赵红玲[1]2004年在《利用毕赤酵母发酵表达植物甜蛋白（Brazzein）的初步研究》文中研究表明近年来从非洲植物中提取出了一些甜味蛋白，作为一种天然非糖类的甜味剂,其具有高甜味、低热卡、无毒安全、多功能等优点, 不会导致龋齿和肥胖症，糖尿病患者也可以食用。但是由于提取资源有限，利用基因工程的方法生产甜味蛋白，具有重要的现实意义。本文研究的植物甜蛋白（Brazzein）是甜味蛋白中分子量较小的一员，仅为6.4kD，由54个氨基酸残基组成，它的相对甜度是蔗糖的2000倍，而且具有良好的热稳定性。已有人成功的利用大肠杆菌和转基因植物实现了表达。毕赤酵母是一种可以以甲醇为唯一碳源的非常规酵母，具有强有力的AOX启动子，可将外源基因整合到宿主的染色体上，继代十分稳定，蛋白可以分泌表达，实现高密度发酵，因此毕赤酵母是一种高效蛋白表达体系。本文采用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastori）GS115作为宿主菌进行了表达植物甜蛋白（Brazzein）的初步研究。将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒电导入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastori）GS115中,并从22个His＋Muts阳性克隆中筛选出高拷贝转化子2个，将其诱导分泌表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，目标蛋白分子量与理论值一致；对发酵条件进行了优化，采用YPG作为种子液，确定了微量元素加入量为4ml/L，6％（w/v）的甘油，（NH4）2SO4 10g/L的培养基新配比，在28℃、pH5.0下培养，每24h加入0.5％(v/v)的甲醇进行诱导为最佳。该条件用于指导小试（5L/10L罐），蛋白表达量达到了385mg/L；采用等电沉淀、大孔树脂、
王长远[2]2008年在《甜味蛋白Brazzein酵母表达系统的建立》文中研究表明甜味蛋白是一类天然非糖类甜味物质,具有高甜度、低热卡、无毒安全、多功能等优点。Brazzein甜味蛋白是1994年从非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实中分离提纯得到,其甜度是等质量蔗糖的2000倍。到目前发现的7种甜蛋白中,Brazzein分子量最小,仅为6.5kD,它具有良好的水溶性,其结构相对简单并具有良好的热稳定性和pH稳定性,这些特性可有效解决目前甜蛋白应用过程中稳定性差,提取、加工困难等的问题,应用前景十分广阔。但天然产生的Brazzein资源有限,提取、分离成本昂贵;目前利用生物工程获得甜味蛋白的的研究中,原核系统表达获得的甜味蛋白易形成包涵体,表达的目的蛋白生物活性低或无生物活性;而用毕赤酵母表达系统获得Brazzein的报道较少。本研究采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建高效、分泌型的Brazzein毕赤酵母表达系统。根据文献报道Brazzein的氨基酸序列,按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因。敲除N端第一个氨基酸,同时将Brazzein蛋白中的第29位的天冬氨酸(Asp)变为天冬氨酰(Asn),41位的谷氨酸Glu(E)变为赖氨酸Lys(K),并根据表达载体pGAPZαA多克隆位点特点以及Brazzein基因酶切特性,设计4对引物,在上、下游引物分别引入Xba I与Xho I酶切识别位点。采用SOE-PCR法人工合成甜蛋白Brazzein基因,构建克隆载体pUC57- Bra,通过PCR、酶切和测序鉴定后,将正确的Brazzein基因克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,经鉴定,结果表明成功构建了pGAPZαA-Bra酵母表达载体。将重组质粒经限制性内切酶AvrⅡ线性化,用电转化的方法导入Pichia. pastoris SMD1168中,整合到毕赤酵母染色体的高效启动子3,-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的下游。用高浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子,用Brazzein基因特异引物进行PCR鉴定,结果证明已获得整合型阳性重组菌株,命名为SMD1168/pGAPZαA-Bra。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,筛选菌株后进行大规模培养,通过收集不同时间段的表达产物,进行SDS-PAGE分析表明,在诱导72h后目的蛋白表达量最大,达0.12g/L,表达蛋白的分子量约为6.5KD左右。对纯化后的蛋白进行了生物活性测定,经品尝鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好。综上所述,本研究成功构建了甜蛋白的真核表达载体pGAPZαA-Bra,并在SMD1168酵母受体菌中成功表达,为甜蛋白的进一步研究与应用打下了坚实基础。
朱丽[3]2004年在《甜蛋白Brazzein在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达》文中进行了进一步梳理Brazzein 是一种高甜度的耐热甜味蛋白,1994 年从非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon 的果实中分离提纯得到。其甜度是等质量蔗糖的2000 倍。在七种植物甜蛋白中Brazzein 分子量最小,它具有良好的水溶性,其结构相对简单并具有良好的热稳定性和pH 稳定性,这些特性可有效解决目前甜蛋白应用过程中稳定性差,提取、加工困难等的问题,应用前景十分广阔。但天然产生的Brazzein 产量有限,提取、分离成本高昂;而目前关于Brazzein 基因工程的研究中,只有在大肠杆菌中与葡萄球菌核酸酶一起表达得到的融合蛋白,表达产生包涵体,分离纯化困难。这些因素都限制了甜蛋白的广泛应用。巴斯德毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)是近些年来发展完善、应用广泛的真核高效表达系统,已有许多有应用价值的外源基因成功地在其中表达。本研究的目的是利用巴斯德毕赤酵母表达系统,构建高效、可分泌表达甜蛋白Brazzein 的毕赤酵母工程菌,从而可用人工的方法得到有甜味活性的Brazzein,解决Brazzein 天然产量低、分离纯化困难两大问题。根据天然Brazzein 氨基酸序列,用毕赤酵母偏爱密码子,人工设计并合成brazzein 基因。考虑到克隆方便,在序列5’端和3’端分别引入BamHI和EcoRI 位点,并在两个酶切位点的外侧分别加上保护碱基。为了保证brazzein 基因按正确的阅读框架融合到毕赤酵母高效表达载体pPIC9K 上的α-因子信号肽的切割位点之后,基因序列前重建XhoI 位点和α-因子信号肽切割位点(Lys Arg)的编码序列。为了避免brazzein 基因分泌表达载体构建过程中的部分酶切。本研究设计并构建了中间重组载体pUC19S。pUC19S 的构建过程为:用pPIC9K 上游的5’AOX1 primer 引物和下游TT 终止子中的3’AOX1 primer 引物对载体pPIC9K 进行PCR 反应,获得pPIC9K 上编码信号肽的基因序列(S);
赵红玲, 陈劲春[4]2005年在《利用毕赤酵母表达植物甜蛋白(brazzein)的初步研究》文中研究指明实验将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德比赤酵母(Pichiapastori)GS115中,并从22个阳性克隆中筛选出His+Muts高拷贝转化子2个,经诱导表达,产物进行Tricine SDS PAGE电泳鉴定,目标蛋白的相对分子量与理论值一致,又经小试(5～10L罐)蛋白产量可达385mg/L。利用大孔树脂D152初步分离,得到有微甜味的产物。进一步纯化后获得了1D NMR图谱。
徐爱才[5]2011年在《甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵培养基》文中认为本研究利用毕赤酵母表达系统构建了高效胞内表达甜蛋白Monellin工程菌,采用响应面法对毕赤酵母发酵基础盐培养基进行了优化,并通过5L发酵罐培养比较工程菌在优化前后培养基中Monellin表达产量。1根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了单链甜蛋白Monellin基因,并在基因的5’端加有碱基ACG后克隆到pUC18载体上。以载体pUC18-Mon为模板,PCR扩增了Monellin基因,并在上游引物引入BspT104I酶切位点,下游引物引入KpnI酶切位点,通过BspT104I和KpnI酶切位点将Monellin基因克隆到载体pPICZaA,得到重组质粒pPICZA-Mon,质粒经SacI酶切线性化后,电击转入毕赤酵母宿主菌GSll5,得到工程菌GS115-pPICZA-Mon。通过PCR验证得到阳性转化子,通过甲醇诱导后,发酵产物经TrincneSDS-PAGE检测表明甜蛋白Monellin在毕赤酵母中胞内表达成功。2采用DesignExpert7.0软件,利用响应面法对毕赤酵母发酵盐培养基进行优化。首先用P1ackett-Burman方法研究发酵培养基各成分对响应值的影响,结果表明酵母提取物、硫酸钙和磷酸缓冲液为叁个主要因素;利用最陡爬坡法逼近最大响应区域;最后通过中心组合设计和响应面分析得到最优培养基组成为:6g/L酵母提取物,0.3g/L硫酸钙,4.5g/L硫酸镁,40g/L甘油,12.5g/L硫酸铵,7.7%100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)。在优化培养基条件下培养,工程菌生物量增加0.5倍。3以摇瓶优化得到的发酵盐培养基为基础,在德国Bamn公司5L发酵罐上进行补料-分批发酵。甘油耗尽后开始补加甘油,当菌体浓度OD600达到200左右时开始补加甲醇甘油混合物,4-5h后开始补加甲醇进行诱导,整个过程维持DO大于20%,发酵72h后,最终菌体光密度OD600达到521,甜蛋白Monellin表达量达1.2g/L。
李敏[6]2003年在《高甜度monellin基因和透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中的表达》文中研究说明monellin是一种高甜度、低热量、口味纯正、安全无毒的蛋白甜味剂，应用前景十分广阔。但其天然植物来源非常有限，现有的基因工程菌又存在产量低，胞内表达提取困难的问题，从而限制了monellin的规模生产和广泛应用。 本研究拟以拥有自主知识产权的高甜度monellin基因，利用毕赤酵母表达系统，构建高效表达、有效分泌高甜度monellin的重组毕赤酵母生物反应器。以期解决目前monellin基因工程菌存在的单产低、从胞内提取困难的两大难题。同时探讨vgb基因在毕赤酵母中的功能，并应用于高甜度monellin重组酵母，解决毕赤酵母高密度发酵中存在的供氧不足的问题，进一步提高高甜度monellin的产量。 首先，采用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成了高甜度monellin基因，并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M，通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M。高甜度monellin的摇瓶表达量约0.25g/L。目前涉及monellin分泌表达的研究报道中，表达产物没有甜味活性。 同时，采用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成了透明颤菌血红蛋白基因(vgb)；并构建了vgb基因的酵母胞内表达载体pPIC3.5KV，通过电击转化获得了能在胞内表达有生物活性VHb的重组毕赤酵母GS115/pPIC3.5KV。这种新型重组菌在贫氧条件下，与现有的毕赤酵母宿主菌相比具有明显的生长优势，更适于高密度发酵和用作表达外源蛋白的宿主。目前尚未见vgb基因在毕赤酵母中表达的研究报道。 进一步通过电击转化将vgb基因整合到重组酵母GS115/pPIC9M的基因组中，获得了由高甜度monellin和vgb两个基因同时整合的重组酵母GS115/pPIC9M/pPIC3.5KV。经甲醇诱导，高甜度monellin基因和vgb基因分别以分泌和胞内的形式得到表达，且表达产物均有生物活性。VHb在胞内的成功表达，使重组毕赤酵母高甜度monellin的分泌表达量提高了20%，达0.3g/L。目前尚未见将rgb基因用于提高毕赤酵母中外源蛋白表达的研究报道。 以重组酵母GS115/pPIC9M/pPIC3.5KV为出发菌株，通过摇瓶水平发酵条件优化，使高甜度monellin的分泌表达量进一步由0.3g/L提高到了0.5g/L。 以摇瓶发酵条件为依据，在30L发酵罐上采取分批补料的方式实现了重组酵母GS115/pPIC9M/pPIC3.5KV的高密度发酵，高甜度monellin分泌表达量达2g/L。比目前报道的在毕赤酵母中以胞内形式表达的monellin最高表达量1.8g/L还高，而且表达的高甜度monellin分泌到胞外，无需破碎细胞提取。解决了目前甜蛋白基因工程研 中国农业科学院博士学位论文究中存在的单产低、胞内提取困难的两大难题。 综上所述，本研究成功构建了可高效表达、有效分泌高甜度monellin的重组毕赤酵母工程菌，探索了一种利用…基因解抉毕赤酵母高密度发酵中氧气供求矛盾。提高毕赤酵母中外源蛋白产量的新方法，提供了一条产量高、分离纯化简便，可低成本大规模生产高甜度monellin的新途径。为实现高甜度monellin的产业化和 vgb基因在毕赤酵母高密度发酵中的广泛应用奠定了基础。
汪芳[7]2011年在《重组人防御素的构建与制备及其应用研究》文中认为防御素因其具有良好的水溶性、安全无毒、抑菌谱广和保健作用,逐渐成为天然防腐剂研究应用的一个重要方面。然而,防御素在生物体中含量低,化学合成方法成本高,无法满足工业化生产的需求,借助于基因工程的手段生产防御素是目前研究的热点。本论文以防御素α和β家族已发现抑菌活性最高的多肽——人α-防御素5和人β-防御素3作为研究对象,研究其在毕赤酵母中的分泌表达、抑菌能力、理化性质及其应用于面包防腐中的可行性。本论文成功获得编码正确的人α-防御素5前体蛋白(preproHD5)和人β-防御素3(hBD-3)基因序列,并将其插入表达载体pPIC9K中,成功构建重组表达载体pPIC9K-preproHD5和pPIC9K-hBD-3,转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115表达系统,经甲醇诱导,成功分泌表达出人α-防御素5前体蛋白和人β-防御素3,蛋白表达量分别为200 mg/L和150 mg/L。本论文针对重组人防御素的抑菌能力和理化性质进行研究,结果如下:重组人防御素对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC35218)2种标准菌株均具较强的抑菌活性,且人α-防御素5前体蛋白和人β-防御素3对ATCC35218的最小抑菌浓度分别为3.0 mg/mL和3.5 mg/mL,对ATCC6538分别为2.5 mg/mL和3.0 mg/mL;人α-防御素5前体蛋白和人β-防御素3在温度分别为60℃和80℃的条件下,抑菌效果最好,且经120℃和140℃高温处理10 min后仍有活性,具有较好的耐受性;人α-防御素5前体蛋白和人β-防御素3在pH值分别为6.0和5.0时,抑菌效果最好;NaCl和CaCl2的浓度对这两种人防御素抑菌活性有较大的影响,离子浓度越高,抑菌活性越小。本论文发酵制备的重组人防御素对面包有一定的防腐保鲜作用,随着防御素含量的增加,面包的保质期延长,且人α-防御素5前体蛋白比人β-防御素3抑菌效果更好。当重组人α-防御素5前体蛋白添加量为10 g/kg时,面包的保质期可延长至11 d。借助于基因工程手段是大规模生产防御素的一条经济有效途径。本论文成功构建重组毕赤酵母菌,甲醇诱导分泌表达出具有生物活性的人防御素,并研究其抑菌能力和理化性质。本论文初步将重组人防御素应用于面包的防腐保鲜,为研究开发新一代重组人防御素的防腐剂奠定了基础。
黄鹏, 阎丽萍, 张宁, 石金磊[8]2018年在《利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2》文中研究说明利用甘油醛叁磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2(human goose-type lysozyme 2,h LysG2),并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2(recombinant hLysG2,rhLysG2)生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因,将其连接至pGAPZαA质粒中,构建重组表达质粒pGAPZαA-h LysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株,并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60h后发酵液上清酶活性达到最高,发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rhLysG2得到表达。与诱导型表达相比,组成型表达发酵时间缩短了48h,上清中rhLysG2总活性提高了23. 8%;使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后,每升发酵液上清可纯化到187. 4mg重组蛋白,纯化产物纯度达99. 0%以上;浊度测定法分析显示,在pH 5. 6、30℃和0. 1mol/L Na+的条件下,rhLysG2可达到最大酶活性13 500U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rh LysG2,避免了甲醇的使用,缩短了发酵时间,提高了蛋白产量,为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。
蔡可, 王太康, 王君, 董自星, 田康明[9]2019年在《黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析》文中研究表明利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC 3. 2. 1. 89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因agh A在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(p PIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶Agh A的酶活为130 U/m L,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4. 5和45℃,且在pH 4. 0～6. 0或30～50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶Agh A的酶活没有显着影响; Fe3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg2+则可使Agh A几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400 mg/(m L·min)和0. 08 mg/m L。此外,重组酶Agh A还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳叁糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。
王鑫, 金鹏, 宋鹏, 董自星, 刘晓光[10]2019年在《黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析》文中认为酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH> 3. 0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因exp A在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115 (p PIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257 380 RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3. 0;分别在40～50℃或pH 2. 5～3. 5孵育1 h后,仍能保留80%左右的活力。Zn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Mn~(2+)对其活性有一定的促进作用;而Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、EDTA和SDS则对其活性有显着的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 利用毕赤酵母发酵表达植物甜蛋白（Brazzein）的初步研究[D]. 赵红玲. 北京化工大学. 2004
[2]. 甜味蛋白Brazzein酵母表达系统的建立[D]. 王长远. 黑龙江八一农垦大学. 2008
[3]. 甜蛋白Brazzein在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达[D]. 朱丽. 山西农业大学. 2004
[4]. 利用毕赤酵母表达植物甜蛋白(brazzein)的初步研究[J]. 赵红玲, 陈劲春. 北京化工大学学报(自然科学版). 2005
[5]. 甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵培养基[D]. 徐爱才. 武汉工业学院. 2011
[6]. 高甜度monellin基因和透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中的表达[D]. 李敏. 中国农业科学院. 2003
[7]. 重组人防御素的构建与制备及其应用研究[D]. 汪芳. 华南理工大学. 2011
[8]. 利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J]. 黄鹏, 阎丽萍, 张宁, 石金磊. 中国生物工程杂志. 2018
[9]. 黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析[J]. 蔡可, 王太康, 王君, 董自星, 田康明. 食品与发酵工业. 2019
[10]. 黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析[J]. 王鑫, 金鹏, 宋鹏, 董自星, 刘晓光. 食品与发酵工业. 2019
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