论文摘要
嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacilluscaldus,A.caldus）属革兰氏阴性菌,严格的化能自养,可氧化利用丰富多样的还原性无机硫化物和单质硫,广泛应用在生物冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等工艺中。硫代谢是A.caldus的核心能量系统,也是其产业应用的基础。A.caldus的单质硫代谢是一个由细胞外到细胞内的复杂氧化过程:首先,细胞通过运动吸附到单质硫表面;然后对单质硫进行活化将胞外单质硫转化成活性硫,进入细胞周质空间并被氧化,产生不同类型的硫化合物;接着这些硫代谢中间产物通过硫转运系统进入细胞质,被进一步氧化。因此,单质硫的氧化过程是由多种系统参与的、逐步氧化的过程。A.caldus等嗜酸性硫杆菌硫代谢过程中硫氧化酶的发掘与鉴定工作在过去几年已经得到广泛的研究,但是嗜酸性硫杆菌对单质硫的吸附过程、胞内硫转运过程的研究鲜有报道,相关知识的缺失和不足,限制了对嗜酸性硫杆菌完整硫代谢过程的认知,也不利于硫代谢工程菌株的构建及其产业应用。因此,本论文针对嗜酸性硫杆菌硫代谢过程中的细胞吸附过程和胞内硫转运系统进行了系统研究。（一）鞭毛介导的细胞运动对A.caldus 单质硫吸附的影响:1.鞭毛基因簇特征及鞭毛合成调控蛋白（RpoF）的转录规律:A.caldus中鞭毛基因簇的生物信息学分析。分析发现,A.caldus中所有的鞭毛合成相关基因在染色体上形成一个庞大完整的基因簇,涉及基因近40个,约占整个基因组ORFs（Opening read frames）的2%。比较基因组学系统分析了Acidithibacillia中鞭毛基因簇的同线性关系以及与其他具有单生鞭毛的异养微生物的异同。归纳统计分类学特征时还发现,在Acidithiobacillus的七种菌株中,具有鞭毛的菌种都含有Sox系统,推测二者在Acidithibacillia的进化上可能同时发生,暗示着鞭毛与硫代谢有重要的联系。另外,在对RpoF调控基因的启动子序列分析时,并没有发现其在异养菌中相似的特征序列,RpoF的系统发育分析表明,它在进化上与异养菌有较大差异,暗示着RpoF具有物种特异性。2.鞭毛在A.caldus能量代谢中的作用及RpoF的调控功能研究:A.caldus中rpoF基因的功能研究。基于同源重组原理,利用无标记基因无痕敲除技术,敲除A.caldus基因组上鞭毛合成调控因子RpoF基因,并以广宿主质粒pJRD215为骨架,构建了 rpoF基因的过表达和回补菌株,研究了它们对A.caldus鞭毛及硫吸附的影响。此外,在转录组水平上研究了 rpoF对细胞鞭毛合成基因及其它生命活动的影响。RNA-seq结果显示rpoF还参与了细胞能量代谢、DNA修饰、pili合成和第二信使c-di-GMP生成等过程,对细胞的生命活动起到全局性的调控作用。此外,根据先前的研究结合转录组数据,提出了 A.caldus中鞭毛的合成组装的级联调控模型。（二）Dsr系统在A.caldus胞内硫活化转运中的功能:1.A.caldus中Dsr系统特征分析:本文以DsrE2A和TusA两个小分子硫载体为切入点,对A.caldus胞内硫转运蛋白基因簇进行了生物信息学分析。在A.caldus基因组上发现了dsrE3A-tusA-rhd-hdr基因簇,这是一个不完整的Dsr基因簇。通过BlastP和系统发育分析了A.caldus中硫转运相关蛋白的特征。同时,通过RT-qPCR研究了这些基因在硫代谢过程中的转录变化及基因簇的共转录关系。2.A.caldus细胞内硫转运蛋白功能的研究研究了硫转运蛋白基因缺失或过表达对A.caldus硫代谢中的影响。dsrE2A和orf1004两个基因的敲除对单质硫的代谢影响不明显,而tusA基因的缺失,对单质硫的代谢产生了显著的抑制作用。在以K2S4O6为能源时,除△1004没有表现出差异外,△dsrE2A和△tusA均与野生型的生长差异显著。缺失dsrE2A反而促进了 K2S406的代谢,而tusA的缺失使细胞积累胞外硫,严重阻碍了 S4O62-的氧化。另外,△dsrE2A和△tusA两个敲除株对Na2S2O3的代谢有明显的促进作用。与敲除相对应,dsrE2A的过表达对单质硫的氧化有微弱的促进作用,对S4O62-的代谢则具有明显的抑制,而其同源基因orf0418的过表达对单质硫虽然没有明显的影响,但其对S4062-的氧化有显著的促进作用,细胞几乎没有生长停滞期就直接开始生长。同理,tusA的过表达也与其敲除相呼应。然而orf1004的过表达菌株和敲除菌株一样,在本实验条件下,对细胞的硫代谢没有产生明显的影响。研究了硫转运蛋白DsrE2A和TusA上的关键氨基酸位点。BlastP分析发现,小分子硫载体蛋白中都含有十分保守的Cys残基,为了深入研究DsrE2A和TusA的功能,对其关键的Cys氨基酸位点进行突变,以pJRD215为骨架,构建相应基因的突变载体,在利用接合转移的方法将其导入对应的突变株中,通过体内实验研究其对不同还原性硫化物的影响。研究表明,DsrE2A蛋白C-端末尾的第117位的Cys和倒数第二个Cys（第101位）是该蛋白两个关键氨基酸位点。而TusA蛋白N-端第15位的Cys对其功能至关重要,突变后,细胞的生长达到△tusA水平。对dsr基因簇其它基因进行了初步探索。构建了相关基因（hdrs,seos和rhds等）的过表达菌株,研究了它们对不同硫化物氧化的影响。发现这些基因的过表达对细胞单质硫的氧化影响较小,大部分基因的过表达甚至表现出与野生型几乎一致的生长趋势,但对S4062-氧化均产生了不同程度的影响。说明这些基因确实参与了 S4062-的转运与氧化。
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摘要ABSTRACT缩略语第一章 研究背景综述 1.1 浸矿微生物及其在生物冶金中的应用 1.2 细菌鞭毛的结构与功能 1.3 Acidithiobacillius中的硫氧化系统 1.4 硫元素在生物体中的活化与转运 1.5 本论文的研究目的与内容第二章 A.caldus中鞭毛基因簇特征及rpoF转录规律研究 2.1 材料与方法 2.1.1 菌株 2.1.2 试剂与仪器 2.1.2.1 试剂 2.1.2.2 仪器 2.1.3 Starkey培养基0液体培养基'> 2.1.3.1 Starke-S0液体培养基2S2O3固体培养基'> 2.1.3.2 Starkey-Na2S2O3固体培养基 2.1.4 实验方法 2.1.4.1 A.caldus的培养 2.1.4.2 RNA提取 2.1.4.3 蛋白序列比对和系统发育树构建 2.2 结果与讨论 2.2.1 A.caldus MTH-04的鞭毛及基因簇特征 2.2.2 Acidithiobacillus中鞭毛基因簇的比较研究 2.2.3 RpoF的系统发育分析 2.2.4 FlaB的系统发育分析 2.2.5 rpoF基因在生长过程中的转录规律研究 2.3 本章小结第三章 A.caldus中rpoF基因的功能研究 3.1 材料与方法 3.1.1 菌株与质粒 3.1.2 试剂与仪器 3.1.2.1 试剂 3.1.2.2 仪器 3.1.3 培养基及培养条件 3.1.3.1 大肠杆菌的培养 3.1.3.2 喜温硫杆菌的培养 3.1.3.3 抗生素工作浓度 3.1.4 实验方法 3.1.4.1 常用的实验体系 3.1.4.2 DNA纯化回收 3.1.4.3 质粒提取 3.1.4.4 基因组提取 3.1.4.5 大肠杆菌超级感受态细胞的制备 3.1.4.6 大肠杆菌转化 3.1.4.7 喜温硫杆菌与大肠杆菌的接合转移 3.2 rpoF敲除和表达菌株构建 3.2.1 敲除株△rpoF的构建 3.2.1.1 自杀质粒pSDUDI-rpoF-U-D的构建 3.2.1.2 rpoF单交换子的筛选验证 3.2.1.3 双交换菌株-△rpoF的筛选 3.2.2 rpoF回补和过表达菌株构建 3.3 △rpoF菌株的生理特性研究 3.3.1 鞭毛形态结构研究 3.3.2 A.caldus细胞运动能力的研究 3.3.3 鞭毛对生物膜形成的影响 3.3.4 rpoF突变株在不同条件下的生长特性研究 3.3.4.1 以硫单质作为能源底物时的生长特性2S4O6为底物的生长特性'> 3.3.4.2 以可溶性还原硫化物——K2S4O6为底物的生长特性 3.3.4.3 不同溶氧条件下的生长特性 3.3.4.4 RpoF对培养基酸碱度的影响 3.4 rpoF转录组学研究 3.4.1 rpoF敲除株的培养 3.4.2 RNA提取 3.4.3 RNA-seq方法 3.4.3.1 测序流程 3.4.3.2 测序方法 3.4.4 RNA-seq结果分析 3.4.4.1 测序数据的质检报告 3.4.4.2 参考序列比对分析 3.4.4.3 基因总体表达水平分析 3.4.4.4 差异基因表达分析 3.4.5 转录组数据的RT-qPCR验证 3.4.6 差异基因的分类整理 3.5 本章小结第四章 A. caldus细胞内硫转运基因的生物信息学分析 4.1 材料与方法 4.2 结果与讨论 4.2.1 A.caldus MTH-04中硫转运基因簇特征研究 4.2.2 DSR系统的系统发育研究 4.2.2.1 DsrE系统发育分析 4.2.2.2 TusA系统发育分析 4.2.2.3 Rhd系统发育分析 4.2.3 Dsr系统中基因的转录规律研究 4.2.4 Dsr基因簇的共转录关系研究 4.3 本章小结第五章 A.caldus细胞内硫转运基因的功能研究 5.1 材料与方法 5.1.1 菌株与质粒 5.1.2 试剂与仪器 5.1.3 培养基及培养条件 5.1.4 实验方法 5.2 敲除和表达菌株构建 5.2.1 基因敲除原理 5.2.2 硫载体蛋白的敲除菌株构建 5.2.2.1 △dsrE2A （orf2473）菌株的构建 5.2.2.2 △tusA（orf2474）菌株的构建 5.2.2.3 △1004（orf1004）菌株的构建 5.3 过表达和回补菌株构建 5.4 TusA和DsrE2A关键氨基酸位点研究 5.5 硫转运相关菌株在硫代谢中的功能研究 5.5.1 dsrE2A相关菌株的硫氧化研究 5.5.1.1 △dsrE2A在不同硫能源下的生长特征研究 5.5.1.2 dsrE2A回补其同源基因过表达菌株的生长特性研究 5.5.1.3 DsrE2A关键氨基酸突变对不同硫化物氧化的影响 5.5.2 tusA相关菌株的硫氧化研究 5.5.2.1 △tusA在不同硫能源下的生长特征研究 5.5.2.2 △1004在不同硫能源下的生长特征研究 5.5.2.3 tusA回补及其同源基因的过表达菌株的生长特性研究 5.5.2.4 TusA关键氨基酸位点突变对不同硫化物氧化的影响 5.5.3 rhd相关菌株的硫氧化研究 5.5.4 其它DSR菌株的硫氧化研究 5.6 本章小结第六章 全文总结与展望附录 1 常见培养基配方 1.1 9K培养基配制 1.2 2:2固体培养基配制 1.3 Starkey系列培养基配制 1.4 DMSZ 71培养基 2 抗生素浓度 3 细菌的培养 3.1 大肠杆菌的培养 3.2 A.caldus的培养 4 核酸相关的实验操作 4.1 DNA提取 4.2 DNA片段纯化回收 4.3 质粒提取（大量提取方法） 4.4 细菌总RNA提取 5 感受态细胞制备 5.1 大肠杆菌感受态制备及转化 5.2 A.caldus的接合转移 5.3 A.caldus的电转化 6 常用的蛋白及化合物检测 6.1 报告基因——碱性磷酸酶酶活检测: 6.2 报告基因——GFP的检测 6.3 SDO酶活性检测 6.4 Rhd酶活性检测 6.5 过硫化蛋白检测 6.6 GusA酶活的检测0）检测'> 6.7 单质硫（S0）检测 6.8 硫酸根检测（GB3838,2002） 6.9 连四硫酸根检测参考文献致谢攻读学位期间的学术成果学位论文评阅及答辩情况表
文章来源
类型: 博士论文
作者: 杨春龙
导师: 林建群
关键词: 鞭毛,基因无痕敲除,硫吸附,硫转运,硫代谢
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东大学
分类号: Q935
DOI: 10.27272/d.cnki.gshdu.2019.000138
总页数: 172
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标签：鞭毛论文; 基因无痕敲除论文; 硫吸附论文; 硫转运论文; 硫代谢论文;
嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢过程中底物吸附与胞内硫转运机制研究
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