一、镁离子在0.1mmol/L谷氨酸诱发的体外海马神经元损伤中的作用(英文)（论文文献综述）
徐润楠[1]（2021）在《侧脑室给与硫酸镁对局灶性脑缺血大鼠神经保护作用的研究》文中研究说明目的:IMAGES和FAST-MAG两项大型的临床试验显示补镁治疗不能改善患者预后,脑缺血超急性期通过循环系统补镁后,血脑屏障的通透能力被认为可能是影响临床试验效果的原因之一。我们通过侧脑室给与硫酸镁,探讨局灶性脑缺血后超急性期补镁对大鼠的神经保护作用。方法:雄性SD大鼠,侧脑室置放给药通道,7天后参照Longa线栓法制作MCAO模型,梗死90min后拔栓再灌注。动物随机分为假手术组、模型组、腹腔给药组、侧脑室给药组（设置梯度浓度）。1.评价置放通道对于大鼠的影响:转棒实验检测大鼠置管前后运动能力。2.行为学评价:Longa法评分评价各组大鼠神经功能改变。3.组织学评价:取脑制备H-E切片及TTC染色组织,检测脑梗死量的变化。4.缺血后补镁的脑保护作用的机制研究:通过免疫组织化学法,观察NMDA受体亚基p-NR1阳性细胞的表达和小胶质细胞标记蛋白Iba-1的表达。结果:1.侧脑室置放给药通道前后运动能力无明显差异。2.神经功能缺损评分:再灌注24h后,相较于模型组（2.20±0.45分）,侧脑室中、高浓度组Longa法的评分均下降了45.0%（P<0.05）。3.组织学评价:H-E染色,与模型组（38.26±0.68%）相比,侧脑室中浓度组（26.01±1.75%）和高浓度组（25.22±1.26%）的脑梗死面积显着减少（P<0.01）;追加TTC染色,与模型组（39.02±3.63%）比较,侧脑室中浓度组（22.79±6.64%）的脑梗死体积显着减少（P<0.01）。4.施行免疫组织化学染色,观察NMDA受体亚基p-NR1阳性细胞的表达和小胶质细胞标记蛋白Iba-1的表达。侧脑室中、高浓度组的p-NR1阳性细胞数于再灌注24h后相比模型组,在纹状体区分别升高了71.4%、40.2%（P<0.01）,在皮质区分别升高了66.3%、83.2%（P<0.01）;活化的Iba-1+小胶质细胞数:与模型组（10.58±0.52个/mm2）比较,侧脑室低、中、高浓度组皮质活化的Iba-1+小胶质细胞数分别降低了33.1%、66.9%、48.9%（P<0.01）。结论:（1）侧脑室注射硫酸镁能够改善脑缺血梗死体积,并改善脑缺血大鼠神经功能。（2）相比与腹腔给药,侧脑室注射硫酸镁能够干预缺血后NMDA受体亚基NR1的去磷酸化,从而改善缺血损伤。（3）侧脑室硫酸镁组也能够抑制小胶质活化,改善缺血后炎症损伤。
吴琼[2]（2021）在《基于数据挖掘和网络药理学探讨中药治疗TON的用药规律及机制》文中研究说明第一部分基于数据挖掘探讨中药治疗外伤性视神经病变的用药规律目的:整理近20年以中药治疗外伤性视神经病变（Trauma optic neuropathy,TON）的临床研究类文献,运用数据挖掘技术对文献中涉及的中药处方进行系统分析,探究中药治疗TON的用药规律,为临床提供参考和指导。方法:通过计算机检索中国知识资源总库（China national knowledge infrastructure,CNKI）、万方数据库、维普数据库自2000年1月至2020年9月关于中药治疗TON的临床文献,按照纳入、排除标准筛选文献、提取数据,使用Excel 2016进行中药频次频率、四气五味、归经、功效特点分析,使用SPSS Modeler 18.0软件对频次≥7的高频中药进行关联规则分析,使用IBM SPSS25.0对频次≥5的高频中药进行聚类分析。结果:（1）本研究共纳入文献38篇,获得处方38个,共涉及74味中药,中药累及使用频次为392次,使用频次最多的前五位中药为:当归、川芎、赤芍、红花、柴胡。最常用的基础方为血府逐瘀汤和除风益损汤。（2）药物归经上,归于足厥阴肝经的中药频次最高,其次为手少阴心经、足太阴脾经;药性方面,温性药与寒性药使用频次最高;药味方面,使用频次在前三位的是苦味药、甘味药和辛味药。（3）中药功效类别上,使用频次位于前两位的是活血化瘀药和补虚药。（4）根据关联规则分析,置信度为100%时,支持度位于前三位的关联规则是川芎-桃仁、川芎-桃仁-红花、川芎-赤芍-红花。（5）根据聚类分析,可将中药聚为四类:藁本、前胡、防风聚为一类;熟地、白芍、当归聚为一类;红花、桃仁、牛膝、川芎聚为一类;柴胡、枳壳、桔梗聚为一类。结论:（1）中医治疗TON的高频次中药为当归、川芎、赤芍、红花、柴胡,功效类别以活血化瘀药和补虚药为主,支持度前三位的关联规则为川芎-桃仁、川芎-桃仁-红花、川芎-赤芍-红花,均体现中医治疗TON的治疗原则为活血化瘀、补虚行气;（2）治疗TON的中药多归于肝、心二经,且以苦味药和甘味药为主,寒温属性药物均有,符合活血化瘀药和补虚药的性味归经特点;（3）治疗TON最常用的处方为血府逐瘀汤和除风益损汤,聚类分析展现了治疗TON常用处方的组方配伍特点,即以活血化瘀药（红花、桃仁、川芎等）和补虚药（白芍、当归等）为主,辅以祛风解表药（藁本、前胡、防风）与行气药（柴胡、枳壳、桔梗）。第二部分基于网络药理学探究红花治疗外伤性视神经病变的机制目的:基于网络药理学及生物信息学的研究思路,探究红花治疗TON视神经损伤的潜在分子网络调控机制。方法:（1）通过中医药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）筛选红花的活性成分及作用靶点,利用Uniprot数据库查询靶点蛋白对应的基因名称,并通过Cytoscape软件构建红花有效成分-基因靶点的调控网络;（2）在基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中筛选TON相关芯片,使用GEO2R筛选疾病差异基因,使用韦恩分析得到红花有效成分治疗TON的核心靶点;（3）使用Cytoscape 3.7.2软件构建红花对TON基因靶点的蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network,PPI）,使用 BisoGenet、CytoNCA 软件包提取核心互作网络;（4）使用DAVID数据平台对筛选出的红花治疗TON的核心靶点进行基因本体论（geneontology,GO）功能注释和日本京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。结果:（1）本研究共获得红花17种活性成分,作用靶点共205个;筛选出GSE17117芯片中TON的差异表达基因共617个,其中上调基因429个,下调基因188个;（2）经过韦恩分析,筛选出红花治疗TON的核心靶点11个;（3）通过PPI网络构建和网络拓扑分析,共筛选出红花治疗TON的14个核心靶点蛋白;（4）GO富集分析结果显示,红花作用于TON的靶点主要富集于胞外间隙、细胞质基质、顶端细胞;所涉及的生物学过程包括凋亡过程的负调控、对有机物质的应答、凋亡过程中的正调控等;相关的分子功能主要为结合核激素受体、结合蛋白质复合物。（5）KEGG调控通路富集分析结果显示,红花调控TON的通路主要有肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）信号通路、癌症信号通路、雌激素信号通路、Toll样受体信号通路。结论:通过对红花有效成分治疗TON的网络药理学分析,我们推断出红花可能通过调节Caspase-3、基质金属蛋白酶-9（Matrix Metallopeptidas 9,MMP9）等靶点调控TNF等相关信号通路,干预视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells,RGCs）凋亡等生物学过程,从而在TON的治疗中起到视神经保护的作用。第三部分红花注射液对L-谷氨酸钠诱导的RGC-5细胞TNF凋亡信号通路的影响目的:在前两部分研究的基础上,运用体外实验验证红花注射液对视神经损伤后RGCs凋亡的调控机制。方法:（1）实验采用星孢菌素（Staurosporine,STSN）诱导RGC-5神经元性分化;采用CCK-8法,筛选RGC-5谷氨酸损伤模型中L-谷氨酸钠最佳损伤浓度和损伤时间,以及红花注射液干预RGC-5细胞的最佳浓度。（2）根据检测目标的需要,将RGC-5细胞按照1×105/ml的浓度接种至相应培养板中;经STSN诱导后的,分别标记为5个实验组:细胞对照组（A组）、L-谷氨酸钠模型组（B组）、红花注射液组（C组）、抑制剂Ac-DEVD-CHO组（D组）、红花注射液联合抑制剂组（E组）。A组添加DMEM-H培养基,B-E组加入所筛选的最佳L-谷氨酸钠损伤浓度培养基。根据筛选出的L-谷氨酸钠损伤时间孵育后,按照分组进行加样:A组加入DMEM-H培养基,B组加入同浓度的L-谷氨酸钠培养基,C组加入筛选出最佳浓度的红花注射液培养基,D组加入10μmol/L的Ac-DEVD-CHO培养基,E组加入最佳浓度的红花注射液联合Ac-DEVD-CHO培养基。培养24h后进行检测。（3）实验指标检测:采用免疫荧光法检测RGC-5细胞中Brn3a的表达;采用CCK-8法检测各实验组RGC-5细胞的存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Western-blot检测各组细胞I型TNF受体（tumor necrosis factor receptorI,TNFR1）、死亡结构域相关蛋白（Fas-associated protein with death domain,FADD）、Caspase-8、Caspase-3 蛋白的表达水平。结果:（1）经筛选,浓度为0.5 μmol/L的STSN培养基孵育1 h可诱导RGC-5发生神经元形态改变。浓度为8mmol/L的L-谷氨酸钠干预18h所建立的RGC-5损伤模型,细胞凋亡率能够达到43.98%,最接近细胞半数凋亡剂量（half maximal inhibitory concentration,IC50）。60%的红花注射液干预 RGC-5 细胞 24h,细胞抑制率为41.34%,最接近IC50。最终选择0.5 μmol/LSTSN诱导RGC-5细胞1h促进RGC-5的分化,10 mmol/L的L-谷氨酸钠干预18 h建立RGC-5损伤模型,70%红花注射液作为本次实验的干预浓度。（2）免疫荧光结果显示,RGC-5细胞可以表达鼠类视网膜神经节细胞中的特异性转录因子Pou结构域转录因子3A（POU domain transcription factor 3A,Brn3A）。（3）细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测结果显示:与A组相比,B组细胞存活率仅为68.35%;C组细胞存活率为77.51%,D组81.13%,E组为86.88%;与B组光密度（optical density,OD）值相比,C、D、E组的OD值均显着增高,差异均有统计学意义（P<0.01）。（4）流式细胞凋亡检测结果显示:各组RGC-5细胞凋亡率分别为:A 组 3.43%,B 组 25.75%,C 组 15.88%,D 组 14.21%,E 组 11.56%。与 B 组相比,C、D、E组的凋亡率显着降低,差异均有统计学意义（P<0.01）。（5）TNFR1/FADD/Caspase-8/Caspase-3凋亡信号通路相关蛋白表达水平:与B组比较,C、D、E组的TNFR1、FADD、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达水平显着降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。在TNFR1、FADD、Caspase-8蛋白表达水平上,C组与D组间无显着统计学差异（P>0.05）,说明红花注射液与抑制剂Ac-DEVD-CHO 在调控 TNFR1、FADD、Caspase-8 蛋白上效力相当;在 Caspase-3蛋白表达水平上,C组与D组间有显着统计学差异（P<0.05）,说明在降低Caspase-3蛋白水平上,特异性Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO较红花注射液效果更显着。此外,E组在降低Caspase-8、Caspase-3蛋白水平上,较C组、D组更显着（P<0.05）,说明红花注射液联合抑制剂可以起到协同抑制细胞凋亡的作用。结论:（1）红花注射液能够有效抑制L-谷氨酸钠对RGC-5细胞的凋亡损伤,提高其存活率;（2）70%红花注射液能够发挥明显的抗凋亡作用,该作用可能通过抑制RGC-5细胞中TNFR1、FADD、Caspase 8、Caspase 3蛋白的表达水平,调控TNFR1信号通路实现的。
崔盼盼[3]（2021）在《VitD-BDNF-ERK通路在OSAHS大鼠海马组织中表达的研究》文中研究指明研究背景阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive Sleep Apnea Hypopnea Syndrome,OSAHS）在儿童中很常见,是以睡眠时上呼吸道间歇性发生部分或完全性阻塞,进而导致导致气体交换困难、间歇性缺氧为病理基础的一种疾病,其以频繁觉醒、睡眠结构紊乱、睡眠不足为主要临床表现,全身多个系统均可以受累产生负面影响[1]。儿童OSAHS的患病率为2%到4%,扁桃体和（或）腺样体肥大是儿童发病的主要病因[2]。这些儿童大多数症状比较轻微,而且长大后大多会康复,但是一些患有严重OSAHS的儿童经常表现出打鼾、睡眠呼吸暂停,张口呼吸、夜尿、夜惊,并伴有注意力下降和性格行为异常等,这些通常是儿童就诊的主要原因。多导睡眠呼吸监测（Polysomnography,PSG）是诊断OSAHS的“金标准”,其中监测报告中呼吸暂停低通气指数（Apnea Hypopnea Index,AHI）和最低血氧饱和度（Lowest Oxygen Saturation,LSAO2）是最重要指标,临床中根据AHI和LSAO2可以有效直观的判断OSAHS病情及严重程度。OSAHS最主要的病理生理基础是慢性间歇性低氧（Chronic Intermittent Hypoxia,CIH）,CIH导致的神经元细胞损伤是及其复杂的过程,其中氧化应激反应起重要作用,低氧导致细胞内氧化还原失衡,会产生大量活性氧自由基,从而导致氧化及抗氧化物质之间的平很被打破,细胞中还原物质无法将氧化物质清除,造成组织损伤、细胞凋亡,其中氧化应激关键因子DUOX1、ROS等发挥着最重要的作用。DUOX1-ROS主要通过脂质过氧化作用导致细胞死亡,在氧化应激过程中,膜磷脂酶A2被激活,引起膜磷脂水解并增加通透性,直接破坏细胞膜结构,同时脂质中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,会产生大量的脂质过氧化物,对神经元和蛋白质产生毒性作用,从而导致细胞崩解死亡。众所周知,海马被认为是学习和记忆的重要区域,但它对细胞中的氧浓度极为敏感,而OSAHS最主要病理基础是慢性间歇性低氧,导致颅内血氧浓度下降,引起海马神经元损害,这可能是OSAHS儿童表现出来学习成绩下降、记忆力减退、注意力不集中、暴躁易怒等情绪记忆功能障碍的主要原因。脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF）是广泛分布于中枢神经系统中代表着大脑发育和功能一种重要的蛋白质,在学习和记忆中起重要的调节作用,对于神经元细胞存活、分化、生长、发育起重要作用,此外BDNF还可以保护缺血性和氧化性神经元细胞,抑制细胞凋亡,帮助轴突生长并调节突触可塑性的作用。RAS-RAF-ERK信号传导通路是丝裂原活化蛋白激酶家族（Mitogen Activated Protein Kinases,MAPKs）中最重要的一环,它在神经前体细胞的产生、神经脊的形成和发育、突触信号传递以及意识、学习和记忆能力的形成都起着重要作用。维生素D（Vitamin D,Vit D）是一种脂溶性维生素,最重要的功能是调节骨平衡,另外维生素D涉及很多非骨骼疾病,包括心血管疾病,癌症,自身免疫性疾病和糖尿病等[3]。大量研究表明,血清维生素D与机体免疫炎性反应、氧化应激、损伤修复等多种病理生理过程密切相关,是机体免疫调节的重要指标,特别是在肥胖和慢性炎症发生中有重要作用[4,5]。Bivona G研究结果表明,Vit D有助于大脑发育和活动,帮助神经回路连接,影响运动、情绪和认知行为,另外还发现在阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、自闭症谱系障碍、睡眠障碍和精神分裂症影响的患者中,VitD血清水平较低[6]。目的前人的报道表明OSAHS儿童普遍存在维生素D缺乏和不足的情况,但尚未有关于补充维生素D能否改善OSAHS儿童临床症状、血清指标以及认知行为异常,维生素D保护低氧致神经元损伤的相关机制,维生素D改善OSAHS患者学习记忆功能的相关机制的报道。本研究创新性的通过研究OSAHS儿童临床症状、血清指标以及认知行为异常与血清维生素D水平之间的关系,同时通过细胞实验研究维生素D对低氧神经元细胞的干预作用,以及应用维生素D干预OSAHS动物模型研究其对海马组织的影响。旨在揭示维生素D对OSAHS儿童认知行为异常的预防和治疗作用,为临床防治提供更直接的实验依据。方法1本实验选用经日照市人民医院耳鼻咽喉科确诊的OSAHS儿童作为OSAHS组,选用日照市人民医院健康查体的健康儿童作为Control组。统计Control组年龄、性别、Conners父母量表评分,清晨空腹时抽取外周静脉血,检测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清25-OHD水平。OSAHS组记录年龄、性别、身高、体重、Conners父母量表评分,夜间进行睡眠监测,次日清晨空腹时抽取外周静脉血,检测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清25-OHD水平。再对OSAHS组进行罗盖全干预治疗4周,再次收集Conners父母量表评分,以及进行睡眠监测,次日清晨空腹再次检测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清25-OHD水平。2①利用低氧诱导的大鼠神经元细胞损伤,分别在低氧Oh、6h、12h、24h监测氧化应激反应关键因子DUOX1、ROS、HIF-1等表达情况,确定低氧的最佳干预时间。利用不同浓度的维生素D干预低氧大鼠原代神经元细胞,监测VDR、DUOX1、ROS水平,确定维生素D干预低氧诱导神经元细胞损伤的最佳浓度。②将大鼠原代神经元细胞作为实验细胞来源,通过细胞转染构建过表达/抑制表达DUOX1神经元模型,利用低氧和维生素D进行干预正常神经元细胞、过表达/抑制表达DUOX1神经元细胞。生化检测各组神经元细胞的MDA、SOD水平,利用Rt-PCR和Western Blot检测各组神经元细胞的DUOX1的mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测各组神经元细胞的ROS水平和细胞的凋亡比率。3选取大小、体质量相似雄性SD大鼠64只,随机分为Control组、Control+Vit D组、OSAHS组和OSAHS+Vit D组。利用慢性间歇性低氧（低氧停留55 s,常氧45 s。低氧时氧气浓度为5%）制造OSAHS模型。Control+Vit D组大鼠和OSAHS+Vit D组大鼠在进行建模的第1天通过维生素D灌胃干预,剂量为0.1μg/kg,饲养7周。利用ELISA试剂盒检测血清中1,25（OH）2D3水平。利用水迷宫实验检测各组大鼠的学习和记忆能力。通过电子显微镜观察海马体损伤情况。通过Western Blot检测海马体中维生素D受体（Vitamin D receptor,VDR）蛋白、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）以及RAS-RAF-ERK通路相关蛋白水平。结果1①OSAHS组儿童甘油三酯明显高于Control组,而高密度脂蛋白、血清25-OHD水平明显低于Control组,差别均具有统计学意义（P<0.05）。OSAHS组Conners父母量表中冲动-多动、多动指数、焦虑、品行问题、身心障碍、学习问题评分高于Control组,差别有统计学意义（P<0.05）。②OSAHS组儿童维生素D治疗前后比较,甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、AHI、LSAO2均无明显差别,无统计学意义（P>0.05）。OSAHS组儿童经维生素D治疗后血清25-OHD水平上升,Conners父母量表比较多动指数、品行问题、学习问题评分下降,差别有统计学意义（P<0.05）。2①低氧培养神经元细胞DUOX1、ROS、HIF-1的表达显着增加,呈现时间依赖性,低氧最佳干预时间是24h;维生素D干预低氧神经元细胞,细胞DUOX1、ROS水平降低,细胞凋亡比率下降,呈现剂量依赖性,维生素D最佳干预浓度是100nm。②低氧培养神经元细胞,与正常氧培养神经元细胞比较发现MAD水平、ROS水平和神经元细胞凋亡百分率上升,SOD水平下降;而维生素D干预低氧神经元细胞后,发现MAD水平、ROS水平和神经元细胞凋亡百分率下降,SOD水平上升。低氧培养抑制表达DUOX1的神经元细胞,与低氧培养神经元细胞比较发现MAD水平、ROS水平和神经元细胞凋亡百分率下降,SOD水平上升。过度表达DUOX1的神经元细胞,与正常神经元细胞比较发现MAD水平、ROS水平和神经元细胞凋亡百分率上升,SOD水平下降;而维生素D干预过度表达DUOX1的神经元细胞后,发现MAD水平、ROS水平和神经元细胞凋亡百分率下降,SOD水平上升。3①OSAHS组血清 1,25（OH）2D3水平显着低于Control组（P<0.05）。②Control组和Control+VitD组水迷宫实验比较发现,VitD并没有增强大鼠学习和记忆能力的作用;OSAHS组与Control组以及OSAHS+VitD组比较发现,OSAHS大鼠学习和记忆能力明显受损,而VitD的干预可明显改善OSAHS大鼠的学习和记忆能力。③Control组大鼠海马组织中神经元细胞膜和核膜清晰光滑,细胞质和染色质分布均匀;Control+VitD组大鼠海马组织中神经元细胞与Control组类似,无明显区别;OSAHS组神经元外周出现空隙,细胞膜不完整,染色质溶解,细胞质不均匀;OSAHS+VitD组可分辨出细胞核,细胞膜不清晰,细胞质和染色质分布基本均匀。④Control组和Control+VitD组比较,应用VitD干预正常大鼠,并不会引起VDR过度的表达,而且VitD也不会通过其他途径使BDNF表达增高;OSAHS组和OSAHS+VitD组比较,OSAHS组大鼠VDR、BDNF表达不足,而VitD干预后VDR和BDNF表达均上调。⑤Control组和Control+VitD组比较,应用VitD干预正常大鼠,并不会激活RAS-RAF-ERK通路;OSAHS组和OSAHS+VitD组比较,OSAHS组大鼠RAS-RAF-ERK信号通路被抑制,而VitD干预后RAS-RAF-ERK信号通路被激活。结论维生素D通过调节氧化应激关键因子DUOX1、调控BDNF-ERK通路缓解OSAHS海马体神经元损伤,改善OSAHS的学习认知功能。
陈野[4]（2021）在《H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用》文中指出背景中风是目前最常见的死亡原因之一,也是在全世界范围内持续性和获得性残疾的主要原因,随着人口变化,发病率进一步增加,对人们生活的质量带来巨大负担。中风分为出血性中风和缺血性中风,后者更常见,当前治疗的重点是通过静脉溶栓和血管内血栓切除术进行快速再灌注,但再灌注的同时也会损害大脑组织,因此对中风可用的治疗方法极为有限,研究预防策略正朝着卒中管理的前沿发展,一些新的进展为神经保护带来了新的希望。Ras同源家族成员A（Rho A）,是一种分布广泛的胞质蛋白,属于小GTP酶家族,鸟苷三磷酸水解酶（Rho GTPases）构成了相当普遍表达的胞质分子开关,控制了一系列下游效应子的活性,Rho依赖性卷曲螺旋激酶（ROCK）是Rho A最直接、最主要的效应分子,有ROCK1和ROCK2两种亚型。缺血性脑损伤可诱导Rho A激活和ROCK2表达的显着上调,越来越多的证据表明,Rho A/ROCK通路参与了中枢神经系统一些疾病的病理过程。Rho A的磷酸化是导致其功能发生改变和调节其活性的主要方式之一,Rho A在Ser188位点磷酸化能够抑制Rho A激活。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是一种普遍存在的第二信使分子,起神经调节剂的作用,在许多哺乳动物器官和系统中均具有重要功能,参与大脑的生理和病理机制。内源性H2S合成的酶主要包含胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚-β-合酶（L-cystathionine-?-synthetase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。我们前期研究证明了H2S可促进大鼠脑血管平滑肌细胞中KCa通道的开放,CSE产生的H2S对小鼠脑缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤具有保护作用,但其作用的分子机制尚不明确。前期研究者报道脑内皮/神经血管单位（Neurovascular unit,NVU）存在重要作用,脑血管的自动调节对于保护神经细胞免受缺血性损伤非常重要,缺血性脑组织的重塑涉及神经元和微血管细胞之间的相互作用,对神经血管单位缺血性死亡过程涉及的机制有待深入的了解。基于以上的研究背景,我们做了以下几个方面研究:1.构建并表达Glutathione S-transferase（GST）标签的Rho A野生型(GST-Rho Awild)和Rho A Ser188位点突变型(GST-Rho AS188A)蛋白,观察外源性H2S（Sodium hydrosulfide,Na HS）对其体外磷酸化的影响。2.探讨H2S抑制Rho A/ROCK通路的靶点和机制,并研究H2S促进Rho A Ser188磷酸化对海马神经元缺氧复氧（Hypoxia-Reoxygenation,H/R）损伤和大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。目的1.观察H2S对Rho A的Ser188位点磷酸化的调节;2.探讨H2S对海马神经元Rho A Ser188位点的作用及其潜在的H/R损伤保护机制;3.探讨Rho A Ser188位点在H2S对大鼠缺血性脑损伤保护的影响。方法1.构建Rho Awild-p GEX-6p-1和Rho A S188A-p GEX-6p-1重组原核质粒,诱导表达并纯化GST-Rho Awild和GST-Rho AS188A蛋白,在进行体外磷酸化测定。2.构建Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1重组真核质粒,再进行大鼠原代海马神经细胞（Hippocampal nerve cells,HNCs）培养与鉴定,并将重组质粒通过电转染到HNCs中,给与不同浓度的外源性H2S（Na HS）后western blot测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,酶联免疫实验（ELISA）法测定Rho A和ROCK2活性。3.全细胞膜片钳记录Na HS对转染重组质粒后的神经细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）电流的影响。4.建立H/R损伤模型,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测转染重组质粒后的神经细胞活力变化,乳酸脱氢酶（LDH）,神经特异性烯醇化酶（NSE）释放变化评估其损伤。5.原代大鼠脑血管内皮细胞（ECs）培养与鉴定,CSE-/-小鼠和3-MST-/-大鼠的原代内皮细胞与神经细胞共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达水平,测定Rho A和ROCK2活性,同时测定两种内皮细胞释放的H2S含量。6.分别将Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒转染到HNCs,与CSE-/-ECs进行共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,并进行H/R损伤造模。测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及细胞活力、培养上清LDH和NSE的变化。7.Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察神经细胞核损伤情况,Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测凋亡细胞。8.Ca2+成像系统荧光显微镜（Olympus IX73）检测神经细胞内Ca2+含量并获得细胞内Ca2+信号的荧光图像。9.脑立体定位转染Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒到大鼠海马区域,通过western blot检测Rho Awild和Rho AS188A蛋白表达,冰冻切片在荧光显微镜下观察转染效果。10.双侧颈总动脉结扎2VO对转染成功的大鼠建立脑I/R模型,激光散斑成像技术（Laser speckle imaging,LSI）检测血流变化,观察造模成功与否。缺血2h再灌注24h后,采用苏木素-伊红（HE）染色观察海马区域损伤程度,TUNEL检测海马神经细胞凋亡情况,western blot检测海马组织Rho A Ser188磷酸化蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及血清LDH,NSE的变化。结果1.放射自显影结果显示,在PKG1存在下,H2S供体Na HS（100μmol/L）显着促进了GST-Rho Awild蛋白的磷酸化,但是GST-Rho AS188A蛋白并没有发生磷酸化。这表明Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.H2S（Na HS和内皮源性CSE产生）可促进空质粒或GFP-Rho Awild或GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中Rho A的磷酸化,以及GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中GFP-Rho Awild的磷酸化。与对照组相比,p-Rho A/Rho A比值或p-GFP-Rho Awild/GFP-Rho Awild比值明显增加。但对GFP-Rho AS188A的磷酸化没有影响,GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中的p-GFP-Rho AS188A/GFP-Rho AS188A比值与对照组相比没有明显变化。这些结果表明,H2S可以诱导大鼠海马神经元中的Rho A磷酸化,并且这种磷酸化由Rho A Ser188介导。3.H2S能够使Rho A和GFP-Rho Awild在细胞膜中的含量显着减少,在胞质中的表达增高,但对GFP-Rho AS188A在细胞膜和细胞质中的分布没有明显影响。这些结果表明,Ser188是H2S引起神经元中Rho A从细胞膜向细胞质内易位的必需条件,同时可以通过Ser188抑制Rho A活性。4.Na HS对转染GFP-Rho AS188A质粒的神经细胞BKCa通道电流的增加低于转染空质粒和GFP-Rho Awild质粒组且具有显着性差异（30 m V-70 m V）这些结果表明,Na HS对BKCa通道电流的增加受到Rho A Ser188的调控。5.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马神经元中,H2S可显着抑制ROCK2蛋白的表达及其活性,但在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,抑制作用减弱,表明Rho A Ser188与H2S抑制神经元中ROCK2蛋白表达及其活性有关。6.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中,H2S显着抑制细胞活力的降低以及LDH和NSE活性的增加。然而,在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,H2S的这些作用显着降低。这些结果表明,Rho A Ser188介导了H2S对神经细胞H/R损伤的保护作用。7.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒或GFP-Rho AS188A质粒转染的CSE-/-EC共培养神经元中,H/R损伤诱导神经细胞凋亡和细胞内游离Ca2+荧光强度显着增加。在空质粒或GFP-Rho Awild质粒共培养的神经元中,CSE+/+EC可以明显降低H/R损伤诱导神经细胞凋亡的增加和细胞内游离Ca2+荧光强度,但对转染GFP-Rho AS188A质粒共培养的神经元没有影响。这些结果表明,内皮CSE产生的H2S可以通过抑制细胞内游离Ca2+的增加来保护神经元免受H/R损伤,并且该作用是由Rho A Ser188介导的。8.动物体内实验中,在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马中,Na HS能够促进Rho A的磷酸化,抑制Rho A活性,同时降低ROCK2的表达和活性,减轻大鼠脑I/R损伤诱导的血清LDH和NSE的增高,以及海马组织中神经细胞损伤和凋亡。但对转染GFP-Rho AS188A质粒的海马组织中这些作用显着降低。这些结果表明,Na HS减轻大鼠脑I/R损伤且与Rho A Ser188有关。结论1.Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.Na HS可能通过Rho A Ser188增加大鼠海马神经细胞中BKCa通道电流。3.内外源性H2S通过促进大鼠海马神经细胞Rho A Ser188磷酸化来保护海马神经元免受H/R损伤。4.Rho A Ser188介导了H2S对大鼠脑I/R损伤的保护作用。
李世鹏[5]（2019）在《天麻素调控小胶质细胞抗大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究》文中研究说明[研究背景]脑卒中在全球范围内是仅次于缺血性心脏病的第二大致死原因。随着中国经济发展和生活方式的改变,脑卒中已成为我国国民的第一致死疾病,其中缺血性脑卒中占到了卒中总数的69.6%-77.8%,给社会和家庭带来严重损失和沉重经济负担。急性脑卒中主要治疗方式还是早期rt-PA溶栓或机械取栓使得血管再开通。但受制于3-4.5 h较短的时间窗,和血管再通后缺血再灌注损伤带来的脑水肿、颅内出血和出血转化等并发症,其治疗效率有待进一步提升。寻找合适的神经保护剂治疗脑缺血再灌注损伤配合早期的血管开通是近年来的治疗急性缺血性脑卒中的研究热点之一。脑缺血再灌注损伤主要发病机制包括能量耗竭、炎性反应、氧自由基损伤、钙离子超载、一氧化氮和一氧化氮合酶的作用、兴奋性氨基酸毒性以及血脑屏障破坏及细胞坏死调亡等。其中,血脑屏障破坏和炎性反应在缺血再灌注病理过程中起到关键作用。小胶质细胞作为神经血管单元的组成细胞,在维持血脑屏障结构完整和功能维持以及神经炎症的启动和调控方面都起到了重要作用。天麻素是传统中药天麻的主要有效单体成分之一,目前在临床应用广泛,可通过抗氧化应激、抗神经炎性反应、调节神经递质、调节神经重构、抗凋亡抗自噬等多途径在多种神经系统疾病中发挥神经保护作用。目前关于天麻素在缺血再灌注损伤中对血脑屏障的保护和对小胶质细胞缺血再灌注损伤导致的神经炎症的调控机制现在尚未有深入研究。因此,本研究通过构建体内外缺血再灌注模型,研究天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为、梗死体积的保护作用,评估天麻素对血脑屏障及相关蛋白的影响,从细胞层面探讨天麻素对小胶质细胞在缺血再灌注损伤导致的神经炎症的调控和机制。为缺血性脑卒中的治疗提供一个新的可能治疗靶点和治疗思路。第一部分天麻素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[目 的]本实验部分建立SD大鼠缺血再灌注体内实验模型和BV-2小胶质细胞OGD/R体外模型,通过天麻素预处理,观察天麻素对缺血再灌注损伤大鼠的神经行为、梗死体积、脑含水量的作用,评估天麻素对血脑屏障影响,研究天麻素在体内外小胶质细胞中对血脑屏障损伤相关蛋白的调控。[方 法]通过线栓法制作SD大鼠MCAO模型来建立缺血再灌注体内实验部分动物模型;通过BV-2小胶质细胞氧糖剥夺再灌注在体外模拟细胞缺血再灌注损伤过程。使用各剂量天麻素（体内50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg,体外20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）预处理,并同阳性对照尼莫地平（NIM）及阴性对照组比较。使用Garcia JH评分评估各组神经行为学变化;使用TTC染色测量脑组织梗死体积,通过测量脑组织EB渗漏量和脑组织含水量以及HE染色检测反映血脑屏障通透性的变化,通过Western blot和免疫荧光染色检测各组大鼠脑组织和小胶质细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP2）和基质金属蛋白酶-9（MMP9）,以及水通道蛋白-4（AQP4）和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的变化。[结 果]1.不同浓度GAS和NIM预处理的MCAO大鼠神经功能评分较MCAO组明显改善（P<0.001）。各治疗组中GAS 100mg/kg组评分最高。2.同MCAO组相比,GAS 100 mg/kg组和GAS 200 mg/kg组脑组织梗死体积明显减少（P<0.001）。3.MCAO组EB的渗漏明显增加,天麻素各治疗组和NIM组的EB渗漏量较MCAO组明显减少（P<0.01,P<0.001）。其中GAS 100 mg/kg组减少趋势最明显。4.MCAO组脑组织含水量明显升高,GAS 100 mg/kg能明显降低IRI脑组织含水量（P<0.01）。5.Western blot结果显示MCAO组IRI72 h后MMP2和MMP9、AQP4的表达显着增加（P<0.01）,而ZO-1的表达减少（P<0.01）,同时在 GAS 治疗（100mg/kg）组和 NIM 治疗（4mg/kg）组中 MMP2和MMP9、AQP4的表达较MCAO组显着减少（P<0.01）,而ZO-1的表达增加。免疫荧光显示在脑组织小胶质细胞中也有类似的趋势。6.Western blot显示BV-2细胞OGD/R各时间点中3 h和6 h时间点各蛋白变化程度最明显,GAS 40μmol/L、80 μmol/L在3 h时均能抑制MMP2和MMP9、AQP4在OGD/R后升高趋势,同时能增加ZO-1的表达。[结 论]1.SD大鼠脑缺血后再灌注72h时间点仍存在神经功能缺损,血脑屏障通透性增加和脑含水量增加。2.天麻素预处理能明显改善MCAO大鼠再灌注72 h时的神经功能,减少脑梗死体积和血脑屏障通透性。3.天麻素100mg/kg在大鼠体内和40 μmol/L在体外能抑制小胶质细胞MMP2,MMP9和AQP4,增加ZO-1表达从而发挥其在MCAO和OGD/R模型中对缺血再灌注损伤的保护作用。第二部分天麻素对缺血再灌注损伤后小胶质细胞中SOX4的调控[目 的]本实验部分通过构建缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,使用Western blot及免疫荧光观察检测缺血再灌注损伤后体内体外小胶质细胞中SOX4蛋白变化。同时通过天麻素干预缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,探讨研究天麻素对小胶质细胞中SOX4表达的影响。并用天麻素干预SOX4过表达的BV-2细胞,检测SOX4过表达BV-2细胞中MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1表达的变化,研究天麻素对缺血再灌注损伤的保护机制。[方 法]通过线栓法制作SD大鼠建立脑缺血再灌注动物模型;提取和纯化大鼠原代小胶质细胞并培养传代;通过BV-2小胶质细胞和原代小胶质细胞OGD/R在体外模拟缺血再灌注损伤过程。将实验动物和细胞分为对照组,模型组和天麻素干预组,体外部分分别使用GAS50mg/kg、GAS 100mg/kg、GAS200 mg/kg,体内部分分别使用 GAS 20 μmol/L、GAS 40 μmol/L、GAS 80 μmol/L 对实验模型将进行预处理。通过Western blot和免疫荧光染色检测各组大鼠脑组织和两种小胶质细胞株中SOX4的基础表达,和在MCAO、OGD/R刺激后以及GAS干预后SOX4的表达变化。构建SOX4过表达和空载的质粒,用慢病毒载体系统包装带有GFP荧光标记的SOX4过表达质粒和对照空载质粒,建立SOX4慢病毒稳定感染BV-2细胞系和对照空载病毒稳定感染BV-2细胞系。天麻素干预转染细胞系OGD/R模型,Western blot和免疫荧光染色检测SOX4,MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1表达的变化。[结 果]1.SOX4蛋白在BV-2永生小胶质细胞株和新生SD大鼠原代小胶质细胞中有基础表达,在SD大鼠胼胝体区小胶质细胞中也有少量表达。2.Western blot结果显示MCAO组IRI72 h后脑组织SOX4的表达增加（P<0.01）;同时GAS 100 mg/kg和GAS 200 mg/kg治疗可抑制SOX4增加的趋势,以100 mg/kg组明显。免疫荧光显示在脑组织小胶质细胞中也有类似的趋势。3.Western blot显示BV-2细胞和原代小胶质细胞中OGD/R后各时间点中3h时间点SOX4升高程度最明显,GAS 40 μmol/L能抑制OGD/R后3 h时SOX4升高趋势。4.GAS 40 μmol/L预处理能减少OGD/R BV-2小胶质细胞中SOX4、MMP2和MMP9、AQP4表达并且增加ZO-1的表达。在SOX4过表达细胞系中,GAS 40μmol/L预处理不能减少MMP2、MMP9、AQP4和增加ZO-1的表达。[结论]1.SOX4蛋白在BV-2永生小胶质细胞株和新生SD大鼠原代小胶质细胞中有基础表达,在SD大鼠胼胝体区小胶质细胞中也有少量表达。2.OGD/R以及MCAO能明显增加SOX4在体内外小胶质细胞中的表达,天麻素预处理能抑制SOX4增高的趋势。3.SOX4过表达能逆转GAS对OGD/R小胶质细胞中MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1的影响,提示GAS可通过SOX4调控MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1进而发挥神经保护作用。
李丽丽[6]（2019）在《生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护作用中Plpprs家族蛋白的作用及对线粒体功能的调节机制》文中研究指明第一部分青霉素致反复惊厥模型远期可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白表达变化和相互作用目的:探讨青霉素致反复惊厥模型远期发育、神经行为、认知和海马形态损伤与海马和大脑皮层可塑性相关蛋白家族Plpprs、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达变化和相互作用。方法:200只雄性SD（日龄21天,P21）大鼠随机分成2组:Control组（n=80/每组）,建模组（n=120/每组）。建模组建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型:每只大鼠500万单位/kg剂量腹腔注射青霉素,隔日注射一次,共注射6次建模完成（P21-31）。根据入选标准获得RS组80只（n=80/每组）。Control组在与RS组处理相同时间腹腔注射相同剂量的生理盐水。隔日监测大鼠体重。分别在建模7天,14天,21天,28天后,监测神经反射发育,神经行为,学习记忆指标变化:Neo-Timm’s染色观察海马苔藓纤维发芽和杏仁核Timm着色;尼氏染色观察海马和杏仁核神经元细胞数量和形态;Real-Time RT-PCR检测海马可塑性相关蛋白家族Plpprs,线粒体功能相关蛋白的mRNA表达,同时还检测了锌离子通道蛋白ZnTs mRNA表达并分析可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白白的mRNA表达的相关性;Western-Blot 检测海马和大脑皮层可塑性相关蛋 白家族 Plpprs 和线粒体功能相关蛋白的表达。结果:（1）体重:建模当天各时间点Control组与RS组体重均没有统计学差异,在建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型后7天（P38,n=20/每组）,14天（P45,n=20/每组）,21天（P52,n=20/每组）,RS组在第二次注射青霉素时体重开始显着低于Control组（P<0.05）;28天（P59,n=20/每组）时间点的RS组在第三次注射青霉素时体重开始显着低于Control组（P<0.05）;当RS组开始出现这种低体重状态均会一直持续到取脑组织当天;在建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型后7天,14天,28天,三个时间点的RS组的日均体重增长率均显着低于Control组（P<0.05）,末次青霉素注射后21天时间点的RS组的日均体重增长率低于Control组,但是没有统计学意义;（2）神经发育:在前肢悬吊试验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点前肢悬吊反射时间均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在负向趋地试验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点负向趋地反射时间均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在悬崖回避试验中,RS组在7天,21天,28天三个时间点悬崖回避反射时间均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS组在14天时间点悬崖回避反射时间高于Control组,但是差异没有统计学意义。在平面翻正试验中,RS组在天时间点平面翻正反射时间显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,其余三个时间点的差异没有统计学意义;（3）神经行为:在旷场实验中,RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点水平穿越格子数均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS组在7天,21天,28天三个时间点修饰胡须的次数均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS组在14天时间点修饰胡须的次数高于Control组,但是差异没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点双后肢着地站立的次数均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）学习记忆:在新异物识别实验中,RS组在14天21,21天,28天三个时间点认知指数均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天时间点认知指数低于Control组,但是差异没有统计学意义;（5）Neo-Timm’s 染色:①海马区:RS组在21天,28天两个时间点CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和14天两个时间点CA3和DG区着色的Timm颗粒与Control组差异没有统计学意义;②杏仁核:通过对Neo-Timm’s染色中杏仁核区分析可见,RS组在21天,28天两个时间点杏仁核区着色光密度显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和14天两个时间点杏仁核区着色光密度与Control组差异没有统计学意义;（6）尼氏染色:RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点海马CA1区,CA3区及杏仁核区神经元数量显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;（7）Real-Time RT-PCR:①可塑性相关蛋白家族Plpprs基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在其他时间点Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组没有统计学意义。RS组7天,14天,21天,28天四个时间点Plpprl和Plppr2 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;②锌离子通道蛋白ZnTs基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点ZnTl mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在14天时间点ZnT1 mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义;RS组在7天,21天两个时间点ZnT1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异。RS组在21天,28天两个时间点ZnT3 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天,14天两个时间点ZnT3 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点ZnT6和ZnT7 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异:③线粒体功能相关基因:青霉素处理使SD大鼠在28天时间点Bnip3L和BAD mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;在7天,14天,21天三个时间点RS组Bnip3L和BAD mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。在14天和28天时间点RS组低氧诱导因子HIF-1α和mTOR mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和21天两个时间点低氧诱导因子HIF-1α和mTOR mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点HDAC1,FOUNDC1和PARKIN mRNA表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS组在21天和28天时间点sesn2 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和14天两个时间点Sesn2 mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天,28天四个时间点Bnip3,UCP2,P53,NF-κB,DRP1,E21F,Endog 和 Pink1 mRNA 表达与 Control 组相比并没有统计学上的差异;（8）相关性分析:将海马可塑性相关家族蛋白Plpprs和线粒体功能相关蛋白mRNA表达进行相关性分析,发现可塑性相关家族蛋白P1ppr1与P53,SENSN2和PARKIN mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<0.05）,与E21F mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr2与UCP2 mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr3与E21F mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<a05）,与Bnip3L,mTOR,HDAC1,BAD和FUNDC1 mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr4与Bnip3L mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关家族蛋白P1ppr5与PINK1 mRNA表达呈显着性负相关,且具有统计学意义（P<0.05）,与Bnip3L和HIF1αα mRNA表达呈显着性正相关,且具有统计学意义（P<0.05）;以上结果显示可塑性相关家族蛋白和线粒体功能相关多个分子有相关性关系,在这些有相关性的分子mRNA表达中,P1ppr5和HIF1α mRNA表达相关性最高,相关系数达到0.8586,P<0.0001;（9）Western Blot:①可塑性相关蛋白Plpprs:在海马组织中,RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点海马可塑性相关蛋白P1ppr1,P1ppr4和P1ppr5蛋白表达均较Contro1组显着升高,差异具有统计学意义（P<a05）。皮层,P1ppr1:RS组在14天时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在21天和28天两个时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天时间点大脑皮层P1ppr1蛋白表达较Contro1组无统计学上的差异。P1ppr4:RS组在7天和14天两个时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr4蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在28天时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr4蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;P1ppr5:RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点大脑皮层可塑性相关蛋白P1ppr5蛋白表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;②线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点海马低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天,14天和28天三个时间点大脑皮层低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在21天时间点大脑皮层低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。PGC-1α:RS组在7天,21天和28天三个时间点海马转录共激活因子PGC-天时间点海马转录共激活因子PGC-1α蛋白表达较Control组降低,但是并没有统计学意义。RS组在7天,14天,21天和28天四个时间点大脑皮层转录共激活因子PGC-1α蛋白表达均较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。Sirt3:RS组在14天和28天时间点海马Sirt3蛋白表达较Control组降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天和21天时间点海马Sirt3蛋白表达较Control组没有统计学上的差异。RS组在7天,14天和28天三个时间点大脑皮层Sirt3蛋白表达均较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在21天时间点大脑皮层Sirt3蛋白表达较Con1α蛋白表达均较Contro1组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在14 trol组降低,但是并没有统计学意义。Prohibitin:RS组在14天,21天和28天三个时间点海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组在7天时间点海马线粒体标记蛋白白 Prohibitin表达较Control组无统计学上的差异。RS组在7天,14天,21天和28天三个时间点大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达均较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:青霉素反复惊厥所致远期发育、神经行为、认知和海马形态损伤可能与海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子分子表达变化和相互作用有关。第二部分 生酮饮食干预远期前脑可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达目的:探讨海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达在生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护中的作用。方法:100只SD（日龄21天,P21）大鼠随机分成2组:对照组（n=40/每组）和建模组（n=60/每组）,建模组建立青霉素致发育期反复惊厥性脑损伤模型:每只大鼠500万单位/kg腹腔注射青霉素,隔日注射一次,共计注射6次建模完成（P21-31）。根据入选标准获得成功建模组40只（n=40/每组）。对照组在与建模组处理相同时间腹腔注射相同剂量的生理盐水。在建模完成后进一步将对照组随机分为Control组（n=20/每组）和KD组（n=20/每组）,成功建模组随机分为RS组（n=20/每组）,RS+KD组（n=20/每组）。建模完成后一日开始（P32）,KD组和RS+KD组给予生酮饮食干预28天（P32-P59）,Control组和RS组继续食用普通颗粒饲料,所有大鼠均不限制饮水,隔日监测大鼠体重。监测神经反射发育,神经行为,学习记忆指标变化;Neo-Timm’s染色观察海马苔藓纤维发芽和杏仁核Timm着色;尼氏染色观察海马和杏仁核神经元细胞数量和形态;高尔基染色观察神经元轴突长度,分级及棘突数量;Real-Time RT-PCR检测海马可塑性相关蛋白家族Plpprs,线粒体功能相关蛋白的mRNA表达,同时还检测了锌离子通道蛋白ZnTs mRNA表达;Western-Blot检测海马和大脑皮层可塑性相关蛋白家族Plpprs和线粒体功能相关蛋白的表达;EMSA检测海马和大脑皮层HIF-1α的转录活性。结果:（1）体重:四组体重在实验过程中总体差异具有统计学意义。在P21-P23四组体重均没有统计学差异,从P25开始四组体重开始出现差异,RS组和RS+KD组体重开始显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,这种差异持续到处死当天（P59）,KD组体重从P35开始显着低于Control组,差异具有统计学意义,这种差异持续到P59,RS+KD组体重从P39开始显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,这种差异持续到P59。在四组日均体重增长率的比较中,KD组,RS组和RS+KD组日均体重增长率均显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<05）,KD组和RS+KD组均显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）神经发育:在建立发育期反复惊厥模型28天后,在前肢悬吊试验中,RS组前肢悬吊反射时间显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组前肢悬吊反射时间显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组无显着差异,趋于正常。在负向趋地试验中,RS组负向趋地反射时间显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组负向趋地反射时间显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组无显着差异,趋于正常。在悬崖回避试验中,RS组悬崖回避反射时间均显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组悬崖回避反射反射时间显着低于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组无显着差异,趋于正常。在平面翻正试验中,RS组平面翻正反射时间高于Control组,但差异并没有有统计学意义;（3）学习记忆:在新异物识别实验中,建立发育期反复惊厥模型28天后,RS组认知指数显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组认知指数显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）:与Control组无显着差异,趋于正常:（4）血糖,血酮水平:在建立发育期反复惊厥模型28天后,KD组和RS+KD组血糖水平显着低于Control组和RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS组与Control组血糖水平无显着差异。KD组和RS+KD组血酮水平显着高于Control组和RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）:RS组与Control组血酮水平无显着差异;（5）Neo-Timm’s 染色:通过对Neo-Timm’s染色中海马区分析可见,RS组CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显着高于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组CA3和DG区着色的Timm颗粒数量显着低于RS组,差异具有显着的统计学意义（P<0.05）,与Control组和KD组差异没有统计学意义,趋于正常。通过对Neo-Timm’s染色中杏仁核区分析可见,RS组和RS+KD组杏仁核Timm着色的光密度显着高于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组杏仁核Timm着色的光密度值显着低于RS组,差异具有显着的统计学意义（P<0.05）;（6）尼氏染色:在对海马区尼氏染色中RS组在海马CA1区,CA3区神经元数量显着低于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;RS+KD组在海马CA1区,CA3区神经元数量显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,与Control组差异没有统计学意义,趋于正常。在对杏仁核区尼氏染色中RS组在杏仁核区神经元数量显着低于Control组和KD组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且神经元结构紊乱,胞浆尼氏染色不均匀;RS+KD组在杏仁核区神经元数量显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,与Control组差异没有统计学意义,趋于正常;（7）高尔基染色:本论文使用高尔基染色及Sholl分析来分析大脑皮层神经元复杂性,结果发现KD组,RS组和RS+KD组神经元突起分支等级显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组神经元突起分支等级显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在对大脑皮层神经元突起长度的分析中我们发现,RS组神经元突起长度显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组神经元突起长度高于RS组,但是差异没有统计学意义。在对大脑皮层神经元树突上的棘突数量的分析中我们发现:RS组神经元棘突数量显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）,生酮饮食可以显着改善这种缺陷,使RS+KD组神经元棘突数量显着高于RS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,趋于正常;（8）Real-Time RT-PCR:①可塑性相关蛋白Plpprs基因:RS组Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组Plppr3,Plppr4,Plppr5 mRNA表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组可塑性相关蛋白Plppr1和Plppr2mRNA表达较Control组升高,但是并没有统计学意义。RS+KD组可塑性相关蛋白Plppr1mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;②锌离子通道蛋白ZnTs基因:RS组ZnT1 mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组ZnT1 mRNA表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组ZnT1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组ZnT3mRNA表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS组ZnT6和ZnT7 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;③线粒体功能相关基因:RS 组 Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR 和 ParkinmRNA表达均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR和ParkinmRNA表达均较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD 组 Bnip3L,HIF-1α,HDAC1,mTOR 和 ParkinmRNA 表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。RS组Bnip3,UCP2,P53,NF-κB,DRP1,E21F,Endog和Pink1 mRNA表达与Control组相比并没有统计学上的差异;（9）Western Blot:①Plppr1:在海马组织中,RS组海马Plppr1蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Plppr1蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Plppr1蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组大脑皮层Plppr1蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<O.05）;RS+KD组大脑皮层Plppr1蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层Plppr1蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常;②Plppr5:在海马组织中,KD组,RS组和RS+KD组海马Plppr5蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Plppr5蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在大脑皮层组织中,RS组和RS+KD组皮层Plppr5蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组皮层Plppr5蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;③线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:在海马组织中,KD组,RS组和RS+KD组海马HIF-1 α表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马HIF-1α蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在大脑皮层组织中,RS组HIF-1α蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层HIF-1α蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,RS+KD组大脑皮层HIF-1α蛋白表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常;PGC-1α:在海马组织中,RS组PGC-1α蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;KD组和RS+KD组海马PGC-1α蛋白表达较Control组和RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。在大脑皮层组织中,KD组,RS组和RS+KD组PGC-1α蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层PGC-1α蛋白表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;Sirt3:在海马组织中,RS组Sirt3蛋白表达较Control组和KD组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Sirt3蛋白表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Sirt3蛋白表达与Control组相比并没有统计学上的差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组RS+KD组大脑皮层Sirt3蛋白表达较Control组和KD组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层Sirt3蛋白表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;p-AMPK:在海马组织中,RS组海马AMPK蛋白磷酸化水平较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。RS+KD组海马AMPK蛋白磷酸化水平较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马AMPK蛋白磷酸化水平与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,KD组和RS组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层AMPK蛋白磷酸化水平与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常;Bnip3L:在海马组织中,RS组海马LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马LC3受体Bnip3L蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马Bnip3L蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,RS组大脑皮层LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层LC3受体Bnip3L蛋白表达较RS组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层Bnip3L蛋白表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常;Prohibitin:在海马组织中,KD组和RS组海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马线粒体标记蛋白Prohibitin表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组海马线粒体标记蛋白Prohibitiin表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。在大脑皮层组织中,KD组和RS组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达较RS组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;RS+KD组大脑皮层线粒体标记蛋白Prohibitin表达与Control组没有统计学显着性差异,趋于正常。（10）EMSA:KD组,RS组和RS+KD组海马和皮层HIF-1α的转录活性均较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论::生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤的神经保护作用可能通过调节海马和大脑皮层可塑性相关蛋白分子、线粒体功能相关蛋白分子和锌离子转运体分子表达实现。第三部分酮体在离体细胞模型中对谷氨酸毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了 Glutamate处理后AMPK磷酸化,差异具有的机制研究目的:探讨酮体在离体细胞模型中对谷氨酸毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用的机制方法:第一节采用小鼠海马神经元细胞株HT22,按照处理不同分为四组:Control组、β-HB组、Glutamate组和Glutamate+β-HB组。每组定义及处理如下:Control组:空白对照组,细胞不做处理;β-HB组:酮体β-HB（β-羟丁酸,无血清培养基配制,PH7.4）处理细胞 24h（5mmol/L）;Glutamate 组:谷氨酸处理细胞 24h（5mmol/L,无血清培养基配制,PH7.4）;Glutamate+β-HB组:谷氨酸（5mmol/L）和β-HB（5mmol/L）共同处理细胞24h。通过CCK8法测各组细胞存活率,酶标仪检测各组乳酸脱氢酶LDH释放和超氧化物歧化酶SOD活性,流式仪检测各组细胞线粒体膜电位,活性氧ROS和线粒体数量,激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体ROS,活性线粒体比例和线粒体自噬活性,Western-Blot检测低氧诱导因子HIF1α,可塑性相关蛋白Plppr5,pAMPK,线粒体自噬LC3受体Bnip3L,转录共激活因子PGC-1α,人类沉默信息调节因子2相关酶家族蛋白Sirt3和线粒体标记蛋白Prohibitin表达。第二节按照处理不同分为四组:shControl组、shPlppr5组、shControl+Glutamate组、shPlppr5+Glutamate组,各组定义及处理如下:shControl组:空载慢病毒侵染细胞72小时后更换为正常培养基继续培养24h;shPlppr5组:shPlppr5慢病毒侵染细胞72小时后更换为正常培养基继续培养24h;shControl+Glutamate组:空载慢病毒侵染细胞 72 小时后,谷氨酸（5mmol/L）处理 24h;shPlppr5+Glutamate 组:shPlppr5慢病毒侵染细胞72小时后,谷氨酸（5mmol/L）处理24h。通过CCK8法测各组细胞存活率,酶标仪检测各组LDH释放和SOD活性,流式仪检测各组细胞线粒体膜电位,ROS和线粒体数量,激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体ROS,活性线粒体比例和线粒体自噬水平,Western-Blot检测低氧诱导因子HIF1α,可塑性相关蛋白Plppr5,pAMPK,线粒体自噬受体Bnip3L,转录共激活因子PGC-1α,人类沉默信息调节因子2相关酶家族蛋白Sirt3和线粒体标记蛋白Prohibitin表达。结果:第一节（1）细胞生长:使用CCK8检测各组细胞存活率,发现Glutamate组细胞存活率显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显提高了 Glutamate处理后细胞的存活率,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）线粒体氧化应激指标:①使用LDH试剂盒检测各组细胞LDH释放量,发现Glutamate组细胞LDH释放量显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显抑制了 Glutamate处理后细胞LDH释放,差异具有统计学意义（P<0.05）:②使用SOD活性试剂盒检测各组细胞SOD活性,发现Glutamate组细胞SOD活性显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显提高了Glutamate处理后细胞的SOD活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;③使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光强度,发现Glutamate组细胞Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光时,我们发现Glutamate组细胞MitoSOX荧光密度显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的MitoSOX荧光密度,差异具有统计学意义（P<0.05）;（3）线粒体功能指标:①使用流式细胞仪检测各组细胞JC-1,发现Glutamate组线粒体膜电位显着低于 Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显升高了 Glutamate处理后细胞的膜电位,差异具有统计学意义（P<0.05）;②使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光强度,发现Glutamate组细胞活性线粒体比例显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后细胞活性线粒体比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光时,我们发现Glutamate组细胞Mitotraker Red荧光密度显着低于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显增加了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Red荧光密度,差异具有统计学意义（P<0.05）:（4）线粒体自噬:使用激光共聚焦显微镜检测Mtphagy Dye和Lyso Dye探针时,我们发现Glutamate组细胞线粒体自噬活性显着高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理明显降低了 Glutamate处理后细胞的线粒体自噬活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;（5）Western Blot:①Plppr5:Glutamate组可塑性相关蛋白Plppr5蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了Glutamate处理后可塑性相关蛋白Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;②线粒体功能相关蛋白:HIF1α:Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了Glutamate处理后低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;pAMPK:Glutamate组AMPK磷酸化水平较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了 Glutamate处理后AMPK磷酸化,差异具有统计学意义（P<0.05）;Bnip3L:Glutamate组线粒体LC3受体Bnip3L蛋白表达较Control组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着降低了Glutamate处理后线粒体LC3受体Bnip3L蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;PGC1α:Glutamate组转录共激活因子PGC-1α蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后转录共激活因子PGC-lα蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Sirt3:Glutamate组Sirt3蛋白表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后Sirt3蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Prohibitin:Glutamate组线粒体标记蛋白Prohibitin表达较Control组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;β-HB共处理显着增加了 Glutamate处理后线粒体标记蛋白Prohibitin表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;第二节（1）细胞生长:使用CCK8检测各组细胞存活率,发现shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞存活率均显着低于 ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）线粒体氧化应激指标:①使用LDH试剂盒检测各组细胞LDH释放量,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 LDH 释放量显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默使Glutamate处理后细胞LDH释放增加,但差异没有统计学意义;②使用SOD活性试剂盒检测各组细胞SOD活性,发现ShControl+Glutamate组和ShPlppr5+Glutamate组细胞SOD活性均显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默降低了 Glutamate处理后细胞的SOD活性,但差异不具有统计学意义;③使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光强度,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Green和MitoSOX荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和MitoSOX探针荧光时,我们发现shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞 MitoSOX 荧光密度显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的MitoSOX荧光密度,差异具有统计学意义;（3）线粒体功能指标:①使用流式细胞仪检测各组细胞JC-1,发现shPlppr5组,ShControl+Glutamate组和ShPlppr5+Glutamate组细胞线粒体膜电位显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显降低了 Glutamate处理后细胞的线粒体膜电位,差异具有统计学意义（P<0.05）;②使用流式细胞仪检测各组细胞Mitotraker Green探针和Mitotraker Red探针荧光强度,发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞Mitotraker Green和Mitotraker Red焚光双阳性细胞比例显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默显着降低了 Glutamate处理后细胞Mitotraker Green和Mitotraker Red荧光双阳性细胞比例,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用激光共聚焦显微镜检测Mitotraker Green探针和Mitotraker Red 探针荧光时,我们发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate组细胞Mitotraker Red荧光密度显着低于ShControl组,差异具有统计学意义（P<05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默降低了 Glutamate处理后细胞的Mitotraker Red荧光密度,但差异并没有统计学意义;（4）线粒体自噬:使用激光共聚焦显微镜检测Mtphagy Dye和Lyso Dye探针时,我们发现 shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组细胞线粒体自噬活性显着高ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）;可塑性相关蛋白Plppr5基因沉默明显增加了 Glutamate处理后细胞的线粒体自噬活性,差异具有统计学意义（P<0.05）;（5）Western Blot:①Plppr5:Plppr5 基因沉默显着降低了 HT22 细胞 Plppr5 蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;谷氨酸显着增加了 HT22细胞Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默后谷氨酸处理不能增加Plppr5蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;②线粒体功能相关蛋白:HIF-1α:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α表达显着高于ShControl组,差异具有统计学意义（P<0.05）,ShPlppr5+Glutamate组低氧诱导因子HIF-1α表达显着低于ShControl+Glutamate 组,差异具有统计学意义（P<0.05）;p-AMPK:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组 AMPK 磷酸化水平较 ShControl 组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,ShPlppr5+Glutamate组AMPK磷酸化水平较ShControl+Glutamate组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;BNIP3L:shPlppr5 组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组线粒体 LC3 受体 BNIP3L蛋白表达较ShControl组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;PGC-1α:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组转录共激活因子 PGC-1α 蛋白表达较ShControl组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;Sirt3:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组 Sirt3 蛋白表达较 ShControl 组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默显着降低了 Glutamate处理后Sirt3蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）;Prohibitin:shPlppr5组,ShControl+Glutamate 组和 ShPlppr5+Glutamate 组线粒体标记蛋白 Prohibitin 表达较ShControl组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;Plppr5基因沉默显着降低了 Glutamate处理后Prohibitin表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:在离体神经细胞兴奋毒性损伤模型中,Plppr5通过调节线粒体功能发挥酮体的神经保护作用。
吴志刚[7]（2019）在《基于蛋白质组学研究PGRMC1介导孕酮对Aβ25-35所致神经元损伤的保护作用机制》文中研究说明孕酮（progesterone,PROG）是体内一种经典的类固醇激素,不仅存在于生殖系统中,而且神经细胞也可以由胆固醇或其前体在相应酶的作用下自行原位合成,称为神经甾体（neurosteroid）。作为传统激素,孕酮主要控制内分泌调节和生殖功能,而作为神经甾体主要影响神经元和神经胶质细胞的生长发育、成熟衰老以及稳定突触等生理过程。大量研究证实,孕酮对不同类型的神经损伤,例如创伤性脑损伤、脊髓损伤、缺血性脑卒中、海马神经元兴奋性毒性损伤和神经退行性疾病等均具有神经保护作用。孕酮通过多种途径在中枢神经系统发挥神经保护作用,包括保护血脑屏障,减少脑水肿,减少炎症级联,减少细胞坏死和凋亡等。目前研究认为多种受体或相关蛋白参与了孕酮作用的发生,包括经典孕酮核受体（n PR）、孕酮受体膜组分1（progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1）、孕酮膜受体（m PR）、γ-氨基丁酸A型受体（GABAA）等,其中PGRMC1是人类发现的第一个潜在的孕酮膜受体。研究发现,PGRMC1与孕酮的神经保护作用存在密切关系。PGRMC1具有与细胞色素b5相同的关键结构域,可以与血红素结合并激活P450蛋白,从而在药物、激素和脂质代谢中具有重要作用。PGRMC1还可与纤溶酶原激活物抑制剂RNA结合蛋白-1（SERBP1）结合,介导抗凋亡作用。另外也有研究报道,PGRMC1还可以作为一种衔接蛋白,起到将m PRa转运到细胞表面的作用。然而PGRMC1介导孕酮神经保护作用的确切机制却未阐明。近年来蛋白质组学技术发展迅速,特别是基于高分辨率和高通量质谱技术的蛋白质组学研究被广泛用于鉴定和量化不同组织、细胞或细胞器的蛋白质组。这对于研究蛋白质生物功能、寻找疾病生物标志物以及发现药物靶标等都具有十分重要的意义。本研究利用RNA干扰技术靶向性沉默原代培养的大鼠皮层神经元PGRMC1蛋白,用Aβ活性片断Aβ25-35作用神经元建立阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）细胞模型,之后分析PGRMC1沉默对孕酮神经保护作用下神经元蛋白质组的影响,筛选与PGRMC1蛋白相关的孕酮神经保护作用的靶蛋白以及信号通路,进一步深入研究PGRMC1在孕酮神经保护中的作用和分子机制,以期为全面准确认识孕酮作为神经甾体的作用机制提供实验依据。第一部分PGRMC1在对孕酮对抗Aβ25-35所致神经元损伤中的作用目的:研究PGRMC1对孕酮神经保护作用的影响。方法:取新生SD大鼠皮层组织进行体外分离培养,以获得原代大鼠皮层神经元;构建PGRMC1 si RNA慢病毒并感染神经元,以Aβ25-35处理神经元建立AD细胞模型后,加入孕酮进行干预。应用Hoechst33258染色和CCK-8法研究孕酮对Aβ25-35神经毒性的影响。结果:1 PGRMC1 si RNA慢病毒的鉴定结果经过测序鉴定,证实针对3个不同靶序列设计的PGRMC1 si RNA慢病毒与原设计完全相符。2慢病毒感染条件的筛选结果以荧光显微镜下观察到的神经元绿色荧光强度确定神经元病毒感染情况。结果发现,神经元细胞感染慢病毒72小时后,各组神经元荧光强度达到峰值,随着感染时间的延长荧光逐渐变弱。当MOI=20时,慢病毒感染率可达81.3%,且神经元细胞状态良好。3 PGRMC1 si RNA慢病毒沉默效应检测结果通过Western blot检测,PGRMC1 si RNA慢病毒RNAi（61633）和RNAi（61634）能够降低神经元PGRMC1的表达。与空白对照组相比,RNAi（61634）能够降低67.7%的PGRMC1的表达,沉默效应最强。而阴性对照病毒不影响PGRMC1的表达。4 PGRMC1对孕酮对抗Aβ25-35诱导的神经元凋亡的影响经Hoechst33258染色实验证实,孕酮能够通过PGRMC1对抗Aβ25-35诱导的神经元凋亡。结果显示,25μM Aβ25-35作用48小时后,可使大量神经元发生凋亡,在经孕酮干预后,阴性对照病毒组神经元凋亡率均显着降低,其中1μM孕酮干预组神经元的凋亡率为38.0%,显着低于Aβ25-35处理组（60.5%,P<0.01）。而在PGRMC1 si RNA组,高中低3个不同浓度孕酮干预组的神经元细胞凋亡率与Aβ25-35处理组均无显着性差异。且1μM孕酮处理组神经元凋亡率在PGRMC1沉默前后存在显着差异。5 PGRMC1对孕酮对抗Aβ25-35导致的神经元存活率下降的影响通过CCK-8法检测证实,孕酮能够通过PGRMC1对抗Aβ25-35导致的神经元存活率下降。结果显示,25μM Aβ25-35作用48小时后,可使神经元存活率均显着下降,在经孕酮干预后,阴性对照病毒组神经元存活率均显着提高,其中1μM孕酮干预组神经元存活率为69.1%,显着高于Aβ25-35处理组（39.7%,P<0.01）。而PGRMC1 si RNA组仅在10μM孕酮能提高神经元存活率。且1μM和10μM孕酮处理组神经元存活率在PGRMC1沉默前后均存在显着差异。小结:1本部分实验成功构建了PGRMC1 si RNA慢病毒RNAi（61634）,该病毒能够靶向性沉默原代大鼠皮层神经元细胞的PGRMC1蛋白表达。2孕酮能够显着减轻Aβ25-35的神经毒性,而沉默神经元PGRMC1蛋白显着减弱孕酮的神经保护作用,即PGRMC1蛋白介导了孕酮的神经保护作用。第二部分PGRMC1对孕酮干预下Aβ25-35所致损伤神经元蛋白质组的影响目的:寻找与PGRMC1相关的孕酮神经保护作用靶蛋白以及信号通路。方法:采用TMT结合质谱技术定量分析沉默PGRMC1对孕酮神经保护作用下原代培养大鼠皮层神经元细胞蛋白质组的影响,并对实验两组神经元的差异蛋白进行生物信息学分析。结果:1质谱分析实验条件及典型肽段谱图信息在纳升级液相140分钟梯度时间内,质核比（Δm/z）始终保持在±0.02 Da范围内,质量数（ΔM）始终保持在±10 ppm范围内,精密度良好。母离子在高能碰撞池内与惰性气体发生碰撞,发生肽键断裂并碎裂为众多碎片离子。其中肽链C端碎片离子为y离子,N端碎片离子为b离子。2 神经元蛋白质的鉴定结果经纳升级液相色谱仪分离,Orbitrap Fusion质谱数据采集以及Proteome Discoverer 2.1软件搜库,本研究共鉴定出6881个蛋白,92751个肽段,其中有65123个属于特异性肽段。3 所鉴定到的总蛋白的主成分分析结果主成分分析结果表明,第一主成分（PC1）占总方差的58.2%,第二主成分（PC2）占总方差的26.7%,PGRMC1 si RNA组与si Scramble组在PC1轴方向上明显分离,两组之间存在显着差异。4 所鉴定到的总蛋白的生物信息学分析结果基因本体分析显示,所鉴定到的蛋白主要富集于细胞器、细胞膜、胞外区域,另外还有相当一部分突触蛋白也被富集到。这些蛋白主要与细胞成分的组织或生物合成、代谢过程等生物学过程相关,且大部分具有结合性的分子功能,如能够与蛋白质、小分子物质等结合。5 PGRMC1 si RNA与si Scramble两组间差异表达蛋白的生物信息学分析结果以组间t检验P<0.05,且差异大于1.2倍为条件进行蛋白筛选,共筛选出差异表达蛋白1157个,其中有143个蛋白上调,1014个蛋白下调（PGRMC1 si RNA/si Scramble）。对这些差异表达蛋白进行基因本体分析,发现这些差异表达蛋白主要与生化调节、对刺激的反应、信号转导等生物学过程相关。这些得以显着富集的过程均与神经元细胞的信号通路密切相关。将差异蛋白进行KEGG通路分析,显着富集到24条信号转导通路,其中排名前20的信号转导通路包括轴突形成、谷氨酸能突触、γ-氨基丁酸能突触、长时程增强和Ras信号通路等。综合分析,Ras信号通路可能是PGRMC1介导孕酮神经保护作用的主要信号通路。6 蛋白相互作用的网络构建结果利用STRING数据库将KEGG分析中显着富集到的与Ras信号通路相关的蛋白进行蛋白相互作用网络构建。小结:蛋白质组学结果提示,PGRMC1蛋白沉默对孕酮神经保护作用下AD细胞模型的蛋白组产生显着影响,多种蛋白表达水平发生改变。经生物信息学分析提示,Ras信号通路可能是介导孕酮神经保护作用的主要通路之一。第三部分PGRMC1在Ras信号通路介导孕酮对抗Aβ25-35所致神经元损伤中的作用目的:研究Ras信号通路在PGRMC1介导孕酮神经保护作用中的机制。方法:应用Ras信号通路抑制剂FTI-277进一步确认Ras信号通路在孕酮的神经保护中的作用。采用pull down技术测定在孕酮神经保护作用下神经元细胞内GTP-Ras水平变化;应用Western blot技术检测Ras信号通路中各相关蛋白的表达水平变化。结果:1 FTI-277对孕酮神经保护作用的影响实验结果发现,FTI-277能够剂量依赖性减弱孕酮对AD模型的神经保护作用。与孕酮干预组相比,各FTI-277组神经元凋亡率显着增加,存活率显着降低。其中加入20μM FTI-277后,神经元凋亡率为41.6%,存活率为31.2%,与孕酮干预组存在显着差异（P<0.05）。结果提示20μM FTI-277能显着抑制孕酮的神经保护作用,可用于后续实验。2激活型GTP-Ras蛋白水平的检测结果实验结果发现,与空白对照组相比,Aβ25-35组神经元细胞中活性GTP-Ras蛋白水平显着下降,约为空白对照组的55.9%（P<0.05）;孕酮能够显着提高活性GTP-Ras蛋白水平,约为空白对照组的107.1%,显着高于Aβ25-35组（P<0.05）。在神经元PGRMC1蛋白沉默后,孕酮激活Ras蛋白的作用显着减弱（P<0.05）,GTP-Ras蛋白水平显着下降,约为空白对照组的72.3%。而阴性对照病毒组孕酮的作用不受影响。FTI-277干预可显着减弱孕酮的作用。3 PI3K/Akt信号通路中相关蛋白表达水平的检测结果实验结果发现,与空白对照组相比,Aβ25-35组神经元中PI3K蛋白的表达水平以及Akt磷酸化水平显着下降,分别为空白对照组的48.7%和11.1%;加入孕酮干预后,与Aβ25-35组相比,孕酮显着增加PI3K蛋白的表达水平以及Akt磷酸化水平（P<0.05）,分别为空白对照组的90.1%,87.8%。在PGRMC1蛋白沉默后,孕酮作用显着减弱（P<0.05）,PI3K蛋白的表达水平以及Akt磷酸化水平分别为空白对照组的44.9%,17.0%。阴性对照病毒组孕酮作用不受影响（P>0.05）。FTI-277干预亦显着减弱孕酮的作用。4 Bax/Bcl-2比值的检测结果实验结果发现,与空白对照组相比,Aβ25-35组神经元中Bax/Bcl-2比值显着提高,约为空白对照组的7.9倍;加入孕酮干预后,与Aβ25-35组相比,孕酮显着降低Bax/Bcl-2比值（P<0.05）,约为空白对照组的2.1倍。在神经元PGRMC1蛋白沉默后,孕酮作用显着减弱（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值约为空白对照组的7.7倍。而阴性对照病毒组孕酮作用不受影响。FTI-277干预也能显着减弱孕酮的作用。5与Ras信号通路激活相关的各蛋白表达水平的检测结果实验结果发现,与空白对照组相比,Aβ25-35组神经元中总Ras和Grb2蛋白水平显着下降,分别约为空白对照组的65.7%和20.0%;加入孕酮干预后,与Aβ25-35组相比,总Ras和Grb2蛋白水平显着增加,分别为空白对照组的99.5%和110.4%（P<0.05）。在神经元PGRMC1蛋白沉默后,孕酮对总Ras和Grb2蛋白的作用显着减弱（P<0.05）,分别为空白对照组的68.9%和34.7%。阴性对照病毒组孕酮的作用不受影响。FTI-277干预组孕酮的作用无显着性变化。Sos1蛋白在各处理组中表达水平没有显着性差异。小结:孕酮通过PGRMC1激活Ras信号通路发挥神经保护作用。孕酮可能是通过增加总Ras蛋白以及连接蛋白Grb2的表达激活Ras信号通路。结论:综上所述,本研究通过RNA干扰以及基于质谱的蛋白质组学技术,系统地研究了PGRMC1蛋白沉默对孕酮发挥对抗Aβ25-35毒性的神经保护作用引起的神经元蛋白质组的变化,寻找与PGRMC1相关的作用靶蛋白及信号通路。研究发现孕酮通过PGRMC1激活Ras信号通路发挥对Aβ所致神经元损伤的保护作用。
陈书清[8]（2018）在《苦茶碱的分离制备以及对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤的保护作用》文中研究指明谷氨酸（Glutamate,Glu）是中枢神经系统内含量最高、作用最广泛的兴奋性氨基酸。当大脑出现缺血缺氧损伤时,细胞外Glu浓度会过高,并会和Glu受体过度结合,导致神经元死亡。苦茶碱（Theacrine,TC）是主要存在于苦茶中的嘌呤生物碱,具有镇静催眠、抗抑郁和消炎镇痛等生理功效。本文研究了运用制备色谱法分离制备苦茶中的TC的方法,以HT22细胞为研究对象,建立了Glu诱导损伤的细胞模型,探讨了TC对Glu诱导HT22细胞损伤的保护作用以及可能机制。具体研究结果如下:（1）以制备TC的纯度、回收率、保留时间和分离度为考察指标,研究了不同的流动相比例、上样浓度、上样体积以及流动相流速对分离制备过程的影响。TC的最佳制备色谱程序为:B相35%平衡1BV（一个柱体积）,手动进样,1.01-1.50BV B相35%,1.51-3.30BV B相45%,上样浓度为10mg/ml,上样体积为500μl,流速为2ml/min。分离得到的物质经过UPLC-MS/MS鉴定,确定为TC。（2）以HT22细胞为研究对象,5mmol/L的Glu建立细胞损伤模型,发现TC和A2A受体拮抗剂SCH58261对Glu诱导的HT22细胞损伤具有保护作用,能够明显改善细胞形态,提高细胞存活率,并且具有一定的浓度依赖性。（3）Glu诱导HT22细胞能够使SOD活力下降,MDA含量上升,TC能够显着性提高Glu诱导HT22细胞的SOD活力,显着性降低MDA含量,并表现出一定的浓度依赖性。（4）通过观察Hoechst 33342染色后HT22细胞的形态以及流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,发现Glu诱导可以使HT22细胞产生明显的凋亡形态,细胞凋亡率明显增加,而加入TC后可以明显改善Glu诱导的HT22细胞的凋亡形态、降低细胞凋亡率,并表现出一定的浓度依赖性。综上所述,制备色谱能够有效分离制备苦茶中的TC,并且TC能够抑制Glu诱导的HT22细胞损伤,其作用机制为:TC的保护作用可能与抗氧化和抗凋亡有关,也可能与TC作为A2A受体拮抗剂有关。
李振宏[9]（2017）在《变异型伴中央颞区棘波儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:分析变异型伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫（变异型BECT）与锌及代谢相关激素的相关性,探讨可行的早期干预措施,并改善变异型BECT的治愈率。方法:1.选择在本院就诊的58例变异型BECT患儿作为实验组,选择典型BECT儿童120例作为对照组。两组患儿均于清晨空腹抽取5ml静脉血置于一次性使用生化采血管,采用BH5300S型钨舟原子吸收光谱仪检测全血微量元素浓度,采用罗氏发光仪（Cobas e601）检测代谢相关激素,贝克曼AU5800生化仪检测载脂蛋白,采用酶联免疫吸附（ELISA）测定血浆瘦素,同时抽静脉血2m L于一次性抗凝管中,采用细胞分析仪检测血常规。分析比较两组儿童血清微量元素、代谢相关激素、血常规、载脂蛋白及瘦素水平。2.比较两组患儿头颅磁共振波谱、脑电图棘慢波指数的变化,采用中国修订韦氏儿童智力量表（WISC-R）作为评定工具,对两组儿童进行测试及评定。结果:1.实验组儿童血清铁浓度,锌浓度以及血红蛋白浓度均明显低于对照组儿童（P<0.05）,实验组儿童血清铜离子浓度与对照组儿童比较,统计学比较差异无显着性意义（P>0.05）,实验组儿童载脂蛋白及瘦素水平与对照组比较,统计学比较差异无显着性意义（P>0.05）。实验组儿童血清（Gh,Cortisol,PTH,TSH）浓度明显下调,而血清（ACTH,FT3,FT4,25（OH）D）浓度明显上调。线性相关分析表明,锌与4种代谢相关激素显示正相关或负相关,8种代谢相关激素中有12对显示正相关或负相关,在总的36对中占44%。2.实验组患儿头颅磁共振波谱NAA（N-乙酰天门冬氨酸）峰值降低,脑电图棘慢波指数较对照组明显增多,患儿认知功能明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。线性相关分析表明,锌及代谢相关激素与脑电图棘慢波指数、磁共振波谱及认知功能呈现正相关或负相关。结论:实验组患儿微量元素锌,铁明显下调,血清（Gh,Cortisol,PTH,TSH）水平明显下调,而血清（ACTH,FT3,FT4,25（OH）D）水平明显上调,提示变异型BECT与微量元素及代谢相关激素有较大的相关性,可能为变异型BECT难以用常规抗癫痫药物有效治疗的原因之一,为临床工作者进一步研究变异型BECT的早期干预措施,并改善变异型BECT的治愈率,提供了一个新的临床思路。目的:建立发育期惊厥诱导的神经元损伤模型,观察并记录凋亡率和存活率,初步验证神经元损伤模型的可行性,以期为下一步干预提供模型。方法:在体外原代培养10天的海马和大脑皮层神经元中分别加入不同浓度的谷氨酸（100、200、300、400μmol/L）,相差显微镜下观察细胞形态变化,用台盼蓝染色法检测存活率和TUNEL细胞凋亡技术检测凋亡率,以检测不同浓度谷氨酸对大脑海马神经元的损伤水平,找到建立发育期惊厥诱导的神经元损伤模型的最佳谷氨酸浓度。结果:不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞6h后,可见部分细胞胞体肿胀,细胞轴突变短;1d后部分肿胀细胞裂解。采用台盼蓝染色法计算神经元存活率,结果发现各种浓度的谷氨酸都能诱导神经元细胞凋亡,各种浓度的谷氨酸组神经元细胞与对照组神经元细胞比较,统计学有非常显着性差异（P<0.01）,而且随着实验组谷氨酸浓度逐渐升高,神经元细胞的存活率也逐渐下降。TUNEL染色发现,不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞1d后,神经元细胞体积变小,细胞核固缩。各种浓度的谷氨酸都能诱导神经元凋亡,与正常对照组比较,统计学有显着性差异（P<0.05）或非常显着性差异（P<0.01）,在谷氨酸浓度为100﹑200μmol/L时,神经元凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而上升,在谷氨酸浓度为200﹑300﹑400μmol/L时,细胞凋亡率随着浓度的上升而下降。结论:用上述方法培养的海马神经元状态很好,通过细胞免疫组化鉴定,纯度达到90%以上。在发育期惊厥诱导的神经元凋亡的实验中,当谷氨酸浓度为100﹑200μmol/L时,细胞凋亡率高而细胞死亡率并不高,提示100﹑200μmol/L的谷氨酸为诱导神经元凋亡的最佳浓度。目的:检测锌离子及其螯合剂对发育期惊厥诱导的神经元损伤的影响及机制,为新生期惊厥提供新的治疗靶点。方法:建立发育期惊厥诱导的神经元损伤模型,应用台盼蓝染色法、免疫组织化学、TUNEL细胞凋亡检测和荧光定量PCR等技术,在Zn SO4组中加入Zn SO4（50umol/l）,TPEN（锌离子螯合剂）组加入TPEN（2.5umol/l）,检测TPEN对发育期惊厥诱导神经元损伤的保护作用,观察细胞凋亡基因caspase-3、抑凋亡基因Bcl-2及锌转体（Zn T-1,Zn T-2,Zn T-3）表达水平变化。结果:100μmol/L的谷氨酸可引起神经元存活率下降,加入TPEN的实验组细胞存活率明显高于未加入TPEN的对照组细胞（P<0.05,P<0.01）;100μmol/L的谷氨酸可引起神经元凋亡,加入TPEN的实验组细胞凋亡率明显低于未加入TPEN的对照组细胞（P<0.05,P<0.01）;100μmol/L的谷氨酸可引起caspase-3阳性细胞率增加,加入TPEN的实验组caspase-3阳性率明显下调,而抑凋亡基因Bcl-2及锌转运体Zn T-1,Zn T-2明显上调（P<0.05,P<0.01）。结论:加入TPEN预处理海马与皮层神经元后,细胞存活率和抑凋亡基因Bcl-2上调,细胞凋亡率和caspase-3基因表达下调,提示TPEN对发育期惊厥导致的神经元损伤有保护作用,可能是通过促进Zn T-1,Zn T-2的上调,抑制锌离子内流,促使凋亡基因caspase-3表达下调和抑凋亡基因Bcl-2上调,缩小凋亡通路,减少细胞凋亡发生,从而对发育期惊厥诱导的神经元损伤起到保护作用。
郑晨[10]（2017）在《GLYX-13对脑缺血性神经元损伤保护性机制的研究》文中研究说明研究目的:谷氨酸和过度激活的NMDA受体结合所介导的兴奋毒损伤作用是脑卒中等脑组织缺血性疾病主要的病理生理机制。在过去的几十年中,NMDA受体阻滞剂被广泛的用于脑卒中、阿尔兹海默症等神经精神性疾病的干预性研究中,然而由于其严重的神经系统副作用,多数NMDA受体阻滞剂在相关临床研究中均以失败告终。近年来相关研究表明在脑卒中发生后的数小时乃至数日内的脑组织中普遍存在神经元受损以及NMDA受体功能减退等表现,鉴于此本研究另辟蹊径试图通过调节NMDA受体活性这一手段抑制兴奋毒损伤作用并提升和改善脑卒中后的NMDA受体功能。本论文中所研究的干预性药物GLYX-13（rapastinel）是一种NMDA受体甘氨酸位点的调节剂,有相关研究表明该药物对神经元具有保护性且毒副作用较小,然而至今国内外尚无GLYX-13改善缺血性神经元损伤作用机制的研究报道。据此,本研究在小鼠在体大脑中动脉阻塞模型（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO模型）以及离体脑片氧葡萄糖剥夺模型（Oxygen Glucose Deprivation,OGD模型）的基础上,通过观察GLYX-13对脑组织缺血/缺氧后有无神经保护效应及其对NMDA受体功能和突触可塑性的影响,探讨该药物对缺血性神经元损伤的保护性作用机制及其途径,为临床治疗脑卒中提供创新思路和方法。研究方法:1.探索GLYX-13对在体MCAO模型小鼠的神经保护性作用,研究方法如下:（1）实验动物分组:2月龄体重20-25g雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,即假手术组（Sham）、MCAO模型给予生理盐水对照组（Vehicle）、MCAO模型给予GLYX-13干预组（GLYX-13）。（2）MCAO模型小鼠的制备:采用硅胶线栓法阻塞小鼠右侧大脑中动脉供应区血流,线栓阻塞血流时间为60min。（3）MCAO模型脑血流量检测:应用激光多普勒血流检测仪对造模前后小鼠的大脑中动脉中央供应区血流量进行检测,只有造模后脑血流量小于或等于造模前基线水平20%的小鼠方能被纳入后续研究。（4）应用GLYX-13干预:于MCAO术后两小时经腹腔注射给予GLYX-13干预组小鼠10mg/kg的GLYX-13。（5）神经功能学评分:参考Longa神经功能学评分对以上3组小鼠进行神经功能评估。（6）脑组织梗塞范围的检测:应用TTC染色检测3组小鼠的脑组织梗塞范围。（7）脑组织海马神经元损伤程度检测:应用脑组织石蜡切片HE染色以及Fluoro Jade C染色检测3组小鼠海马神经元的损伤。2.探讨GLYX-13对缺血性神经元损伤的保护性作用机制,研究方法如下:（1）脑组织中NMDA受体含量及其磷酸化水平的检测:应用Western blot检测再灌注4h以及24h后3组小鼠脑组织中NR2A、NR2B、p-NR2A（Tyr1325）以及p-NR2B（Tyr1472）的表达。（2）电生理脑片全细胞膜片钳实验（1）实验分组:4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,即对照组（Con）、脑片OGD模型组、脑片OGD同时给予GLYX-13干预组（OGD+GLYX-13）、脑片OGD同时给予GLYX-13和NMDA受体甘氨酸位点全效激动剂D-serine干预组（OGD+GLYX-13+D-serine）。（2）离体脑片OGD模型的制备:用于模拟脑组织缺血后能量供应缺乏这一情况,采用被95%N2+5%CO2的混合气所饱和的人工脑脊液（ACSF）来灌流脑片,并且这种ACSF中的10mmol/L的葡萄糖被同浓度的蔗糖所替代。对脑片施加OGD的持续时间为5min。（3）诱发性的兴奋性突触后电流（EPSC）的检测:电刺激海马脑片shaffer侧枝并应用电生理脑片全细胞膜片钳技术分别记录4组脑片海马CA3-CA1 shaffer collateral通路EPSC、NMDA-EPSC以及NR2A和NR2B亚型所介导的EPSC的幅值。（3）在体MCAO模型脑组织梗塞范围的检测:应用TTC染色检测GLYX-13+D-serine处理组、GLYX-13+NVP-AAM077（特异性NR2A亚型拮抗剂）处理组以及GLYX-13+Ro256981（特异性NR2B亚型拮抗剂）处理组小鼠的脑组织梗塞体积,并将其结果与本研究第二章节中的TTC染色结果进行比较,进一步证实GLYX-13很可能是通过调节NMDA受体NR2亚基组分这一途径从而发挥对病理性突触可塑性的抑制作用以及神经保护作用这一猜想。研究结果:1.GLYX-13对在体MCAO模型小鼠的神经保护性作用（1）GLYX-13改善了小鼠缺血再灌注24h后的神经功能学评分:GLYX-13干预组小鼠的神经功能评分显着低于盐水对照组（n=12,***p<0.001）。（2）GLYX-13减少了小鼠脑缺血再灌注24h后的脑梗塞体积:与盐水对照组相比,GLYX-13干预组小鼠的脑梗塞体积显着减少（n=12,###p<0.001）。（3）GLYX-13减轻了小鼠缺血再灌注24h后患侧海马神经元的损伤:与盐水对照组相比,GLYX-13干预组小鼠患侧海马CA3区以及DG区Fluoro Jade C阳性神经元的数量显着减少（###p<0.001,n=5）,此外CA1区Fluoro Jade C阳性神经元的数量也低于盐水对照组（#p<0.05,n=5）。2.GLYX-13通过差异性调节NMDA受体NR2亚基进而对损伤脑组织发挥神经保护性作用。（1）Western blot实验结果:GLYX-13显着地下调了MCAO小鼠再灌注4h后脑组织中的p-NR2B（Tyr1472）的表达（#p<0.05,n=6）并且上调了p-NR2A（Tyr1325）的表达（#p<0.05,n=6）;此外缺血再灌注24h后的小鼠受损伤影响其脑组织中NR2A型NMDA受体的表达明显减少而GLYX-13的干预有效地预防了NR2A亚型的损失（#p<0.05,n=6）使得该亚型所介导的正常神经生理功能得以维持。（2）脑片全细胞膜片钳实验结果:（1）GLYX-13通过激活NMDA受体的甘氨酸辅助激动位点对抗脑组织缺氧时所产生的病理性的突触可塑性增强（post-ischemic Long Term Potentiation,i-LTP）:长达5min的OGD使得海马CA1区锥体神经元在恢复能量供应后的EPSC的幅值显着持续增高（n=5,**p<0.01）,并且这种由OGD所诱导的EPSC病理性增益的现象可被特异性的NMDA受体拮抗剂AP-5所阻断,即证实了这种i-LTP的产生需要NMDA受体的参与。而GLYX-13干预组经历同样时长的OGD后其海马CA1区锥体神经元在恢复能量供应后的EPSC的幅值明显低于单纯OGD损伤组（n=5,##p<0.01）,并且D-serine能够完全抵消GLYX-13对于i-LTP的抑制效应。（2）GLYX-13参与调节脑组织能量剥夺条件下NMDA受体亚基的组成:给予海马脑片长达5min的OGD处理后,海马CA1区锥体神经元含有NR2B亚基的NMDA受体所介导的EPSC的幅值显着增高并同时伴随着总的NMDA-EPSC幅值的增高（n=5,**p<0.01）,而含有NR2A亚基的NMDA受体介导的EPSC的幅值只有轻微增高,与对照组的差异不具有统计学意义。值得注意的是GLYX-13干预组NR2B-EPSC以及NMDA-EPSC的幅值显着低于单纯OGD损伤组（n=5,##p<0.01）。（3）在体MCAO模型TTC染色结果:（GLYX-13+Ro256981）处理组与单纯GLYX-13干预组相比未能表现出额外的神经保护性效应（n=6,p>0.05）;而（GLYX-13+NVP-AAM077）处理组和（GLYX-13+D-serine）处理组分别与MCAO模型盐水对照组相比并未表现出神经保护性效应（n=6,p>0.05）。即NMDA受体甘氨酸位点全效激动剂以及NR2A亚基的特异性拮抗剂的应用均能够消除GLYX-13对缺血性神经元损伤的改善作用。这便进一步证实了GLYX-13是通过作用于NMDA受体的甘氨酸辅助激动位点调节NMDA受体的NR2亚基构成从而发挥对缺血性神经元损伤的保护性作用。结论:1、GLYX-13对MCAO模型小鼠具有神经保护性。2、GLYX-13通过对NMDA受体NR2亚基的差异性调节对脑缺血性神经元损伤发挥保护性作用。
二、镁离子在0.1mmol/L谷氨酸诱发的体外海马神经元损伤中的作用(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、镁离子在0.1mmol/L谷氨酸诱发的体外海马神经元损伤中的作用(英文)（论文提纲范文）
（1）侧脑室给与硫酸镁对局灶性脑缺血大鼠神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要设备及仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 侧脑室埋管给药 |
| 1.6 动物分组及模型的制备 |
| 1.7 行为学测试 |
| 1.7.1 转棒实验 |
| 1.7.2 神经缺损评分 |
| 1.8 组织学评价 |
| 1.8.1 石蜡切片的制备 |
| 1.8.2 H-E染色 |
| 1.8.3 TTC染色 |
| 1.8.4 免疫组织化学染色 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 侧脑室置放给药通道对大鼠运动能力无影响 |
| 2.2 侧脑室给与硫酸镁后大鼠神经功能的变化 |
| 2.3 侧脑室给与硫酸镁后大鼠脑梗死量的改变 |
| 2.3.1 H-E染色下脑梗死面积 |
| 2.3.2 TTC染色下脑梗死体积 |
| 2.3.3 H-E染色下缺血后组织损伤的变化 |
| 2.4 免疫组织化学分析 |
| 2.4.1 p-NR1 蛋白表达 |
| 2.4.2 小胶质细胞标记蛋白Iba-1 的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 侧脑室给药 |
| 3.2 给与硫酸镁对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用 |
| 3.3 不同途径补镁后p-NR1蛋白的表达 |
| 3.4 补镁后Iba-1~+小胶质细胞活化 |
| 3.5 不同给药途径与脑保护作用 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 补镁疗法对于脑缺血疾病的神经保护作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（2）基于数据挖掘和网络药理学探讨中药治疗TON的用药规律及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 文献综述一 外伤性视神经病变的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 红花治疗神经系统疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 研究一 基于数据挖掘探究中药治疗外伤性视神经病变的用药规律 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 文献来源 |
| 1.2 检索方法 |
| 1.3 文献纳入标准 |
| 1.4 文献排除标准 |
| 1.5 资料录入及处理 |
| 1.6 处方数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 文献筛选结果及基本信息 |
| 2.2 处方中药频次分析 |
| 2.3 处方中药归经频次分布 |
| 2.4 处方中药药性频次分布 |
| 2.5 处方中药药味频次分布 |
| 2.6 处方中药功效类别频次分布 |
| 2.7 处方高频中药关联规则分析结果 |
| 2.8 处方高频中药聚类分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中医对TON的认识 |
| 3.2 治疗TON的常用处方分析 |
| 3.3 纳入处方中高频中药的分析 |
| 3.4 处方中药的药性、药味、归经、功效分析 |
| 3.5 治疗TON处方中药的关联规则分析 |
| 3.6 治疗TON处方中药的聚类分析 |
| 3.7 本研究的创新性 |
| 参考文献 |
| 研究二 基于网络药理学探究红花治疗外伤性视神经病变的机制 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 高频中药活性成分及作用靶点筛选 |
| 1.2 TON表达谱芯片数据下载及数据整理 |
| 1.3 视神经挤压5天后的C57BL/6J小鼠与正常对照组的差异表达基因筛选 |
| 1.4 红花治疗TON靶点的PPI网络构建 |
| 1.5 红花作用靶点与筛选出的TON差异表达基因的韦恩分析 |
| 1.6 关键靶点基因功能注释和通路富集分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 红花活性成分筛选结果 |
| 2.2 红花活性成分作用靶点 |
| 2.3 TON芯片差异表达基因结果 |
| 2.4 红花治疗TON靶点的PPI网络构建 |
| 2.5 红花活性成分对应靶点与TON差异基因交集靶点筛选 |
| 2.6 红花治疗TON核心靶点基因的GO富集分析 |
| 2.7 红花治疗TON核心靶点基因的KEGG通路富集分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 本研究的意义和创新性 |
| 3.2 选择红花作为该研究主要对象的原因 |
| 3.3 红花治疗TON的作用靶点分析 |
| 3.4 红花治疗TON靶点的PPI网络分析 |
| 3.5 红花治疗TON潜在机制分析 |
| 参考文献 |
| 研究三 红花注射液对L-谷氨酸钠诱导的RGC-5细胞TNF凋亡信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验设备与耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 细胞冻存 |
| 2.5 细胞计数 |
| 2.6 免疫荧光检测转录因子Brn3a的表达 |
| 2.7 筛选STSN诱导RGC-5分化的最佳浓度 |
| 2.8 CCK-8法筛选RGC-5谷氨酸损伤模型最佳浓度及时间 |
| 2.9 CCK-8法筛选红花注射液干预RGC-5谷氨酸损伤模型的最佳浓度及时间 |
| 2.10 CCK-8法检测红花注射液对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞存活率 |
| 2.11 流式细胞术检测红花注射液对STSN诱导后RGC-5细胞谷氨酸损伤模型细胞凋亡率 |
| 2.12 Western-blot检测L-谷氨酸钠诱导的RGC-5损伤模型相关凋亡通路中各蛋白的表达 |
| 2.13 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RGC-5细胞的体外培养 |
| 3.2 RGC-5的鉴定 |
| 3.3 STSN诱导RGC-5分化 |
| 3.4 L-谷氨酸钠诱导RGC-5细胞凋亡损伤模型 |
| 3.5 红花注射液干预RGC-5细胞浓度的筛选结果 |
| 3.6 红花注射液对L-谷氨酸钠诱导后RGC-5细胞存活率的影响 |
| 3.7 红花注射液对各组RGC-5细胞凋亡率的影响 |
| 3.8 红花注射液通过TNFR1/FADD/Caspase-8/Caspase-3通路调控RGC-5的凋亡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 红花及其有效成分保护RGCs的相关研究 |
| 4.2 红花及其有效成分对细胞凋亡相关通路的调控 |
| 4.3 在视神经损伤中,细胞凋亡对RGCs的存活起重要作用 |
| 4.4 TNFR/FADD/Caspase-8/Caspase-3凋亡信号通路 |
| 4.5 使用STSN分化RGC-5细胞的意义 |
| 4.6 红花注射液对L-谷氨酸钠诱导后RGC-5细胞凋亡通路的调控及分析 |
| 4.7 本研究的创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 红花活性成分对应靶点的基本信息 |
| 附录2 TON差异基因 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）VitD-BDNF-ERK通路在OSAHS大鼠海马组织中表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 维生素D改善OSAHS儿童认知行为异常的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4.附表图 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 维生素D调控DUOX1来对抗低氧致神经元损伤的机制研究 |
| 第一节 维生素D干预低氧损伤大鼠原代神经元的最佳浓度 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 附图表 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二节 维生素D对大鼠原代神经元低氧性损伤的保护机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 附图表 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三部分 维生素D调控BDNF-ERK信号通路在OSAHS大鼠海马中作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 附图表 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血清维生素D水平与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 |
| References |
| 致谢 |
| 发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和来源 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外源性H_2S体外磷酸化实验(~(32)P) |
| 2.1.1 重组质粒的转化 |
| 2.1.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.1.3 重组蛋白Rho A的分离与纯化 |
| 2.1.4 体外磷酸化 |
| 2.2 外源性H_2S实验 |
| 2.2.1 大鼠原代海马神经细胞培养与鉴定 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.2.4 缺氧性损伤模型(Hypoxia-Reoxygenation Protocol) |
| 2.2.5 细胞活力的测量 |
| 2.2.6 神经特异性烯醇化酶(NSE)活性测定 |
| 2.2.7 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 |
| 2.2.8 细胞膜蛋白和胞质蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.10 全细胞膜片钳技术 |
| 2.3 内皮源性H_2S实验 |
| 2.3.1 原代脑血管内皮细胞培养 |
| 2.3.2 细胞共培养系统 |
| 2.3.3 流式细胞仪细胞凋亡测定 |
| 2.3.4 神经细胞内钙含量测定 |
| 2.3.5 H_2S浓度的测量 |
| 2.3.6 神经细胞活力和LDH及 NSE的测定 |
| 2.3.7 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.4 动物实验 |
| 2.4.1 质粒转染大鼠(脑立体定位注射) |
| 2.4.2 大鼠脑缺血模型(双侧颈总动脉结扎2VO) |
| 2.4.3 脑组织(海马)HE染色 |
| 2.4.4 脑组织(海马)TUNEL染色 |
| 2.4.5 血清LDH和 NSE测定 |
| 2.4.6 海马组织RhoA和ROCK_2活性测定 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硫化氢(H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.1.1 目的蛋白在大肠杆菌(BL-21)中的表达 |
| 3.1.2 目的蛋白(RhoA~(wild),RhoA~(S188A))的纯化 |
| 3.1.3 NaHS(外源性H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.2 Ser188 介导NaHS对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.2.1 大鼠原代海马神经细胞的培养与鉴定 |
| 3.2.2 真核质粒(RhoA~(wild)-pEGFP-N1;RhoA~(S188A)-pEGFP-N1)转染原代大鼠神经细胞 |
| 3.2.3 Ser188 介导Na HS诱导大鼠海马神经元Rho A的磷酸化 |
| 3.2.4 Ser188在Na HS诱导神经元中Rho A易位和失活的作用 |
| 3.2.5 RhoA Ser188在NaHS诱导的ROCK_2蛋白表达及其活性抑制的作用 |
| 3.2.6 Rho ASer188 介导Na HS对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用 |
| 3.2.7 Rho A Ser188 介导Na HS对 BKCa通道电流的影响 |
| 3.3 Ser188介导内皮源性H_2S对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.3.1 大鼠原代脑血管内皮细胞(ECs)的培养与鉴定 |
| 3.3.2 内皮源性H_2S对神经元RhoA磷酸化,活性和易位的影响 |
| 3.3.3 内皮源性H_2S对神经元ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.3.4 内皮细胞中CSE产生内皮源性H_2S |
| 3.3.5 Ser188在CSE产生的H_2S诱导大鼠神经元RhoA磷酸化,转运和ROCK_2蛋白表达中的影响 |
| 3.3.6 Ser188在CSE产生的H_2S减轻神经元H/R损伤的作用 |
| 3.3.7 Ser188在CSE产生的H_2S对神经元(H/R损伤)RhoA和ROCK_2活性抑制的作用 |
| 3.3.8 Ser188在CSE产生的H_2S保护神经元H/R损伤的作用 |
| 3.4 Ser188 介导NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用 |
| 3.4.1 大鼠脑定位转染质粒的表达与检测 |
| 3.4.2 大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)模型验证 |
| 3.4.3 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织Rho A磷酸化及其活性的影响 |
| 3.4.4 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织ROCK_2蛋白表达及其活性的影响 |
| 3.4.5 Ser188在NaHS降低大鼠缺血再灌注损伤中LDH、NSE的影响 |
| 3.4.6 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马组织病理学的影响 |
| 3.4.7 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马神经细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 神经血管单位与缺血性脑中风关系 |
| 参考文献 |
（5）天麻素调控小胶质细胞抗大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 天麻素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 天麻素对缺血再灌注损伤后小胶质细胞中SOX4的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 天麻素在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护作用中Plpprs家族蛋白的作用及对线粒体功能的调节机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 实验流程图 |
| 第一部分 青霉素反复惊厥模型远期可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达变化和相互作用 |
| 绪论 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 讨论 |
| 第二部分 实验流程图 |
| 第二部分 生酮饮食干预远期前脑可塑性相关蛋白分子和线粒体功能相关蛋白分子表达 |
| 绪论 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 讨论 |
| 第三部分 酮体在离体细胞模型中对谷氨酸细胞毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用的机制研究 |
| 绪论 |
| 第三部分 第一节实验流程图 |
| 第三部分 第二节实验流程图 |
| 3.1 第一节酮体在离体细胞模型中对兴奋性细胞毒性的保护作用及Plppr5神经保护作用 |
| 3.2 第二节可塑性相关蛋白Plppr5通过调节线粒体功能发挥神经保护作用 |
| 3.3 结论 |
| 3.4 讨论 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 在读期间公开发表的论文 |
| 本课题资助项目 |
| 致谢 |
（7）基于蛋白质组学研究PGRMC1介导孕酮对Aβ25-35所致神经元损伤的保护作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 PGRMC1 在孕酮对抗Aβ_(25-35)所致神经元损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PGRMC1对孕酮干预下Aβ_(25-35)所致损伤神经元蛋白质组的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PGRMC1在Ras信号通路介导孕酮对抗Aβ_(25-35)所致神经元损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 蛋白质组学在神经科学中的研究概述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）苦茶碱的分离制备以及对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 茶叶嘌呤生物碱的提取和分离 |
| 1.1.1 超声波法 |
| 1.1.2 超临界CO_2萃取法 |
| 1.1.3 微波法 |
| 1.1.4 色谱分离法 |
| 1.2 苦茶碱的生理功效 |
| 1.2.1 镇静催眠 |
| 1.2.2 抗抑郁 |
| 1.2.3 消炎镇痛 |
| 1.2.4 抗帕金森病作用 |
| 1.2.5 对脂质代谢的作用 |
| 1.2.6 其它功效 |
| 1.3 谷氨酸的神经毒性研究 |
| 1.3.1 谷氨酸受体 |
| 1.3.2 谷氨酸转运体 |
| 1.3.3 谷氨酸诱导神经毒性的机制研究 |
| 1.4 研究的目的、意义及主要内容 |
| 第二章 苦茶碱的提取与分离研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器设备 |
| 2.2.1 实验材料和试剂 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 苦茶总生物碱的分离纯化 |
| 2.3.2 制备色谱条件优化 |
| 2.3.3 HPLC分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 苦茶总生物碱的分离纯化 |
| 2.4.2 制备色谱分离条件的筛选 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 苦茶碱和A_(2A)受体拮抗剂SCH58261 对谷氨酸损伤HT22 细胞活性的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验细胞系 |
| 3.2.2 主要试剂及配制方法 |
| 3.2.3 相关仪器与设备 |
| 3.3 HT22细胞培养、传代、冻存、复苏及计数 |
| 3.3.1 HT22细胞培养和传代 |
| 3.3.2 HT22细胞冻存 |
| 3.3.3 HT22细胞复苏 |
| 3.3.4 HT22细胞计数 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 不同浓度谷氨酸、苦茶碱、SCH58261分别处理HT22细胞 |
| 3.4.2 不同浓度苦茶碱和SCH58261对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤的影响 |
| 3.4.3 MTT实验方法 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 不同浓度谷氨酸对HT22细胞形态和存活率的影响 |
| 3.5.2 不同浓度苦茶碱对HT22细胞形态和存活率的影响 |
| 3.5.3 不同浓度SCH58261对HT22细胞形态和存活率的影响 |
| 3.5.4 不同浓度苦茶碱对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤作用的影响 |
| 3.5.5 不同浓度SCH58261对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤作用的影响 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 苦茶碱对谷氨酸诱导的HT22细胞氧化应激的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验细胞系 |
| 4.2.2 主要试剂及配制方法 |
| 4.2.3 相关仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样品前处理 |
| 4.3.2 SOD活力的测定 |
| 4.3.3 MDA含量的测定 |
| 4.3.4 考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 苦茶碱对谷氨酸诱导HT22细胞损伤SOD活力的影响 |
| 4.4.2 苦茶碱对谷氨酸诱导HT22细胞损伤MDA含量的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 苦茶碱对谷氨酸诱导的HT22细胞凋亡的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验细胞系 |
| 5.2.2 主要试剂及配制方法 |
| 5.2.3 相关仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 Hoechst33342染色 |
| 5.3.2 流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Hoechst33342染色后HT22 细胞的形态学变化 |
| 5.4.2 流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
（9）变异型伴中央颞区棘波儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一部分 变异型伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系研究 |
| 前言 |
| 一、资料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 发育期惊厥致海马与大脑皮层神经元损伤模型的建立 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 锌及其螯合剂对发育期惊厥致海马与大脑皮层神经元损伤的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 锌稳态在惊厥性脑损伤中的作用及研究进展（综述） |
| 参考文献 |
| 论文创新之处与不足 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文及承担课题 |
| 致谢 |
（10）GLYX-13对脑缺血性神经元损伤保护性机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及研究现状 |
| 1.1.1 缺血性神经元损伤发生机制的研究现状 |
| 1.1.2 以NMDA受体及其亚基为靶点的脑卒中治疗药物研究现状 |
| 1.1.3 甘氨酸位点部分激活剂GLYX-13的潜在神经保护性效应 |
| 1.2 研究目的及其意义 |
| 1.3 论文研究的主要内容 |
| 第二章 GLYX-13对脑缺血性神经元损伤的保护性作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 对象和方法 |
| 2.2.1 实验动物及分组 |
| 2.2.2 主要仪器设备及耗材 |
| 2.2.3 实验药品及试剂 |
| 2.2.4 主要溶液及缓冲液的配制 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 GLYX-13改善了小鼠在缺血再灌注24h的神经功能评分 |
| 2.3.2 GLYX-13减少了小鼠脑缺血再灌注24h后的脑梗塞体积 |
| 2.3.3 GLYX-13减轻了小鼠缺血再灌注24h后患侧海马神经元的损伤 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 在体脑缺血动物模型的选取 |
| 2.4.2 气体麻醉剂异氟烷对MCAO小鼠模型的影响 |
| 2.4.3 NMDA受体阻滞剂临床应用的局限性 |
| 2.4.4 NMDA受体调节剂GLYX-13的潜在神经保护性 |
| 2.4.5 GLYX-13对海马不同脑区神经元保护性的差异 |
| 2.5 本章小结 |
| 2.5.1 GLYX-13改善了小鼠脑缺血再灌注24h后的神经功能 |
| 2.5.2 GLYX-13减少了小鼠脑缺血再灌注24h后的脑梗塞体积 |
| 2.5.3 GLYX-13减轻了小鼠脑缺血再灌注24h后患侧海马神经元的损伤 |
| 第三章 GLYX-13对脑缺血性神经元损伤的保护性机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 对象和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要仪器设备及耗材 |
| 3.2.3 实验药品及试剂 |
| 3.2.4 主要溶液及缓冲液的配制 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 在体MCAO模型小鼠脑组织中NMDA受体NR2亚基表达的Westernblot实验结果 |
| 3.3.2 离体OGD模型电生理脑片全细胞膜片钳记录实验结果 |
| 3.3.3 GLYX-13对在体MCAO模型小鼠通过提高NR2A的亚基组份并且降低NR2B 的亚基组份从而发挥神经保护性作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 离体脑片氧葡萄糖剥夺模型的研究意义 |
| 3.4.2 膜片钳技术是研究药物对离子通道作用机制的核心技术 |
| 3.4.3 NR2A亚基的促神经元存活作用以及NR2B亚基的促神经元死亡效应 |
| 3.4.4 GLYX-13的药物安全性 |
| 3.4.5 GLYX-13对脑缺血性疾病的神经保护性分子机制 |
| 3.5 本章小结 |
| 3.5.1 GLYX-13下调MCAO小鼠再灌注4h后p-NR2B（Tyr1472）表达的同时上调 p-NR2A（Tyr1325）的表达 |
| 3.5.2 GLYX-13减少了缺血再灌注24h后NR2A亚基的丢失 |
| 3.5.3 GLYX-13通过结合NMDA受体的甘氨酸辅助激动位点抑制病理性的突触可塑性增强 |
| 3.5.4 GLYX-13参与调节脑组织能量剥夺条件下NMDA受体NR2亚基的组成 |
| 3.5.5 GLYX-13对在体MCAO模型小鼠通过提高NR2A的亚基组份并且降低NR2B的亚基组份从而发挥神经保护性作用 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 主要研究工作总结 |
| 4.2 论文创新点 |
| 4.3 研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 缺血性神经元损伤分子机制及其药物干预研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、镁离子在0.1mmol/L谷氨酸诱发的体外海马神经元损伤中的作用(英文)（论文参考文献）
- [1]侧脑室给与硫酸镁对局灶性脑缺血大鼠神经保护作用的研究[D]. 徐润楠. 桂林医学院, 2021(01)
- [2]基于数据挖掘和网络药理学探讨中药治疗TON的用药规律及机制[D]. 吴琼. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]VitD-BDNF-ERK通路在OSAHS大鼠海马组织中表达的研究[D]. 崔盼盼. 山东大学, 2021(10)
- [4]H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用[D]. 陈野. 安徽医科大学, 2021(01)
- [5]天麻素调控小胶质细胞抗大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究[D]. 李世鹏. 昆明医科大学, 2019
- [6]生酮饮食对发育期惊厥性脑损伤神经保护作用中Plpprs家族蛋白的作用及对线粒体功能的调节机制[D]. 李丽丽. 苏州大学, 2019(04)
- [7]基于蛋白质组学研究PGRMC1介导孕酮对Aβ25-35所致神经元损伤的保护作用机制[D]. 吴志刚. 河北医科大学, 2019(01)
- [8]苦茶碱的分离制备以及对谷氨酸诱导的HT22细胞损伤的保护作用[D]. 陈书清. 浙江大学, 2018(05)
- [9]变异型伴中央颞区棘波儿童良性癫痫与锌及代谢相关激素的关系及机制研究[D]. 李振宏. 苏州大学, 2017(05)
- [10]GLYX-13对脑缺血性神经元损伤保护性机制的研究[D]. 郑晨. 天津医科大学, 2017(01)