基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用

论文摘要

为了建立一种敏感和特异的猪圆环病毒3型（PCV3）抗体检测方法,对PCV3-Cap蛋白抗原表位预测发现其抗原表位多聚集在C端（羧基端）,而N端前33氨基酸为核定位序列。以截断N端前120个氨基酸后的PCV3ORF2序列为靶基因,设计引物。以PCV3阳性病料为模板,PCR扩增截短的ORF2基因,并将其克隆至pET-30a载体构建重组质粒,并转染至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得重组菌后选择最佳诱导表达条件,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组Cap蛋白作为包被抗原,建立PCV3间接ELISA （indirectELISA）诊断方法,并初步用于临床样品检测。结果:从阳性病料中扩增出大小为285bp的PCV3ORF2基因片段,重组质粒经双酶切和测序鉴定构建成功。采用1mmol·L-1 IPTG诱导,在37℃条件下培养6h重组菌,重组蛋白获最佳表达。Western blot结果表明,该重组蛋白与PCV3阳性血清具有较好的反应原性。ELISA的最佳包被抗原质量浓度为1μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶20,酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000。阳性判定值为S/P≥0.273。批内和批间系数均小于10%,表明该方法具有较好的重复性。PCV2阳性血清用本方法检测为阴性,表明该方法有较好的特异性。检测采集的439份临床猪血清,PCV3抗体阳性检出率为60.59%（266/439）。结果表明,本研究建立了一种快速、简便、敏感、特异的猪圆环病毒3型（PCV3）抗体检测方法。

论文目录

1材料与方法

1.1质粒、器材及血清

1.2试验方法

1.2.1引物设计

1.2.2重组质粒pET-30a-ORF2的构建

1.2.3重组PCV3Cap蛋白的表达纯化及鉴定

1.3间接ELISA诊断方法的建立

1.3.1抗原最佳包被浓度和待检血清稀释度的选择

1.3.2抗原最佳包被条件和最佳封闭液条件的选择

1.3.3待检血清（一抗）最佳孵育时间和最佳二抗孵育时间的选择

1.3.4最佳显色时间的选择

1.3.5临界值的确定

1.3.6重复试验

1.3.7实验室特异性试验

1.3.8临床血清样品检测

2结果

2.1目的基因的扩增和重组质粒pET-30a-ORF2的构建

2.2重组蛋白的表达、纯化及SDS-PAGE和Western blot鉴定

2.3重组蛋白抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定

2.4抗原最佳包被条件和最佳封闭液条件的确定

2.5血清最佳作用时间和酶标抗体最佳作用时间的确定

2.6最佳显色时间的确定

2.8重复试验

2.9特异性试验

2.10临床血清样品检测

3讨论

4结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王俊伟,陈芳洲,库旭钢,李畅,何启盖

关键词: 猪圆环病毒型,基因,蛋白,原核表达,检测

来源: 畜牧兽医学报 2019年02期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,华中农业大学动物医学院,湖北省预防兽医学重点实验室,生猪健康养殖协同创新中心

基金: 国家生猪产业技术体系(CARS-35)

分类号: S852.651

页码: 454-460

总页数: 7

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基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用

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