据。
陈跃军[8]2008年在《表皮生长因子受体反式调节G蛋白偶联受体功能的研究》文中研究指明G蛋白偶联受体(GPCR)是一类重要的细胞表面受体超家族。GPCR的细胞内信号主要由G蛋白介导。激动剂反复刺激能启动受体负反馈调控机制,使受体对激动剂的反应性下降,即发生受体的脱敏。激动剂诱导的GPCR的磷酸化和内吞是GPCR介导信号的负调控的主要机制。G蛋白偶联受体激酶(GRK)是催化激动剂诱导的GPCR磷酸化以及启动受体脱敏的关键激酶,GRK的亚细胞分布和功能的改变显着影响了GPCR的功能。受体酪氨酸激酶(RTK)是另一类跨膜受体家族,参与了很多细胞功能的调节。最近的研究发现GRK2也参与了受体酪氨酸激酶信号的调节。我们以前的研究发现激活受体酪氨酸激酶(RTK)家族的一员,表皮生长因子受体(EGFR),可以诱导GRK2和EGFR形成复合物。本研究在以前的工作基础上,以EGFR和阿片受体为模型探索了受体酪氨酸激酶对G蛋白偶联受体功能的调控作用及其机制。本研究结果表明:1)EGF(100ng/ml)预处理20分钟促进了6阿片受体(DOR)的特异性激动剂DPDPE诱导的DOR的内吞,DOR羧基末端叁个主要的GRK2磷酸化位点突变为丙氨酸的突变体(M4/5/6)也可以进行DPDPE依赖的内吞,但是EGF预处理不能促进DPDPE诱导的M4/5/6的内吞。这一结果提示GRK2催化的DOR的磷酸化在EGF预处理导致的DPDPE依赖的DOR的内吞增加中是必需的。2)EGF刺激诱导了GRK2的膜转位并且和EGFR形成复合物。我们构建了GRK2的缺失突变体,发现GRK2主要通过它的催化域和EGFR结合。3)进一步的实验发现EGF刺激诱导了GRK2的酪氨酸磷酸化,我们通过点突变GRK2上的酪氨酸位点发现EGF诱导的GRK2的酪氨酸磷酸化主要发生在GRK2氨基端的13,86,92酪氨酸上。并且这一过程不需要EGFR下游的非受体型酪氨酸激酶Src的参与,提示GRK2的磷酸化是EGFR直接催化的结果。4)体外结合实验和体外激酶实验证明GRK2可以和EGFR直接相互作用,在体外EGFR可以催化磷酸化GRK2。同时在细胞内过表达GRK2的催化域肽段(GRK2-CD)竞争GRK2和EGFR的结合,显着抑制了EGF诱导的GRK2的酪氨酸磷酸化。这一结果提示在体内激活的EGFR催化磷酸化GRK2氨基端的酪氨酸残基发生磷酸化,EGFR和GRK2催化域的结合对于EGFR介导的GRK2的酪氨酸磷酸化是必需的。5)EGFR介导的GRK2的酪氨酸磷酸化增强了GRK2的激酶活性:在过表达EGFR、DOR和GRK2的HEK293细胞内,EGF刺激增强了DOR的基础磷酸化水平;而在过表达酪氨酸位点突变的GRK2的细胞内,EGF诱导的DOR的磷酸化则被明显削弱了。6)我们进一步研究了EGF刺激对其它G蛋白偶联受体的影响,我们检测了μ阿片受体(MOR)在EGF刺激后的内吞情况,我们发现EGF刺激诱导了野生型MOR的内吞,而MOR磷酸化位点缺失的突变体MOR363/370/375A不能被EGF诱导发生内吞,干扰GRK2的蛋白水平明显抑制了EGF诱导的MOR的内吞。这一结果提示GRK2也介导了EGF诱导的MOR的内吞。我们首次发现受体酪氨酸激酶信号通路的激活可以调节G蛋白偶联受体的内吞。EGF预处理增加了DPDPE诱导的6阿片受体的内吞,我们通过体外和体内的实验证明这一过程是通过EGFR介导的GRK2的酪氨酸磷酸化和激活而实现的,并且首次发现并证明GRK2是EGFR的底物。我们进一步证明EGFR对G蛋白偶联受体的调节作用不仅仅局限于6阿片受体,EGFR也可以调节μ阿片受体的内吞,并且这一过程是GRK2介导的。提示EGFR对G蛋白偶联受体的调节作用可能是一个普遍的现象,同时GRK2可能是受体酪氨酸激酶调节GPCR信号通路的关键中介分子。阿片受体是一类G蛋白偶联受体,阿片类药物与神经系统的阿片受体结合产生镇痛作用,最近的研究发现阿片受体在很多肿瘤细胞内都有表达,并且肿瘤细胞膜表面阿片受体的表达量和肿瘤的生长速率呈负相关。很多肿瘤细胞都伴有EGFR的过表达或持续激活。EGFR对阿片受体的反式调节可能在肿瘤发生中发挥了重要的作用。
王春梅[9]2009年在《大鼠G-蛋白偶联受体激酶5重组蛋白的表达及ELISA检测》文中进行了进一步梳理GRK5是G蛋白偶联受体激酶(GRKs)家族的一个成员,它主要磷酸化生物体中最大的一类跨膜受体G蛋白偶联受体(GPCRs),能够介导受体的失敏,调节信号的转导,在组织分化、疾病发生过程中具有重要的作用。有研究显示GRK5在甲状腺分化癌、高血压、心力衰竭、阿尔默海茨病、帕金森病、记忆功能及药物成瘾中具有非常重要的作用。但对GRK5在这些疾病中的具体作用不是很清楚,已有的研究大都是通过相关的动物模型来探讨GRK5的具体功能。动物模型的优点是:临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来、可以严格控制实验条件,增强实验材料的可比性、有助于更全面地认识疾病的本质;缺点是:费时、费力、一个周期较长。基因克隆技术使得真核基因能在原核表达系统中表达,蛋白的纯化也比较容易,这给研究蛋白的功能活性带来了方便。而原核表达具有操作方便、快捷,需时较短,表达量大,适合工业化生产等优点。通过基因克隆技术可将GRK5基因转入原核表达系统中进行表达,并对GRK5蛋白的表达进行检测,并且蛋白的纯化比较方便,这对后续蛋白性质的研究奠定基础。本论文就SD大鼠GRK5在大肠杆菌中的表达进行以下的研究。1、GRK5基因的扩增、克隆和序列分析根据GeneBank数据库公布的SD(Sprague-dawley)大鼠GRK5的基因序列,设计GRK5基因的特异性引物,从SD大鼠组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到GRK5基因,限制性酶双酶切后克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体上,送交测序公司测序,得到GRK5的核苷酸序列,并与GeneBank数据库上公布的SD大鼠GRK5基因序列进行比对,比对结果显示GRK5基因克隆成功。2、GRK5-GST重组蛋白在大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中的表达及优化将GRK5基因重组到pGEX-4T-1载体上,转化到大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中诱导表达,在OD_(600)为0.6,IPTG终浓度为0.3mM,37℃,诱导4h,经过SDS-PAGE分析,证实GRK5-GST重组蛋白表达成功。将pGEX-4T-1/GRK5重组载体转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中,进行正交试验优化表达,在IPTG浓度为0.3mM、0.5 mM、0.7 mM、0.9 mM,诱导温度为25℃、28℃、30℃、37℃分别下诱导3h、4h、5h、6h,收菌,超声破碎,经过SDS-PAGE和ELISA分析,表达量没有变化,且表达水平低,这可能是由于多种原因造成的,如:稀有密码子、真核基因在原核表达系统中的表达低等。3、GRK5的ELISA方法检测本实验中,GRK5的样品与包被液按1:2的比例稀释;GRK5多克隆抗体按1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000比例的浓度稀释,优化一抗工作浓度;HRP标记的羊抗兔二抗按说明书推荐的最佳比例1:500的浓度稀释,同时设置空白和阴性对照。正式试验采用GRK5的样品与包被液按1:2的比例,优化的一抗工作浓度1:700,二抗1:500,450nm测吸光值,计算出S/N的值,检测GRK5的表达水平,ELISA结果表明:GRK5蛋白在E.coli Rosetta-gami(DE3)中成功表达。
吴晶晶, 孙妩弋, 胡姗姗, 刘道芳, 魏伟[10]2013年在《G蛋白偶联受体激酶活性调控及其在恶性肿瘤中的作用》文中认为G蛋白偶联受体(GPCR),是一类重要的细胞表面受体。G蛋白偶联受体激酶(GRK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其亚型广泛存在与各种组织,能够特异性地使活化的GPCR发生磷酸化及脱敏,从而终止GPCR介导的信号转导通路。新的研究还发现,GRK不仅作用于GPCR,也可以通过使非GPCR磷酸化或通过非磷酸化作用参与信号转导。GRK不仅能够调节GPCR和非GPCR,其自身活性也可受到多种因素的调节。本文结合GRK的多种功能作用和GRK活性调控,对GRK在脑、内分泌、生殖系统、消化系统及黑色素肿瘤中的作用做简要综述。
参考文献：
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[2]. GRK4对肾脏脂联素受体促尿钠排泄的调控在高血压中的作用研究[D]. 黄河飞. 第叁军医大学. 2016
[3]. 大鼠组织G蛋白偶联受体激酶4的表达特征及其新剪接变异体的克隆[D]. 李昂. 桂林医学院. 2016
[4]. G蛋白βγ亚基影响G蛋白偶联受体磷酸化的作用研究[D]. 田芙蓉. 吉林大学. 2009
[5]. GRKs和β-arrestins在GPCRs信号转导中作用的实验研究[D]. 田艳君. 曲阜师范大学. 2014
[6]. G蛋白偶联受体激酶在胚胎发育中调控作用的研究[D]. 蒋晞. 复旦大学. 2010
[7]. 肾上腺髓质素和MrgC受体对μ阿片受体功能的调节—G蛋白机制[D]. 王冬梅. 福建师范大学. 2012
[8]. 表皮生长因子受体反式调节G蛋白偶联受体功能的研究[D]. 陈跃军. 复旦大学. 2008
[9]. 大鼠G-蛋白偶联受体激酶5重组蛋白的表达及ELISA检测[D]. 王春梅. 西南大学. 2009
[10]. G蛋白偶联受体激酶活性调控及其在恶性肿瘤中的作用[C]. 吴晶晶, 孙妩弋, 胡姗姗, 刘道芳, 魏伟. 2013年（第叁届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要. 2013
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