张英男[1]2003年在《应用双向电泳技术对大肠癌肝转移蛋白质组表达差异及其意义的研究》文中指出大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来大量统计资料表明，我国的大肠癌发病率和死亡率呈逐年增高。在临床上大肠癌根治性切除后出现肝转移是导致死亡的主要原因。因此，早期预测和诊断肝转移是提高大肠癌生存率的关键，对改善大肠癌预后有重要意义。蛋白质组学研究方法和技术为大肠癌肝转移分子机制及早期诊断和防治的研究提供了有利条件。【目的】 利用蛋白质组研究技术,通过双向电泳分离、比较大肠癌原发灶、正常大肠粘膜、大肠癌肝转移灶中蛋白质表达差异，通过质谱检测分析，确定与大肠癌肝转移相关的蛋白质组分。探讨大肠癌肝转移的分子机制，寻找和鉴定大肠癌肝转移相关蛋白，为临床预测和早期诊断大肠癌肝转移提供依据。【方法】 (1)分别采用一步法、分步法提取大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜组织蛋白质组；(2)以Bradford测定法绘制蛋白定量标准曲线，对各组织样品蛋白提取物定量；(3)各组织蛋白质组提取物以相同加样量行双向凝胶电泳：一向等电聚焦，使用固相pH梯度凝胶条（IPGstrip pH3-10L），胶内重泡胀技术，聚焦总电压时35kVh～40kVh；用高效去垢剂叁正丁基膦（TBP）一步平衡；二向电泳采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（12.5%、1.5mm均一胶）；(4)染色：行银染和考马斯亮蓝染色；(5)图象采集与分析：将双向电泳图谱输入计算机，使用Melanie3.0双向电泳图象分析软件分析，比较分步提取法与一步法差异：以正常大肠粘膜组织行对照、斑点配比，评价双向电泳重复性。(6)大肠癌肝转移蛋白质组表达差异分析，确认差异表达蛋白点；(7)肽质量指纹分析：差异蛋白点经基质辅助解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TF-MS）分析，获得肽质量指纹谱。使用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，以Profound检索程序在NCBInr数据库中进行蛋白同源查询，结合双向凝胶电泳相应点表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率等进行综合分析。【结果】 (1) 大肠癌原发灶、正常肠粘膜、肝转移灶组织样品第二步提取物蛋白定量结果分别为2.5μg/μl、2.7μg/μl、2.3μg/μl，符合双向电泳要求；一步法提取物叁种组织浓度分别为1.2μg/μl、1.3μg/μl、1.5μg/μl。分步合成<WP=8>胶图谱蛋白点检测平均为765.75，一步法平均为522.75，两者相差显着。(2) 经Melanie 3.0软件分析，重复性评价结果显示：总蛋白质的分布模式非常相似，蛋白质斑点数分别为266、207；蛋白点分子量介于8～90kD，等电点介于4～9；匹配率为72%，匹配点数190；匹配蛋白点量的相关系数为0.912；配对t检验结果P>0.05(t=1.97, P=0.56)，差别不显着；位置重复性好。 (3) 蛋白质组差异表达与图象分析结果显示：相同条件下，大肠癌原发灶中蛋白质斑点为206±22个，正常肠粘膜组织中为390±28个，肝转移灶组织中为236±19个。大肠癌肝转移灶中蛋白质表达与癌原发灶、正常肠粘膜相比有显着差异(t=17.321、29.637, P<0.01)。不同组织蛋白质点与正常结肠粘膜参考胶蛋白质点匹配显示：正常肠粘膜组织为313±45个，癌原发灶为195±38个，肝转移灶为184±24个。平均匹配率分别为：80.3%、77.2%、78.0%。(4) 大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜的双向电泳有显着的蛋白质表达差异。在pH4.0-9.0范围内，癌原发灶和肝转移灶中25-40KD蛋白质表达表达缺失或下降较多。分子量为14-21KD的蛋白质在癌原发灶和肝转移灶中出现特异性表达或较正常肠粘膜表达量明显增加。(5) 对大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜组织组织中9个差异表达蛋白点分析鉴定，钙调蛋白联合体、核糖核酸酶-6-前体蛋白以及XP_040720蛋白在正常肠粘膜表达，但肝转移和癌原发灶中表达缺失。前阿朴脂蛋白在正常肠粘膜中表达缺失，而在癌原发灶及肝转移灶中表达递增。C-4蛋白点肽指纹与已知蛋白比较同源性低，在癌原发灶中表达，在肝转移灶和正常肠粘膜中为阴性。β-珠蛋白在肝转移灶和正常肠粘膜中表达，而在癌原发灶中表达缺失。M-7、M-9蛋白点和Cdc 42在肝转移灶中表达，在原发灶和正常肠粘膜未见表达。【结论】(1) 建立的分步提取法可以提高组织蛋白质组的提取率，减少常规一步提取法蛋白质的丢失，提高了分离效果，对蛋白质斑点的鉴别可提供更多的信息。(2) 应用固定pH梯度(IPG)及胶内重泡胀技术，可提高双向电泳的分辨率和重复性。(3) 对比大肠癌原发灶、肝转移灶、正常肠粘膜的双向电泳图象分析结果，表明在大肠癌发生和肝转移的过程中有显着的蛋白质表达差异。(4) 钙调蛋白联合体、核糖核酸酶－6－前体蛋白、α-甘露糖苷酶Ⅰ表达缺失与大肠癌发生和肝转移有关；前阿朴脂蛋白增强表达与大肠癌发生和转移有关；Cdc42蛋白、β-珠蛋白、表达与肝转移有关。(5) C-4、M-7、M-9蛋白可能是与大肠癌发生和肝转移相关的新蛋白，其序列和功能有待进一步研究。
佚名[2]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中研究说明14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
白雪[3]2005年在《大肠癌发生与肝转移蛋白质组表达差异及其意义的研究》文中研究指明肝脏是结直肠癌转移最常见的器官，临床上结直肠癌患者根治性手术切除后发生肝转移是影响患者预后的主要原因。为了深入研究大肠癌发生、发展及肝转移的分子机理，以提高对大肠癌肝转移的防治效果，我们采用蛋白质组学研究方法，对比分析正常结直肠粘膜、癌原发灶、肝转移灶组织中蛋白组表达差异，分离、鉴定结直肠癌发生和肝转移的相关蛋白，并研究其对结直肠癌细胞生物学行为的影响，从而为筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。 【材料和方法】一、标本采集：我院结直肠癌伴肝转移患者20例，男女各10例。年龄36-67岁。均行手术治疗，经病理组织学证实，Duke’s分期为D期。手术中取手术切除新鲜标本，大肠癌原发灶、正常肠粘膜、肝转移灶组织，贮于液氮中冻存备用。二、蛋白质样品制备及双向凝胶电泳：等电聚焦按照Ampharmacia操作方法进行，组织蛋白提取物经Bradford法定量后取500μg与水化溶液(7M尿素、2M硫脲、2％CHAPS、15mmol／L DTT、0 5％IPG缓冲液pH 3—10、痕量溴酚蓝)混合，总体积200μl，与IPG胶条共同泡胀，总电压伏小时达到40kVh，最大电压至8000V。等电聚焦结束后，用一步平衡法平衡15分钟，平衡液成分为50mmol／L Tris缓冲液(pH8.8)，含2％W／V SDS，5mmol／L TBP，6mol几尿素和30％甘油。然后用12.5％凝胶做第2向SDS-PAGE胶恒流电泳，7h。电泳温度15℃。电泳后考马斯亮兰染色及脱色。叁、图象采集与分析：用Micotech K8扫描仪，600dpi分辨率扫描染色凝胶。图象以Melanie 3.0软件(GeneBio，Geneva)分析。每种组织叁次电泳凝胶图象经背景消减、斑点检测与配比，得到标准胶，再经配比产生差异表达蛋白点数据信息。四、质谱分析及质谱数据库搜寻：用LCQ DECA XP~(plus)质谱仪(ThermoFinnigan，USA)对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析。获得的肽序列数据用Mascot软件在NCBI的nr数据库中搜寻。五、用常规RT-PCR方法克隆差异表达蛋白基因全长cDNA。构建真核表达载体pcDNA3.1-CA。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-CA转染人直肠腺癌HR-8348及结肠腺癌lovo细胞。六、结直肠癌细胞生物学行为改变得观察：四唑盐(MTT)比色试验：以转染pcDNA3.-CA的细胞为实验组；以未转染pcDNA3.1-CA的细胞为对照组。分别观察其对5-Fu及奥沙利铂药物的抑制率。抑制率=[1-(实验组吸光度值／空白对照组吸光度值)]×100％。七、统计学处理：应用SPSSl 2.0统计软件
白雪[4]2008年在《结直肠癌发生和肝转移相关蛋白质差异表达及其意义的研究》文中认为【目的】结直肠癌肝转移是影响结直肠癌预后的重要因素,25%的结直肠癌患者确诊时即伴随肝转移,另有25%患者在结直肠癌根治术后伴随肝转移。结直肠癌肝转移的早期诊断治疗对延长患者生命至关重要。为了深入研究结直肠癌发生、发展及肝转移的分子机理,以提高对结直肠癌肝转移的防治效果,我们采用蛋白质组学、细胞生物学及免疫组织化学研究方法,对结直肠癌原发灶和肝转移灶及不同分期的结直肠癌组织进行实验研究,为揭示结直肠癌肝转移机制及筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。【材料和方法】标本采集实验所用标本均取自北京军区总医院普通外科,选取经临床影像学诊断为结直肠癌伴随肝转移患者共16例,术中切取适量的结直肠癌原发灶、肝转移灶和癌旁正常肠粘膜标本,立即贮于液氮中冻存备用。所选标本术后病理证实为结直肠中低分化腺癌并伴随肝转移,临床TNM分期Ⅳ期(T2-4N1-2M1)。其中男9例女7例。年龄41-75岁。其中结肠癌8例,腹膜反折外直肠癌8例。蛋白质样品制备及双向凝胶电泳双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)按照GE Healthcare提供的Ettan DIGE使用手册操作方法进行。将每例患者的各种样品等量混和作为内标(Cy2标记),然后将各样品50μg分别与CyDye DIGE最小标记法染料(Cy3、Cy5)400pmol混和上样。将样品加入IPG胶条槽内并放置好24cmIPG胶条。使用等电聚焦仪PROTEAN IEF Cell ( Bio-Rad )进行第一向等电聚焦电泳(IEF);使用Ettan DALT Twelve电泳系统(Amersham)进行蛋白样品的二向分离。电泳结束后室温下在避光容器中将凝胶存放于SDS电泳缓冲液中,立即对凝胶进行扫描。图像采集与分析用Typhoon 9410扫描仪在488/520nm, 532/580nm, 633/670nm波长分别对Cy2, Cy3, Cy5荧光染料标记的图像进行扫描,用DeCyder v.5.02图像分析软件对DIGE图像进行分析和差异点寻找。计算各块胶与MASTER胶的匹配率,差异点满足条件:p≤0.05。质谱分析及质谱数据库搜寻使用液相色谱-电喷雾-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)及MALDI-TOF-MS质谱仪对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析。获得的肽序列信息(PSD)及肽质量指纹谱(PMF)数据用Mascot软件在SWISSPORT数据库中搜寻鉴定蛋白质。细胞生物学实验用常规RT-PCR方法克隆差异表达蛋白基因全长cDNA。构建真核表达载体pcDNA3.1-CAII。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-CAII转染人直肠腺癌HR-8348细胞。四唑盐(MTT)比色试验:以转染pcDNA3.1-CAII的细胞为实验组;以未转染pcDNA3.1-CAII的细胞为对照组。分别观察5-Fu及奥沙利铂药物对其的抑制率。抑制率=[1-(实验组吸光度值/空白对照组吸光度值)]×100%。免疫组织化学实验用常规免疫组织化学方法验证人精氨酸酶在结直肠癌不同分期各种组织中的表达情况。使用美国ZYMED公司SP试剂盒在组织石蜡切片上进行免疫染色。【结果】双向凝胶电泳及质谱鉴定在16个病例组结直肠癌原发灶、肝转移灶及正常肠粘膜组织标本的2-D DIGE中,蛋白点清晰可辨,每块胶获得蛋白点约为900个。结直肠癌原发灶与肝转移灶蛋白质组分有明显差别。用DeCyder v.5.02图像分析软件对DIGE图像进行分析和差异点寻找。我们选择了22个差异蛋白点进行了质谱鉴定。鉴定出有意义的蛋白质20种。2种蛋白在各种癌组织中低表达而在正常肠粘膜中高表达,分别为碳酸酐酶II(CAII)和蛋白质二硫键异构酶(PDI);2种蛋白在结直肠癌原发灶组织中表达上调而在肝转移灶中表达下调,分别为激活蛋白因子2B,腺苷蛋氨酸变异体;16种蛋白在肝转移灶组织中表达上调,包括锌指蛋白64同系物,鸟嘌呤核苷酸交换因子4,人精氨酸酶,人谷胱甘肽S-转移酶A3,肿瘤坏死因子α-诱导蛋白9,谷氨酸脱氢酶载脂蛋白链A,转接分子受体2,核苷酸还原酶M2多肽等。细胞生物学实验转染CAII基因的直肠腺癌细胞HR8348对奥沙利铂和5-Fu化疗药物更敏感,耐药性更低。免疫组化验证人精氨酸酶定位结直肠癌组织细胞质中,人精氨酸酶在正常肠粘膜、无淋巴结转移的结直肠癌原发灶组织、有淋巴结转移的直肠癌原发灶组织、有肝转移的直肠癌原发灶组织、肝转移灶组织中的阳性表达率逐步增高。特别是在伴淋巴结转移的结直肠癌和肝转移灶组织中的表达阳性率显着高于无淋巴结转移的结直肠癌原发灶组织及正常肠粘膜。【结论】应用差异蛋白质组学方法研究结直肠癌发生过程中蛋白质组的改变,,是筛选结直肠癌肿瘤标志物及探讨结直肠癌发生及转移机制的有效手段。双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)作为近几年广泛应用的蛋白质组学新技术也开始应用于结直肠癌的研究,其精确度和可重复性都大大超过常规方法。本实验应用双向荧光差异凝胶电泳方法,对结直肠癌原发灶、肝转移灶及癌旁正常肠粘膜叁种组织进行差异蛋白质组学研究,发现碳酸酐酶II(CAII)、蛋白质二硫键异构酶(PDI)在癌组织和复发转移灶中表达显着下调;发现激活蛋白因子2B(activator protein 2B)和腺苷蛋氨酸变异体(transgelin variant)在结直肠癌原发灶组织中表达显着增高。发现人精氨酸酶(Homo sapiens arginase)、谷胱甘肽转移酶A3(GSTA3)、鸟嘌呤核苷酸交换因子4 (ASEF)等在肝转移灶组织中表达显着增高;转染CAII基因的直肠腺癌细胞HR8348增强了奥沙利铂和氟尿嘧啶(5-Fu)对该细胞的细胞毒作用,使癌细胞对化疗药物更敏感,耐药性更低,提示癌组织中CAⅡ表达与癌组织的侵袭、转移和生物学行为有关,CAⅡ在抑制结直肠癌发生、转移中发挥作用,为肿瘤的基因诊断及基因治疗奠定了理论基础。免疫组织化学方法检测结直肠癌不同阶段各种组织发现,人精氨酸酶在伴淋巴结转移的结直肠癌原发灶和肝转移灶组织中的表达阳性率显着高于无淋巴结转移的结直肠癌原发灶组织和正常肠粘膜组织。人精氨酸酶的高表达不仅与结直肠癌的发生相关,在结直肠癌的发展转移,特别是淋巴结转移、肝转移中发挥重要作用。人精氨酸酶可能成为结直肠癌淋巴结转移、肝转移、预后评估的候选蛋白标志物。我们对结直肠癌肝转移做了初步的差异蛋白质组学研究,获得了一些差异蛋白,这些蛋白将是我们进一步研究结直肠癌肝转移机理的突破口,更深入的研究这些蛋白质在肿瘤的发生及转移过程中的作用,对揭示肝转移发生的机制和发现新的有意义的肿瘤标志物有一定的意义。本研究发现人精氨酸酶可能成为预测结直肠癌肝转移的标志物,但尚需要大样本多中心的临床实验进一步验证。相信,随着结直肠癌肝转移蛋白质组学研究的深入,肝转移发生机制将进一步阐明,新的有意义的生物标志物将被发现。
曲利娟[5]2007年在《大肠癌同源性细胞株转移相关蛋白的筛选及初步分析》文中提出研究背景与目的大肠癌是全球常见的消化道恶性肿瘤，严重危害人类健康。转移是大肠癌的重要生物学行为，也是肿瘤患者死亡的主要原因之一。因此，确定肿瘤的转移潜能及其相关因素对判断预后、指导治疗、提高生活质量具有十分重要的意义。肿瘤转移过程涉及一系列复杂的分子事件，是多步骤、多因素、多基因共同参与的复杂病理过程，包括转移相关基因的突变、激活，肿瘤细胞的黏附、迁移、增殖，细胞外基质降解，组织免疫性及肿瘤血管形成等变化，并通过细胞基因表达调控机制调节肿瘤转移的发生和发展，最终由功能性蛋白质表达来完成肿瘤转移的全过程。传统意义上，基因组学的研究多数是针对单个或几个致病基因和蛋白质进行分析，而蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的组成和动态变化的一门新兴学科。在疾病的每个病理阶段，蛋白质的组成、表达水平、修饰、细胞内定位以及功能等都是高度动态的，这些变化可能引起细胞功能发生改变。分析和鉴定全部蛋白质功能及变化即是蛋白质组学的目标。有效的蛋白质组学技术能从整体水平上高效、高通量、实时地对肿瘤细胞蛋白质组进行动态分析。蛋白质组学的核心技术是双向凝胶电泳(2-DE)和质谱(MS)，前者是分离复杂组分蛋白质的最常用方法，后者是鉴定感兴趣蛋白质点的有效工具。大量研究显示，2-DE联合MS是分离和鉴定肿瘤差异表达蛋白质最常用的方法。目前，肿瘤蛋白质组学研究已广泛应用于肿瘤生物学标记物的筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗及肿瘤发生机制等方面。国内外学者通过2-DE-MS，发现并初步鉴定出一些与肿瘤转移相关的蛋白质，为深入研究肿瘤转移蛋白质功能奠定了基础。为了筛选重要的大肠癌转移相关蛋白，为临床判断其生物学行为及预后提供较为可靠的指标，本课题利用2-DE联合基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对一对人大肠癌不同转移潜能细胞株进行差异蛋白质组分析和鉴定。方法本研究采用一对国内外通用、来自同一亲本、遗传背景一致的人大肠癌高转移性细胞株SW620和低转移性细胞株SW480为实验对象。首先，利用2-DE技术分离比较SW620和SW480细胞株2-DE差异表达蛋白质图谱；通过Powerlook1100透射扫描仪获取2-DE凝胶银染图像，利用MelanieⅢ对图像进行背景消减、斑点检测、重复性及相关性比较等分析，选取二者差异表达的蛋白质点，作为最终质谱鉴定的对象。其次，利用MALDI-TOF-MS对两种细胞株的差异表达蛋白质点进行质谱分析，获得各蛋白质点的肽质量指纹谱(PMF)；通过Mascot和ProFound软件查询NCBInr数据库，筛选并初步鉴定出与大肠癌转移相关的蛋白质。而后，把SW480细胞株筛选出的特异表达蛋白质钙依赖磷脂结合蛋白Ⅰ(AnnexinⅠ)作为靶蛋白，利用细胞免疫组化和Western免疫印迹验证AnnexinⅠ蛋白在两种细胞株的表达情况。最后，利用核酸原位杂交和免疫组化方法，分别从mRNA和蛋白水平上检测AnnexinⅠ在大肠正常黏膜、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达情况，阐述该基因和蛋白与大肠癌浸润转移的相关性，并探讨其临床意义。结果1．SW620和SW480细胞株2-DE差异表达蛋白质图谱的结果分析MelanieⅢ软件分析3次相同条件下SW620和SW480细胞株2-DE图谱，结果显示重复性、匹配性较好。SW620检测到(1316±62)个蛋白质点，平均匹配率82％：SW480检测到(1332±74)个蛋白质点，平均匹配率80％。蛋白质点pI和Mr分布广泛，以pI4～7、Mr 20～70kDa范围内分布最多。两种细胞株蛋白质点散点图分析结果显示相关系数为0.891，说明二者可比性较强。两种细胞株差异表达蛋白质点有25个，其中11个(SW480.1～SW480.11)仅在SW480中表达，14个(SW620-1～SW620-14)仅在SW620中表达。2．25个差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS分析及数据库鉴定25个差异蛋白质点进行胰酶胶内酶解及MALDI-TOF-MS分析，共获得23张PMF。分别通过Mascot和ProFound软件搜索NCBInr数据库，数据库查询结果：高度匹配已知蛋白质3个，分别是PGAMl、Galectin-1和AnnexinⅠ，初步匹配已知蛋白质或片段14个，未查到匹配已知蛋白质或片段6个。其中高转移性细胞株SW620中人硫氧还蛋白和泛素偶联酶特异性表达，可能对大肠癌转移起促进作用。低转移性细胞株SW480中AnnexinⅠ、Galectin-1、钙调蛋白、主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原、超氧化物歧化酶、Rab相关GTP结合蛋白和cofilin特异性表达，可能对大肠癌转移起抑制作用。在这些差异表达的蛋白质中，部分蛋白质与基因转录、细胞周期、信号转导、细胞凋亡等有关，可能参与大肠癌的分化、增殖、侵袭、黏附和转移等多种生物学行为。提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果，它们通过相应的机制分别或相互协调共同促进或抑制大肠癌的转移。3．免疫组化及Western免疫印迹验证AnnexinⅠ蛋白在SW620和SW480细胞株中的表达AnnexinⅠ在SW480中呈弥漫强阳性表达，而在SW620中呈局灶阳性表达。Western免疫印迹结果显示SW480中AnnexinⅠ的表达强度明显强于SW620。4．免疫组化检测AnnexinⅠ蛋白在正常大肠黏膜、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达及临床意义在蛋白水平，AnnexinⅠ在正常组不表达，而在大肠癌无转移组和转移组中表达上调，叁组表达差异具有显着性(H=19.801，P=0.000)。表达与大肠癌淋巴结转移呈正相关性(Z=-2.554，P=0.011)，但表达与大肠癌不同组织学类型(H=0.678，P=0.839)和不同病理分级(H=0.470，P=0.747)均无相关性。大肠癌转移组中原发癌和淋巴结转移癌表达差异无显着性(Z=-0.737，P=0.461)。5．核酸原位杂交检测AnnexinⅠmRNA在正常大肠黏膜、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达及临床意义在mRNA水平，AnnexinⅠ在正常组全部表达，而在大肠癌无转移组和转移组中表达下调，叁组表达差异具有显着性(H=23.714，P=0.000)。表达与大肠癌不同病理分级相关(H=5.813，P=0.034)，但表达与大肠癌不同组织学类型(H=4.916，P=0.128)及有无淋巴结转移(Z=-0.908，P=0.364)均无相关性。大肠癌转移组中原发癌和淋巴结转移癌表达差异无显着性(Z=-0.825，P=0.409)。结论1．蛋白质组学技术是快速、有效筛选大肠癌转移相关蛋白的理想方法。本课题应用2-DE技术，获得了分辨率高、重复性好的人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480蛋白质表达图谱。2．人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480具有明显的差异表达蛋白质图谱，共分离鉴定出9种可能与大肠癌转移相关的蛋白质。其中，高转移性细胞株SW620中人硫氧还蛋白和泛素偶联酶特异性表达，可能对大肠癌转移起促进作用。低转移性细胞株SW480中AnnexinⅠ、Galectin-1、钙调蛋白、主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原、超氧化物歧化酶、Rab相关GTP结合蛋白和cofilin特异性表达，可能对大肠癌转移起抑制作用。提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果，它们通过相应的机制分别或相互协调共同促进或抑制大肠癌的转移。3．细胞免疫组化和Western免疫印迹证实低转移性细胞株SW480 AnnexinⅠ蛋白表达强于高转移性细胞株SW620。4．AnnexinⅠ蛋白表达与大肠癌发生发展和转移密切相关，与不同组织学类型和肿瘤分化程度无关。AnnexinⅠ蛋白可作为反映大肠癌生物学行为和判断预后的重要指征，并为大肠癌特异性基因治疗提供有价值的理论依据。5．AnnexinⅠmRNA表达与大肠癌发生及肿瘤分化程度密切相关，但与大肠癌有无淋巴结转移和不同组织学类型无关。
崔丹瑜[6]2007年在《应用蛋白指纹图谱技术对大肠癌及其肝转移蛋白质组的研究》文中进行了进一步梳理目的：应用蛋白质指纹图谱技术(surface-enhanced laser desorption／ionizat ion time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)对比分析大肠癌肝转移患者、大肠癌患者与健康对照者的血清蛋白质分子含量，从中筛选出大肠癌肝转移患者血清特异性相关蛋白，从而寻找大肠癌肝转移的特异性生物标志，并利用计算机软件构建大肠癌肝转移的诊断模型，对于大肠癌肝转移的诊断及预后的评估有重要临床意义。方法：128例血清标本，其中健康对照者48例，大肠癌患者44例，大肠癌肝转移患者36例。大肠癌患者中包括直肠癌患者有28例，结肠癌患者16例。均经过术后组织病理诊断。大肠癌肝转移组有36例，均经过影像学检查或病理确诊。各组病例中均无影响血清中蛋白质含量的其它相关性疾病。采用美国Ciphergen公司的IMAC3(Immobilized Metal Affinity Capture，金属亲和表面)芯片和表面增强激光电离及解析飞行时间质谱仪检测48例健康对照者，44例大肠癌患者及36例大肠癌肝转移患者血清中的蛋白质相对含量。设定所有血清样本检测的蛋白质分子量区间在1，500～20，000 Da。利用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪对IMAC 3芯片进行检测，所得到的蛋白质以波谱的形式表示。用飞行质谱仪对大肠癌患者、大肠癌肝转移患者、健康对照者等叁组血清进行质谱检测，再分5组进行差异性蛋白分析比较：①大肠癌组、大肠癌肝转移组。②健康对照组、大肠癌组。③健康对照组、大肠癌组、大肠癌肝转移组。④大肠癌Dukes B期组、大肠癌肝转移组。⑤大肠癌Dukes C期组、大肠癌肝转移组。采用Biomarker Wizard软件对每个组合内的相同质荷比不同蛋白含量进行分析比较，找到组合内蛋白含量有显着差异的质荷比。将组合内含量有显着差异(P＜0.05)的蛋白质建立数据库，并导入Biomarker Pattern统计分析软件进行分析，选择相应条件，对其进行分组统计，从而得到能够正确分组的特异性蛋白标志物并利用特异蛋白标志物构建大肠癌肝转移的诊断模型。另外再收集大肠癌肝转移患者27例，均经过影像学检查确诊，未经放化疗及其他治疗手段干预。用Biomarker Pattern软件对大肠癌与大肠癌肝转移组已建立的决策树状诊断模型中的验证模式对这27例大肠癌肝转移患者进行验证检测。其结果与血清CEA检测结果比较。CEA检测按照癌胚抗原(CEA)酶联免疫检测试剂盒说明书进行操作，参考值为5.0ng／ml。检测同一批血清标本中的CEA水平，与构建的诊断模型在大肠癌肝转移诊断中作比较。结果：①大肠癌组、大肠癌肝转移组：血清蛋白质在质荷比为M2685至M11813间有差异的蛋白质峰为25个，有9种蛋白含量差异有统计学显着性(P＜0.05)，有5种蛋白在大肠癌肝转移组明显高表达，其余4种蛋白低表达。对此构建了以相对分子量为M5909、M5341、M2685、M2871、M3928、M6635、M8933蛋白质组成的诊断模型。其中44例大肠癌患者中有38例患者被正确分组，36例大肠癌肝转移患者被正确识别，准确率为92.5％(74／80)，用本诊断模型诊断得出灵敏度和特异度分别为100％(36／36)，86.36％(38／44)。②健康对照组、大肠癌组：检测到18种蛋白含量差异有统计学显着性(P＜0.05)。选择其中3个质荷比作为生物标志物构建出最佳的大肠癌肝脏转移诊断模型。其准确率为97.83％(90／92)，灵敏度为95.45％(42／44)，特异度100％(48／48)。③健康对照组、大肠癌组、大肠癌肝转移组：血清经蛋白芯片检测分析对比共检测出29个质荷比在叁组蛋白含量中有差别，其中22个质荷比的蛋白含量差异有统计学显着性(P＜0.05)，根据软件分析选择其中12个质荷比作为生物标志物构建出最佳的大肠癌肝脏转移诊断模型。其准确率为96.9％(124／128)，灵敏度为91.67％(33／36)，特异度98.91％(91／92)。④大肠癌Dukes B期组、大肠癌肝转移组：检测到11个质荷比的蛋白含量差异有统计学显着性(P＜0.05)。选择11个质荷比作为生物标志物构建出最佳的大肠癌肝脏转移诊断模型。其准确率为90.32％(56／62)，灵敏度为88.89％(32／36)，特异性92.31％(24／26)。⑤大肠癌Dukes C期组、大肠癌肝转移组：检测到11个质荷比的蛋白含量差异有统计学显着性(P＜0.05)。选择其中3个质荷比作为生物标志物构建出最佳的大肠癌肝脏转移诊断模型。其准确率为100％(48／48)，灵敏度为100％(36／36)，特异度100％(12／12)。⑥应用CEA血清检测作为对照比较，本实验方法诊断大肠癌肝转移的灵敏度和特异度分别为85.19％(23／27)，70.37％(19／27)。两种检测结果用四格表X~2检验分析，X~2=1.714，v=1，P=0.190(双侧)，差异无显着性意义。结论：本研究旨在通过对血清中蛋白质组的质谱分析来发现可用于大肠癌肝转移诊断的蛋白质组构型。利用SELDI-TOF-MS技术对健康对照组，大肠癌组和大肠癌肝转移组患者的血清中的蛋白质相对含量进行分析对比，筛选可用于临床大肠癌肝转移早期诊断的特异生物标记物。该方法与传统肿瘤标志物CEA检测比较，具有操作简便、快速、敏感性、特异性高等特点，两种方法的比较无显着性差异，考虑是由于样本量少所致。本实验方法筛选出的生物标志物可以快速、准确地诊断大肠癌肝转移，对大肠癌转移及预后的评估有重要临床意义。该技术有望成为临床早期诊断大肠癌肝转移快速、高效、灵敏的检测手段。
李俊材[7]2008年在《结肠癌肝转移相关蛋白的比较蛋白质组学研究》文中指出细胞转移是恶性肿瘤的重要特征。肝脏是大肠癌转移最常见的器官。几十年来,关于结肠癌肝转移的临床诊治及基础研究做了大量工作,但其总体预后并未得到显着改善,难以早期诊断而失去手术时机是重要原因之一。血液组分变化可充分反映机体生理、病理过程,容易获取并易于监测,故一直是筛选疾病诊断标志物的最佳研究对象。目前常用的结肠癌肝转移血清标志物尚不能完全满足临床需求,因此,从血清中筛选新的结肠癌肝转移标志物受到医学研究人员和临床医生的高度关注。目前蛋白质组学(Proteomics)已成为后基因时代生命科学研究新的热点,其定义为:研究一个细胞、组织或完整机体在某个特定时空条件下全部蛋白质的表达、功能及其相互作用方式。其特点是以系统生物学的研究思路,采用高分辨率的蛋白分离手段和高通量的蛋白鉴定技术,全景式地研究各种特定情况下的蛋白表达谱。不断发展、完善的蛋白质组学研究策略与技术正成为现代生物医学研究新的强有力工具。从血液中寻找特异性生物标志物用于结肠癌肝转移等诊断是目前临床急需解决的难题,本研究使用差异蛋白质组技术包括双向凝胶电泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱( Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-time of flight, MALDI-TOF)技术对结肠癌肝转移患者和结肠癌患者血清蛋白进行分析,获得了一些可能与结肠癌肝转移相关的标志蛋白质,推测其差异蛋白质的功能,并从蛋白质整体水平上探讨这些差异候选蛋白质是否与结肠癌可能的发生或转移机制相关,并为开展临床早期诊断、寻找治疗靶点等方面提供有价值的理论依据。第一部分结肠癌和结肠癌肝转移患者血清样品的处理目的:纯化血清蛋白质,减少高丰度蛋白对电泳的干扰。方法:参照人类蛋白质组研究组织(Human Proteomo Organization, HUPO)的血清蛋白质组计划(Plasma Protemo Project,PPP)所推荐的方法采集血液标本,利用PPP推荐使用的多种蛋白质亲和清楚系统(Multiple Affinity Removal System,MARS)同时去除血液中的多种高丰度蛋白质,并通过蛋白电泳图谱比较前后的血清蛋白分离情况。结果:使用了蛋白清楚系统去除血清高丰度蛋白后,血清蛋白点数由530个增加到810个,建立了稳定的血清白蛋白和IgG去除方法。结论:多种蛋白质亲和清楚系统能有效去除血清中的高丰度蛋白,减少了高丰度蛋白对其的干扰。第二部分结肠癌肝转移患者血清双向电泳图谱的建立及优化目的:建立并优化血清蛋白质组双向电泳分离技术。方法:对2-DE的各种条件进行调整、优化,通过双向电泳图谱比较各种方法对血清蛋白的分离效果。结果:采用pH4-7胶条,含尿素9M、硫脲2M的上样缓冲液,12.5%的SDS-PAGE胶提高了血清蛋白的分离效果。结论:血液中高丰度蛋白质的去除能提高了2-DE图谱的斑点数和分辨率。成功建立了血清蛋白质的纯化技术,为寻找疾病的血清学标志物的研究奠定基础。第叁部分结肠癌肝转移相关蛋白质的鉴定目的:分析结肠癌和结肠癌肝转移血清的蛋白质表达差异。获取两者蛋白表达差异。方法:使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱对结肠癌和结肠癌肝转移患者血清的双向电泳图谱中的差异蛋白质点进行鉴定。结果:成功鉴定出TGF-β1、Geranylgeranyl transferase type-1等6个蛋白在结肠癌肝转移组血清中表达上调,Protein kinase C等4个蛋白在对照组血清中表达上调的蛋白质。结论:结果表明在结肠癌肝转移患者和结肠癌患者中存在差异表达蛋白质,利用蛋白质组学这一高通量的筛查技术可望从中发现与结肠癌肝转移相关的标志物。
孙校男[8]2013年在《辅助期大肠癌中医证候研究》文中指出背景：大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,目前治疗包括手术、化疗、放疗及靶向生物治疗,疗效未达到预期效果。中医药治疗能改善病人的生活质量,延长生存期,预防肿瘤的复发和转移。我们经过多年临床治疗与研究,发现实体肿瘤具有典型的四个阶段,即围手术期、辅助治疗期、随访观察期及姑息治疗期,各有不相同的证候特点,故提出大肠癌的中医治疗应按四个阶段分论。中医药治疗大肠癌的核心和关键是辨证论治,证候是治疗的基础和前提。证候研究是中医基础理论研究的核心内容。证候研究主要分本质研究与证的规范化研究两个方面方面。以往研究大肠癌是回顾性研究且作为一个均质体,个人主观性强,因而缺乏可信性。对于大肠癌证本质的研究涉及指标多,重复性差,不符合中医的整体观思想。目的：运用数理统计方法,客观总结辅助治疗期大肠癌患者各中医证候特点,为大肠癌中医证候诊断提供循证医学依据。应用血清蛋白质组学技术,从蛋白质组的差异表达角度揭示辅助治疗期大肠癌各证的分子生物学基础。方法：本研究对179例辅助治疗期大肠癌病例进行横断面、前瞻性调查,应用聚类分析归纳出辅助治疗期大肠癌中医证型,主成分分析方法探索大肠癌各证的症状,及其对该证的贡献度。对32例辅助期大肠癌湿热蕴结证、肝肾阴虚证、脾虚湿阻证及无症状组患者血清以双向凝胶电泳分离,双向电泳后经不同波长光激发扫描得到不同样品的蛋白质组图谱,经DeCyder Image QuantTM V6.5软件分析,选择表达与无症状组相差均达1.2倍以上的蛋白作为差异蛋白,并进行质谱鉴定。结果：1.对179例辅助治疗期大肠癌病例进行聚类分析,并结合中医理论和临床经验,将其中医证候分为四类,分别是：湿热蕴结大肠证、气血亏虚证、肝肾阴虚证、脾虚湿阻证,并运用主成分分析归纳出上述四类证候的主要临床症状。2.经蛋白质组学分析,最终被确定的差异蛋白质有11个：前白蛋白原、硫酸酯糖蛋白-2、血清结合素前体、β-GDP解离抑制因子、锌指蛋白416、载脂蛋白A-I前体、簇蛋白、CD5分子样前体、转铁蛋白、触珠蛋白和维生素D结合蛋白。结论：1.聚类分析及主成分分析可用于辅助治疗期大肠癌中医辨证分型,今后可进行多中心、大样本的流行病学调查,规范辅助治疗期大肠癌的证型,对临床治疗有指导意义。2.初步证实大肠癌的不同证型可能相同蛋白质表达量引起,是该证型的分子生物学基础。
陈远光[9]2003年在《人大肠癌组织蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立及应用》文中指出第一部分：人大肠癌组织二维凝胶电泳技术的建立 目的 应用二维凝胶电泳技术研究人大肠癌组织的蛋白质组比研究细胞系或动物的蛋白质组更为重要，但是目前国外应用二维凝胶电泳技术研究人大肠癌组织的报道较少，国内尚无报告。本部分旨在建立分辨率高、重复性好的大肠癌组织二维凝胶电泳实验技术，为进一步研究大肠癌组织的蛋白质组提供基础。 方法 样品的处理中比较分析组织和裂解液的不同体积比例关系、不同的裂解液(添加和不添加2M硫脲、2％TritonX-100)、不同的蛋白上样量(200μg、400μg、600μg)所产生的结果；第一向电泳采用固相pH梯度等电聚胶，并比较确定时间-电压程序；在第二向电泳中采用垂直的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术。对各程序进行了比较分析后，采用优化的程序进行二维电泳，并用ImageMaster 2D Elite专业软件分析优化程序后获得的图谱，进行图象质量分析。 结果 在组织和裂解液的体积比例关系以1：8的比例较为合适；添加2M硫脲、2％TritonX-100两种成份的裂解液所产生的2-DE斑点数要比不含该两种成份的裂解液所产生的斑点数要多；蛋白上样量为400μg时图象质量最佳；等电聚胶时间电压程序30V16hr、500V1hr、1000V1hr、3500V1hr、8000V6hr共53480Vhr水平拖迹现象大大减少。应用ImageMaster 2D Elite专业分析软件对优化程序后3次实验获得的二维电泳图谱进行初步分析，总蛋白质斑点平均数1086±64个，蛋白质位置在IEF方向平均偏差为1．98±0．39mm，SDS-PAGE方向为1．81±0．26mm，蛋白质表达量相对标准差为7．67％±2．75％；对不同丰度蛋白质的代表点的表达量、峰高、面积和分子量等参数进行分析处理，显示出良好的可比性。 结论 对人大肠癌组织第一向电泳采用固相pH梯度等电聚胶，第二向电泳中采用垂直SDS-PAGE电泳技术，通过调整组织和裂解液的体积比例，裂解液中增加添加2M硫脲和2％TritonX-100，蛋白上样量为400μg，优化等电聚胶时间电压程序等可以成功地获得分辨率高、重复性好的二维电泳图谱，能够用于蛋白质组研究。
梁莉[10]2003年在《大肠癌转移相关基因在RNA水平和蛋白质水平上的差异筛选》文中指出研究背景： 大肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，转移是大肠癌患者死亡的主要原因。确定有无转移及其影响因素是判断患者预后、指导治疗的重要指标。因此，探讨与大肠癌转移相关的因素，寻找预防和治疗的有效途径，是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。 肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程。研究表明其每一阶段都受着许多特殊基因的调控，主要分为促进转移发生的转移基因和抑制转移发生的转移抑制基因两大类，它们相互协同或拮抗，最终影响肿瘤细胞的生物学特性。 目前报道的参与大肠癌转移调控的基因已达百种，这些基因已为阐述大肠癌转移的分子机制提供了重要的线索，但仍远远不能解释转移过程的复杂性和多样性；再加上这些基因研究的检测手段多限于一种或几种基因的表达，不能全面反映各基因间的关系及发现未知基因，因此寻找一种全面、高效、便捷的分析方法就成为解决这一问题的关键。 对差异基因进行克隆与功能研究是了解肿瘤发生发展过程的重要策略，新近发展的几种差异表达分析技术如抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)、双向电泳(Two Dimensional Gel Electrophoresis，2-DE)、质谱(Mass Spectrometry，MS)等技术为阐述肿瘤发生发展的分子机制、克隆目的基因及发现新基因提供了重要手段。复杂生物体的差异基因表达分析涉及转录组和蛋白质组方法，它们在方法学上各有优势和不足。两者的结合应用，是全面、系统阐述肿瘤转移机制的有效途径。 目的与方法： 本研究采用一对国内外通用、遗传背景一致、人大肠癌高转移能力细胞株SW620和低转移能力细胞株SW480为实验对象，首先通过绘制生长曲线、体内转移及体外侵袭实验，观察长期传代对其转移表型的保持有无影响;其次，在RNA水平上，利用SSH和蓝白斑筛选技术构建大肠癌转移相关基因消减cDNA文库，再通过Difl七rentiai screening(Ds)和Nodhem Bfot对部分阳性克隆进行筛选验证，并对获得的差异片段的性质或功能进行初步分析;最后，在蛋白质水平上，利用2一DE技术获得两种细胞株的蛋白表达谱，通过软件分析选取一些蛋白差异点，酶解后利用MS初步确定其性质。本研究不仅有利于阐述大肠癌转移的分子机理，还能提供新的网上信息资源，并有望为临床上早期诊断、药物筛选和预后判断寻找新的靶点。结果:1.大肠癌转移性细胞株相关生物学特性的研究 人大肠癌高转移细胞株SW620的体外增殖能力高于低转移细胞株SW480;体内成瘤及自发转移实验验证了SW620细胞株的转移能力高于SW480;体外侵袭实验提示S丫V48O细胞株的侵袭能力高于SW620，与国外学者的报道相符，但与体内研究结果不一致。 经过体外长期传代，本研究所用的一对转移性人大肠癌细胞株仍具有转移表型的差异，它们是进行晚期结肠癌遗传学改变研究的一种重要实验模型;细胞体内外实验结果的不一致提示粘附、运动机制及宿主内环境影响等可能是造成这种差异的原因之一。2.利用SSH和DS技术筛选大肠癌转移相关基因 首次构建了人大肠癌转移促进基因或抑制基因的两个消减cDNA‘文库，分别含有235个和232个白色克隆。两个文库中，90%以上的白色克隆均含有插入片段。 部分阳性克隆经过筛选验证后，共获得了25个差异表达基因，10个为已知基因，其中5个基因在高转移细胞株SW620中差异表达，可能有促进转移的作用，包括热休克蛋白10(Heat shock Proteinlo，HsP10)、细胞色素氧化酶现仁ytochrome C Oxidasen，。。xll)、有丝分裂调控蛋白dis3人同源物(M itotic control阮tein由53 homolog，Dls3)、x连锁的人核糖体蛋白54(几bosomal Protein S4X一linked，RPS4X)及血浆淀粉样蛋白A(S erum amylofdA，SAA);另外5个基因在低转移细胞株SW480中差异表达，具有潜在的转移抑制作用，包括Tomoregulln、真核翻译起始因子4A(Euk川了otic Translation Initiation Factor 4A，EIF4A)、人细胞色素氧化酶m的类似物(51而lar to eytoe腼me e oxidasem，CoXm)、谷肤甘肤S转移酶3( GhitathioneS一transferase mu3，GSTM3)及线粒体nNA (Mitoehondrion DNA，mtDNA)。以上10个已知基因，基本上是一些与细胞生长分化、代谢合成、转录、凋亡及信号转导等相关的基因，其功能的多样性也证实了肿瘤转移机制的复杂性;除DIS3与SAA外，其余基因与大肠癌转移的关系在本研究中首次被报道，它们大多不同程度地参与了多种肿瘤的癌变过程，说明肿瘤的发生发展是个持续的、逐步累积的过程;其功能还需结合其它方法进一步验证。 本研究筛选出的巧个未知基因，已被GeneBank dbEST库收录，登录号为CD485499一CD485513，其中有6个基因定位于5号染色体上。以上基因的性质和功能还有待进一步研究。3.利用2-DE和MS技术筛选大肠癌转移相关蛋白 首次获得两种转移性大肠癌细胞株的2一DE蛋白表达谱，具有良好的重复性和可比性;采用非线性PH3一10及重迭窄范围的固相PH梯度 (Lnmobilized PH Gradients，IPG)胶条，提高了2一DE的分
参考文献：
[1]. 应用双向电泳技术对大肠癌肝转移蛋白质组表达差异及其意义的研究[D]. 张英男. 第叁军医大学. 2003
[2]. 肿瘤生物标志物与肿瘤转移[C]. 佚名. 第叁届中国肿瘤学术大会论文集. 2004
[3]. 大肠癌发生与肝转移蛋白质组表达差异及其意义的研究[D]. 白雪. 第叁军医大学. 2005
[4]. 结直肠癌发生和肝转移相关蛋白质差异表达及其意义的研究[D]. 白雪. 第叁军医大学. 2008
[5]. 大肠癌同源性细胞株转移相关蛋白的筛选及初步分析[D]. 曲利娟. 南方医科大学. 2007
[6]. 应用蛋白指纹图谱技术对大肠癌及其肝转移蛋白质组的研究[D]. 崔丹瑜. 第一军医大学. 2007
[7]. 结肠癌肝转移相关蛋白的比较蛋白质组学研究[D]. 李俊材. 重庆医科大学. 2008
[8]. 辅助期大肠癌中医证候研究[D]. 孙校男. 浙江中医药大学. 2013
[9]. 人大肠癌组织蛋白质组二维凝胶电泳技术的建立及应用[D]. 陈远光. 中南大学. 2003
[10]. 大肠癌转移相关基因在RNA水平和蛋白质水平上的差异筛选[D]. 梁莉. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
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