导读:本文包含了肽四聚体论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译,主要关键词:细胞,相容性,特异性,复合体,淋巴细胞,免疫,抗原。
肽四聚体论文文献综述
杨璟辉[1](2016)在《通过MHC-II-肽四聚体追踪同种异体移植后小鼠内源性供体特异性B细胞的分化及其机制研究》一文中研究指出人类生存的环境中存在大量有害的病原微生物如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫等,而机体在这一环境中能够抵御这些病原体的侵扰并维持自身稳定,在很大程度上依赖于机体的免疫系统。这些有害的病原微生物上覆盖了一些抗原。当这些抗原进入体内时,机体的免疫系统会识别出这些“外来”的抗原并攻击他们。然而,在器官移植过程中,当患者在手术中接受另一个人的器官时,患者的免疫系统会识别出这个外来器官,并且攻击这个移植器官而产生排斥。随着针对供体特异性抗体诊断方法的日益提高,目前移植学家已充分认识到临床上抗体介导的排斥反应是导致器官移植术后器官衰竭的主要原因。抗体介导的排斥反应是以微血管损伤和特殊转录因子变化为特点的,也就是抗体介导的内皮损伤、γ干扰素效应和中性粒细胞聚集。现在认为器官移植的晚期损伤与抗体介导的排斥反应有密切关系而不是T细胞介导的排斥反应,因为T细胞介导的排斥反应主要出现在器官移植的早期,随着移植时间的延迟逐渐减少。目前的问题在于目前存在的免疫抑制剂对于抗体依赖的排斥反应基本无效,特别是在患者体内发现供体特异性抗体后。供体特异性抗体是由T细胞辅助供体特异性B细胞产生的。当B细胞接触到供体特异性抗原时,会形成供体特异性B细胞并分化为早期产生抗体的短效浆细胞和远期再次免疫中有记忆作用的长期存在的浆细胞,另外有一些供体特异性B细胞会分化成为静止状态的记忆性B细胞,在再次遇到供体特异性抗体时,短期内转化成为分泌高亲和力的成浆细胞。因此,供体特异性B细胞在移植排斥的过程中有重要作用。B细胞不仅被认为和移植排斥有关,目前越来越多的证据显示,B细胞同样具有免疫调节的功能,对移植耐受也有参与。实验表明,B细胞分泌的IL-10在其中有重要的作用,然而这些B细胞的表型、抗原特异性以及解剖微环境都尚不清楚。另外,在临床上移植学家发现,器官移植术后免疫耐受者体内有大量的B细胞聚集,而应用免疫抑制剂维持移植器官稳定的受者中却没有。这一结果使有些研究者提出了B细胞在免疫耐受中具有重要作用的假说。因此,B细胞在器官移植过程中既有导致排斥的作用,也有抑制排斥的作用,我们迫切需要一种在不同移植环境下可以追踪体内供体特异性B细胞的方法。一、新型MHC-II肽四聚体的制备及受体体内供体特异性B细胞的检测我们在这一部分中通过应用流式技术证实了在C57BL/6小鼠体内有些B细胞可以识别SAV-PE或SAV-APC,但几乎不能同时识别这两种抗体。而不同于SAV,小鼠引流淋巴结中MHC-II肽四聚体双阳性的B细胞出现明显聚集,能够同时识别IEd-PE和IEd-APC。通过过继转移法,我们把普通C57BL/6小鼠的脾脏淋巴细胞,通过磁珠吸附把所有能识别IEd的细胞分离出来,并把剩余的淋巴细胞输注进入B细胞缺陷的小鼠体内.叁周后我们发现抗IEd抗体在IEd去除的B细胞缺陷的μMT小鼠中却出现了明显的减少。这一结果提示去除IEd细胞可导致抗IEd抗体减少,这些IEd-PE、IEd-APC双阳性的B细胞是真正具有功能能够分泌抗体的B细胞。同时,我们还检测了MHC-II肽四聚体双阳性法的敏感性和特异性,发现IEd-PE、IEd-APC双阳性的B细胞中几乎没有表达SAV的细胞,并没有出现那些天然可以结合到SAV或IEb上的细胞。二、利用MHC-II肽四聚体双阳性法检测内生性B细胞在皮下免疫或心脏移植后的分化发育及演变在这一部分中,我们首先检验了皮下免疫这一方法的适用性,通过将BALB/c小鼠脾细胞皮下免疫C57BL/6小鼠,然后在不同的时间点收集血清检测供体特异性抗体以及抗IEd抗体。我们发现DSA和抗IEd抗体在免疫后十四到二十一天达到顶峰。用BALB/c小鼠淋巴细胞免疫的C57BL/6小鼠的引流淋巴结中Fas+Gl7+双阳性生发中心表型在免疫后的第七天仅仅有8%左右,第十天达到了35%左右,第十四天达到了49%左右,比抗体产生的时间早。这一结果表明,虽然有一些特异性程度不高的抗体在七天以前就有出现,但大部分特异性较高的抗体都是在引流淋巴结中大量B细胞出现Fas+Gl7+双阳性生发中心表型后生产出来的。在引流淋巴结中MHC-II肽四聚体双阳性Ig Dlo的B细胞总数远远超过了在非引流淋巴结中MHC-II肽四聚体双阳性Ig Dlo的B细胞总数,约为10倍。进一步研究发现,相比皮下细胞免疫,心脏移植后小鼠机体针对移植物的排斥反应更加系统性,不仅仅在引流淋巴结中有供体特异性生发中心表型的MHC-II肽四聚体双阳性B细胞生成,在脾脏中也大量出现了供体特异性生发中心表型的MHC-II肽四聚体双阳性B细胞。但无论是在引流淋巴结还是在脾脏中其比例都没有皮下细胞免疫后的引流淋巴结中多。最后,我们检测了受体脾脏中Tfh细胞的比例。在心脏移植小鼠的脾脏中约有25%的T细胞是CXCR-5+PD-1+的表型,其中约9%为CXCR-5hiPD-1hi的Tfh表型。这一结果进一步确定了供体特异性B分化成为生发中心表型的时间窗。叁、利用MHC-II肽四聚体双阳性法检测内生性B细胞在再次免疫应答中的分化发育及演变在这一部分中,我们发现再次免疫后,供体特异性B细胞和具有生发中心表型的供体特异性B细胞的升高都没有初次免疫时明显。相比之下,ASCs数量却远远多于初次免疫时,记忆性B细胞是再次免疫应答的主体,其发挥作用可以发生在体内只有未致敏T细胞的环境下而并不需要记忆性T细胞的辅助。而此时供体特异性Ig G滴度在再次免疫后7天内迅速升高达到顶峰,其升高幅度为初次免疫时滴度波峰的2倍左右,并在随后的数周至数月内持续抬高,下降速度较初次免疫慢。通过应用CTLA4-Ig,我们进一步研究了Tfh细胞的活化和生发中心的形成。从初次免疫当天开始应用CTLA4-Ig可以完全抑制供体特异性Ig G的产生,再次免疫后也没有供体特异性Ig G的产生,而从初次免疫后第七天开始应用CTLA4-Ig可以使小鼠体内仅产生少量的供体特异性Ig G,再次免疫后也仅有少量的供体特异性Ig G出现。相比之下,从初次免疫后第十四天开始应用CTLA4-Ig并不会影响体内供体特异性Ig G的产生。进一步的实验发现,供体特异性抗体水平和供体特异性记忆性B细胞的趋势是一致的。综上所述,我们通过利用MHC-II肽四聚体双阳性法研究了供体特异性B细胞产生的时间窗,在初次免疫过程中其表型、比例的变化以及Tfh细胞的变化。在再次免疫过程中,通过CTLA4-Ig抑制生发中心产生研究后续记忆性供体特异性B细胞的变化。我们的结果明确了生发中心形成的时间窗,对供体特异性记忆性B细胞在移植排斥的作用和产生进行了明确,提出了新的理解。(本文来源于《第二军医大学》期刊2016-05-01)
李子彬[2](2015)在《荷包猪SLA-2/肽四聚体构建与功能检测》一文中研究指出主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)是一种存在于脊椎动物中的由一个庞大的基因家族编码的细胞表面分子,其产物是参与抗原提呈和T细胞激活的关键分子。不同种属动物的MHC及其编码的抗原系列有不同的命名,猪的MHC分子又叫做猪白细胞抗原(SLA)。MHC-I四聚体可以对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)进行检测和筛选,已作为研究机体细胞免疫功能、评价特异性免疫治疗和探究疾病机理的重要工具。本研究中,首先亚克隆六个品系SLA-2-BSP(重链)胞外区以及一类sβ2m(轻链)成熟肽基因。包括叁个国外品系长白猪(YC)、大约克猪(DCY)、托佩克猪(TPK),叁个国内地方品系荷包猪(HB)、莱芜黑猪(LWH)和烟台黑猪(YTH)。随后,分别采用pET-21a(+)/E.coli或pET-28a(+)/E.coli表达系分别高效表达SLA-2-BSP和sβ2m重组蛋白,并对重组蛋白进行纯化。通过生物信息学的方法,预测和合成猪口蹄疫病毒VP1和RNA聚合酶3D中的T细胞表位多肽,通过ELISPOT方法对预测表位多肽进行特异性筛选。随后,将备选表位多肽与纯化后的重链、轻链重组蛋白进行体外共折迭复性、过分子筛鉴定SLA-2-BSP与特异性多肽结合,并分离出SLA-2-BSP/肽复合单体蛋白。在此基础上,将SLA-2/HB/肽复合单体生物素化后与FITC标记链霉亲和素反应生成SLA-2/肽四聚体,并通过流式细胞术(FACS)对SLA-2/肽四聚体功能进行验证。本研究通过ELISPOT方法鉴定得到了猪口蹄疫病毒VP1的一条特异性多肽表位,并成功构建了该多肽表位的SLA-2/肽四聚体,检测了针对于该表位的特异性CTL,初步建立了猪四聚体技术平台,为研究猪特异性CTL免疫应答以及T表位筛选奠定基础。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2015-06-01)
阮光萍,姚翔,潘兴华,庞荣清,邓永丽[3](2010)在《HLA-肽四聚体和过继性免疫疗法与巨细胞病毒疾病(英文)》一文中研究指出背景:抗病毒药物能减少早期的巨细胞病毒疾病,但有较强的毒性和引起晚期巨细胞病毒疾病发生的可能。为了更好地防治巨细胞病毒疾病,研究细胞毒性T淋巴细胞控制巨细胞病毒再活化的作用是很关键的,荧光HLA-肽四聚体是一个很好的工具,被用来监测移植受者的巨细胞病毒特异细胞毒性T淋巴细胞的恢复。目的:探讨HLA-肽四聚体和过继性免疫疗法在治疗巨细胞病毒疾病中的作用。方法:由第一、二作者检索2003/2009PubMed数据库及万方数据库有关移植后巨细胞病毒特异细胞毒性T淋巴细胞检测、抗病毒药物应用、HLA肽四聚体应用、过继性免疫治疗作用的文献,英文检索词为"HLA-peptide tetramers,cytomegalovirus,specific CTL,adoptive immunotherapy",中文检索词为"HLA-肽四聚体,巨细胞病毒,特异细胞毒性T淋巴细胞,过继性免疫治疗"。排除重复性研究,纳入29篇归纳总结。结果与结论:用巨细胞病毒特异细胞毒性T淋巴细胞进行的过继性免疫治疗是非常完美的策略,然而,产生这些细胞是昂贵和耗时的,因此治疗不是在每个移植中心都能进行。用HLA-肽四聚体从巨细胞病毒血清阳性供者外周血中选择巨细胞病毒特异细胞毒性T淋巴细胞是非常有希望的策略,使过继性免疫疗法更容易进行。(本文来源于《中国组织工程研究与临床康复》期刊2010年31期)
熊锐华[4](2009)在《MHC-肽四聚体技术在CTL表位鉴定中的应用》一文中研究指出MHC-肽四聚体(Peptide-MHC tetramer)技术是免疫学和临床诊断中重要的技术,广泛应用于免疫学研究及免疫性疾病临床研究。研究证实,T细胞是通过TCR识别靶细胞或抗原递呈细胞表面MHC分子结合的特异性表位肽复合体,但这种特异性识别亲和力低,迅速发生解离。MHC-肽四聚体复合物的原理是通过增强T细胞受体与MHC-肽复合物亲和力,达到可直接特异性检测T细胞的目的。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强,但也存在复性率低、步骤繁琐等缺点。虽然研究者对MHC-肽四聚体的制备技术做了很多改进,但仍未很好地解决这些问题。MHC-I分子限制性的CTL表位鉴定一直是免疫学的热点,是基于表位进行免疫诊断、免疫治疗、疫苗开发的关键。传统的CTL表位鉴定方法主要采用先合成大量的交迭肽,再通过后续淋巴细胞实验进行选取,存在费时、费力、费用大、鉴定效率低等缺点。有研究者用TAP(Transporters associated with antigen processing)缺陷细胞T2细胞,采用肽亲和力实验进行表位鉴定,取得了很好的结果,但繁琐的标记、染色及反复洗涤细胞过程可能对细胞造成的损伤是限制该方法广泛应用的主要原因。众所周知,DsRed和ZsGreen均表达为四聚体结构的荧光蛋白,所以,我们设想将MHC-I分子和ZsGreen在真核细胞中融合表达,直接获取MHC-四聚体,简化传统制备MHC-四聚体中繁琐的原核表达、折迭、生物素化、荧光标记等过程,且构建的MHC-四聚体理论上可加载任意感兴趣的抗原肽,使检测更加灵活。而运用此原理将β2M和ZsGreen融合表达获得β2M四聚体,该融合蛋白理论上可以和MHC-I、特异性表位肽结合形成MHC-肽四聚体。利用此原理,将此融合蛋白应用于肽亲和力实验,可能极大地改进CTL表位鉴定方法。目的:本研究试图运用分子克隆技术、真核表达、镍亲和层析法纯化等方法直接获得MHC-四聚体,优化MHC-肽四聚体制备技术,并将该技术运用于MHC-肽亲和力实验,改进CTL表位鉴定方法。方法:1.通过PCR技术得到小鼠MHC-Ⅰ分子的可溶性部分sKb的DNA序列,并运用分子克隆技术将这段DNA片段与4×GGGS-ZsGreen-6×His载入包装质粒FUGW的载体中,构建sKb-GGGS-ZsGreen-6×His标签的融合蛋白真核表达质粒FUsKbZsGreenGGGS;2.运用细胞转染技术,将FUsKbZsGreenGGGS转染293FT细胞,融合表达sKbZsGreenGGGS;3.裂解表达sKbZsGreenGGGS的293FT细胞,利用融合蛋白所带的6×His标签,镍亲和层析法纯化sKbZsGreenGGGS,并脱盐、浓缩;4.将sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽组装后得到MHC-OVA肽四聚体,该四聚体与B3Z细胞反应,流式细胞术检测;5.通过PCR技术得到人β2M分子的DNA序列,并运用分子克隆技术将这段DNA片段与4×GGGS-ZsGreen-6×His载入包装质粒FUGW的载体中,构建β2M-GGGS-ZsGreen-6×His标签的融合蛋白真核表达质粒FUβ2MZsGreenGGGS;6.运用细胞转染技术,将FUβ2MZsGreenGGGS转染293FT细胞,将β2M-GGGS-ZsGreen-6×His片段嵌入293FT细胞基因组DNA,融合表达β2MZsGreenGGGS;7.裂解表达β2MZsGreenGGGS的293FT细胞,利用融合蛋白所带的6×His标签,镍亲和层析法纯化β2MZsGreenGGGS,并脱盐、浓缩;8.将β2MZsGreenGGGS和表位肽共同与TAP缺陷细胞T2细胞反应,通过流式细胞术检测T2细胞标记绿色荧光的情况鉴定表位,并与传统肽亲和力实验对比。机制探讨:1. MHC-肽四聚体技术的优化通过将MHC-Ⅰ分子和ZsGreen融合表达,直接构建带绿色荧光的MHC-Ⅰ四聚体,将该四聚体与特异性表位肽结合后与特异性杂交瘤细胞反应,流式细胞检测,通过细胞染色比例证实所构建的MHC-Ⅰ四聚体复合物可被特异性T细胞识别、结合,对MHC-肽四聚体复合物技术的优化的方法可行。本部分研究利用真核表达、蛋白质纯化技术获得MHC-Ⅰ四聚体,与特异性表位肽及特异性T细胞反应后流式细胞术证实该四聚体具有与特异性表位肽结合并被特异性T细胞识别的能力。2. MHC-肽四聚体技术在表位鉴定中的应用将β2M和ZsGreen融合表达,获得带绿色荧光蛋白的β2M四聚体,将该四聚体与不同的表位肽、T2细胞反应,流式细胞检测,根据T2细胞染色情况鉴定抗原表位。本部分实验运用T2细胞株TAP(Transporters associated with antigen processing)缺陷的特点及β2M促进MHCⅠ类分子与抗原表位肽结合的作用,将β2M四聚体、表位肽及T2细胞反应,阳性肽与β2M四聚体、T2细胞表面少量MHC-Ⅰ分子结合形成稳定的带绿色荧光的MHC-肽四聚体复合物,同时在T2细胞表面标记绿色荧光,通过流式细胞术即可鉴定表位。结论:1.构建了1种MHC-Ⅰ四聚体的真核表达质粒FUsKbZsGreenGGGS并表达、纯化得到sKbZsGreenGGGS,将sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽组装后被B3Z细胞识别、结合,流式细胞检测;2.构建了β2M-四聚体的真核表达质粒FUβ2MZsGreenGGGS并表达、纯化得到β2MZsGreenGGGS,将β2MZsGreenGGGS与表位肽共同与T2细胞反应,通过流式细胞术检测T2细胞标记绿色荧光的情况鉴定表位;以上研究证实,通过将MHC-Ⅰ分子和ZsGreen融合表达的方法制备MHC-肽四聚体,在技术上可行,而运用这项技术及其原理制备β2M-四聚体,并应用于肽亲和力实验进行表位鉴定,大大简化和优化了表位鉴定的方法,具有广泛的应用前景。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2009-05-01)
邵文雨,朱楠,杨广顺[5](2009)在《可溶性单链MHC-肽四聚体的构建研究》一文中研究指出目的:构建检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的单链MHC-肽四聚体。方法:通过在MHC重链基因中引入生物素化位点,并在轻链和重链基因中引入同一限制性酶切位点连接MHC轻链和重链构建可生物素化的单链MHC分子。结果:重组子以包涵体形式表达得到单链MHC分子,重折迭、生物素化、荧光标记后得到活性单链MHC-肽四聚体。结论:单链MHC分子操作简便,提高了四聚体构建效率。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2009年03期)
刘光亮,王群,肖一红,童铁钢,白宇[6](2009)在《BF2/肽四聚体的构建及其在特异性T细胞检测上的应用》一文中研究指出为构建可溶性鸡组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子(BF2)/肽复合物,大量表达并纯化了可生物素化的MHCⅠ类分子重链(BF2-BSP)和轻链(Chβ2m),并合成了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白N71~78T细胞表位肽,将其与纯化后的重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m在重折迭缓冲液中复性。复性后在快速蛋白液相色谱仪(FPLC)上分离出复性组装成功的BF2/肽单体复合物。将该单体复合物在体外进行生物素化,其产物再次采用FPLC通过分子筛分离出生物素化后的BF2/肽单体复合物;然后将生物素化后的BF2/肽单体复合物与藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素按一定比例反应生成BF2/肽四聚体。为了检测所制备BF2/肽四聚体是否能应用于检测特异性T细胞,从感染IBV H52株10 d后的SPF鸡分离外周血单核细胞(PBMC),染色后采用流式细胞术检测,结果表明,所制备的BF2/肽四聚体可用于检测IBV N蛋白特异性T淋巴细胞,检测1周龄SPF鸡接种H52后10 d时针对N蛋白的特异性T细胞比率为3.65%。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2009年01期)
虞伟,李晓军,武建国[7](2008)在《主要组织相容性复合体-肽四聚体技术及其在定量检测抗原特异性T细胞中的应用》一文中研究指出四聚体(tetramer)技术是近来发展的一种可直接检测抗原特异性T细胞(antigen specific Tcells,AST)的新方法,在病毒感染、肿瘤、自身免疫病研究及抗原肽免疫优势表位筛选中有着广阔的应用前景。文章简要介绍主要组织相容性复合体(MHC)-抗原肽与T细胞表面受体作用的分子基础、四聚体分子构建及由此衍生的四聚体方法技术类型,并就该技术应用于临床疾病的AST研究现状进行综述。(本文来源于《医学研究生学报》期刊2008年06期)
吴战宏,李子博,陈小元,李方[8](2007)在《~(18)F标记的RGD肽四聚体(~(18)F-FPRGD4)的制备和microPET显像》一文中研究指出目的放射性核素标记的 RGD 肽是一类很有前景的肿瘤显像剂。在多结合位点效应的作用下,RGD 肽的多聚体与整合素α_vβ_3具有更高的结合能力。我们合成了 F-18 标记的第一个 RGD 肽的四聚体并通过 microPET 显像来研究其生物性能。材料与方法(本文来源于《首届全国肿瘤核医学新技术研讨会论文集》期刊2007-08-01)
刘光亮[9](2007)在《BF2/肽四聚体的构建及其在传染性支气管炎病毒特异性T细胞反应评价中的应用》一文中研究指出MHCⅠ类分子/肽四聚体技术是1996年建立的一种检测特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocytes,CTLs)的方法,该方法已在人类及模式动物的相关领域得到较为广泛的研究和应用,然而在兽医学相关研究中只有近年来往猪和马上有了初步的研究,目前该项技术在禽类的研究尚属空白。为了构建鸡的MHC/肽四聚体,本实验从SPF莱航鸡全血克隆了鸡MHCⅠ重链α(BF2)和β2微球蛋白(Chβ2m)全基因,经系统进化分析表明本实验所获得的BF2基因为B15单倍型。然后利用软件分析了其各自的信号肽序列及BF2的跨膜区,利用引物分别缺失了这两段基因的信号肽序列以及BF2的跨膜区,并在BF2基因的3’端融合了BirA底物肽(BSP)序列。将经改造的两段基因分别克隆至融合蛋白重组表达载体中,分别命名为pET-BF_2-BSP和pET-Chβ2m,并将其分别转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中进行诱导表达,获得了包涵体表达的重组蛋白,表达产物溶解于8M脲中,经SDS-PAGE分析,结果表明所得融合目的蛋白分别约为38kD和15kD,Western-blot结果显示该重组蛋白均成功融合了6×His标签。为了获得大量的目的蛋白,优化了诱导剂浓度、起始诱导菌体浓度及诱导时间等表达条件。此外,建立了重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m在变性状态下通过镍柱亲和层析纯化包涵体的方法,获得了高纯度的重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m。根据文献所报道,合成了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白N_(71-78)T细胞表位肽,将其与纯化后的重组蛋白BF2-BSP和Chβ2m在重折迭缓冲液中复性。复性后在快速蛋白液相色谱仪(FPLC)上分离出复性组装成功的BF2/肽单体复合物。将该单体复合物在体外进行生物素化,其产物再次采用FPLC通过分子筛分离出生物素化后的BF2/肽单体复合物;通过链霉亲和素迁移实验检测体外生物素化效率,然后将生物素化后的BF2/肽单体复合物与藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素按一定比例反应生成BF2/肽四聚体。为了检测所制备BF2/肽四聚体的功能,采用10~(5.5)EID_(50)的IBV H52株接种一周龄SPF鸡,10d后采抗凝血用淋巴细胞分离液分离PBMC,调整细胞浓度后取1×10~6个细胞进行抗鸡CD8单抗和BF2/肽四聚体双色荧光染色,采用流式细胞术检测并分析染色结果,结果表明所制备的BF2/肽四聚体可用于检测IBV N蛋白特异性T淋巴细胞,检测一周龄SPF鸡接种H52后10d时针对N蛋白的特异性T细胞比率为3.65%。为了探讨SPF鸡在感染IBV后体内抗体水平及针对N蛋白特异性的T淋巴细胞的动态变化,将125羽SPF鸡随机分为叁组分别作为接种免疫组、攻毒对照组和空白对照组。采用IBV H52标准毒株对其通过滴鼻方式进行免疫,之后每3天剖杀5羽观察各脏器的病理学变化、检测血清抗体效价并采用BF2/肽四聚体评价其N蛋白特异性T细胞的比例;免疫15d时采用IBV M41对免疫组和攻毒对照组进行攻毒,同样检测上述指标。最后综合评价IBV在免疫及攻毒后血清抗体和N蛋白特异性T细胞的动态变化趋势及两者之间的相互关系。检测结果表明H52滴鼻免疫后特异性T细胞免疫的产生早于血清抗体IgG的出现,攻毒结果显示在SPF鸡未产生坚强的体液免疫时仍能抵抗同型强毒的攻击,提示特异性T细胞在抵抗IBV早期感染免疫反应过程中可能起着重要作用。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2007-06-01)
李绍飞[10](2007)在《MHC-肽四聚体的构建及其技术改造研究》一文中研究指出背景和目的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL或Tc)在T细胞免疫应答中发挥着重要的作用,它通过识别靶细胞表面的MHC-肽复合物而对靶细胞进行杀伤。检测和监测抗原特异性CTL,是了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一,也是评价特异性免疫疗法的基础。抗原特异性CTL的体外检测方法有多种,但MHC-肽四聚体技术是目前唯一能够直接对其定量检测的方法。然而,MHC-肽四聚体构建过程复杂,价格昂贵,这在一定程度上限制其大规模应用,这就要求我们一方面要构建针对不同抗原表位的MHC-肽四聚体,另一方面也要求我们开展MHC-肽四聚体技术改造研究,简化MHC-肽四聚体制备过程,提高其实用性和可操作性,开发具有自主知识产权的产品,以适合和满足我国医学飞速发展的需要。另外,慢性HBV感染是一个全球性的重大健康问题。HBV有多种抗原成分,而每种抗原成分包含有多个抗原表位,构建HBV不同抗原表位的MHC-肽四聚体很有必要。本文首先使用MHC-肽四聚体构建的基本方法构建HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体,一方面可以为检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107-115表位特异性CTL打下基础,另一方面摸索和掌握MHC-肽四聚体构建技术,可以为构建其它抗原表位的MHC-肽四聚体或为建立抗原特异性CTL检测的技术平台打下基础;其次将SCT改造为HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体,以期为MHC-肽四聚体技术改造提供新思路。试验方法(1)HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体的构建分别将重组A2-BSP和β2m的载体用化学法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,对转化菌落进行培养和用IPTG诱导,表达出包涵体蛋白;提取两种包涵体蛋白,经SDS-PAGE电泳分析表明两个蛋白均被表达,大小分别为33KD和12KD;将两种包涵体蛋白和HBcAg107-115抗原肽共同稀释复性,以组装成MHC-肽复合物单体;用超滤器浓缩复性产物;用凝胶过滤层析技术纯化MHC-肽复合物单体,经SDS-PAGE电泳分析表明获得了目的蛋白;MHC-肽复合物单体在BirA酶的作用下生物素化;用超滤管离心去除生物素化产物中游离的生物素;用直接ELISA法定性鉴定生物素化产物;用BCA法测定生物素化蛋白浓度,并将生物素化蛋白和PE标记的链亲和素以4:1的量混合作用,从而得到MHC-肽四聚体。(2)HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体活性的检测取免疫的转基因鼠两只,其中一只为对照;取出脾脏,分离出脾脏细胞并调节浓度;先后用制备的MHC-肽四聚体、FICT标记的anti-CD8~+抗体和PE-Cy5标记的anti-CD3~+抗体对脾脏细胞染色,使用流式细胞术分析CD3~+、CD8~+和MHC-肽四聚体~+的细胞群频率。(3)SCT改造为HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体将BirA酶底物序列和PreScission蛋白酶切位点序列分别设计成引物,引物中引入BamHI和XhoI酶切位点,以pcDNA3.0-SCT为模板,通过重迭PCR技术,获得依次含PreScission蛋白酶切位点、SCT和BirA酶底物的基因序列;获得的基因序列用BamHI和XhoI酶后,与同样酶切过的载体pET32c(+)连接;连接产物用电转化法转化大肠杆菌JM109中;先进行抗性筛选,对获得的克隆再进行菌落PCR鉴定和酶切鉴定,获得重组载体;用化学法将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中;对转化菌落进行培养和用IPTG诱导,分离菌体进行SDS-PAGE电泳分析,表明蛋白以包涵体存在,大小与预期一致;提取包涵体,进行稀释复性;用超滤器浓缩复性产物;复性产物换用PreScission蛋白酶缓冲液,加入PreScission蛋白酶以切除融合表达的标签;酶切产物经SDS-PAGE电泳分析表明大部分蛋白被切开;酶切产物先后经Ni离子亲和层析和GST亲和层析纯化,经SDS-PAGE电泳分析表明获得了纯的目的蛋白;对目的蛋白再进行和MHC-肽四聚体构建的基本方法一样的生物素化等过程,最后得到MHC-肽四聚体。(4)对比分析构建MHC-肽四聚体的两种方法,得出基于SCT构建MHC-肽四聚体的优越性。结果和结论(1)构建了有活性的HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚体,可以将其用于检测和监测乙型肝炎患者或实验动物中HBcAg107-115表位特异性CTL。(2)构建了重组载体pSB1,为今后进一步研究SCT-BSP可溶性表达打下了基础。(3)将SCT-BSP构建成了MHC-肽四聚体,其方法相比构建MHC-肽四聚体的基本方法具有方便、快捷、节约成本和适合规模化生产等优势,为MHC-肽四聚体技术改造提供了新思路。(本文来源于《西南大学》期刊2007-05-25)
肽四聚体论文开题报告
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)是一种存在于脊椎动物中的由一个庞大的基因家族编码的细胞表面分子,其产物是参与抗原提呈和T细胞激活的关键分子。不同种属动物的MHC及其编码的抗原系列有不同的命名,猪的MHC分子又叫做猪白细胞抗原(SLA)。MHC-I四聚体可以对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)进行检测和筛选,已作为研究机体细胞免疫功能、评价特异性免疫治疗和探究疾病机理的重要工具。本研究中,首先亚克隆六个品系SLA-2-BSP(重链)胞外区以及一类sβ2m(轻链)成熟肽基因。包括叁个国外品系长白猪(YC)、大约克猪(DCY)、托佩克猪(TPK),叁个国内地方品系荷包猪(HB)、莱芜黑猪(LWH)和烟台黑猪(YTH)。随后,分别采用pET-21a(+)/E.coli或pET-28a(+)/E.coli表达系分别高效表达SLA-2-BSP和sβ2m重组蛋白,并对重组蛋白进行纯化。通过生物信息学的方法,预测和合成猪口蹄疫病毒VP1和RNA聚合酶3D中的T细胞表位多肽,通过ELISPOT方法对预测表位多肽进行特异性筛选。随后,将备选表位多肽与纯化后的重链、轻链重组蛋白进行体外共折迭复性、过分子筛鉴定SLA-2-BSP与特异性多肽结合,并分离出SLA-2-BSP/肽复合单体蛋白。在此基础上,将SLA-2/HB/肽复合单体生物素化后与FITC标记链霉亲和素反应生成SLA-2/肽四聚体,并通过流式细胞术(FACS)对SLA-2/肽四聚体功能进行验证。本研究通过ELISPOT方法鉴定得到了猪口蹄疫病毒VP1的一条特异性多肽表位,并成功构建了该多肽表位的SLA-2/肽四聚体,检测了针对于该表位的特异性CTL,初步建立了猪四聚体技术平台,为研究猪特异性CTL免疫应答以及T表位筛选奠定基础。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肽四聚体论文参考文献
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[8].吴战宏,李子博,陈小元,李方.~(18)F标记的RGD肽四聚体(~(18)F-FPRGD4)的制备和microPET显像[C].首届全国肿瘤核医学新技术研讨会论文集.2007
[9].刘光亮.BF2/肽四聚体的构建及其在传染性支气管炎病毒特异性T细胞反应评价中的应用[D].中国农业科学院.2007
[10].李绍飞.MHC-肽四聚体的构建及其技术改造研究[D].西南大学.2007