生物素操纵子基因论文_白晓婷

导读:本文包含了生物素操纵子基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,枯草杆菌,生物,芽孢,大肠杆菌,枯草,杆菌。

生物素操纵子基因论文文献综述

白晓婷^[1]（2006）在《枯草杆菌生物素操纵元基因的整合与表达》一文中研究指出生物素(vitamin H)是一种含硫维生素,是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一,随着生物素缺乏症在多种养殖动物中的出现,人们已经对生物素的营养生理功能有了全新的认识,并使其成为最受重视的水溶性维生素之一。生物素在畜牧业、分子生物学、生物发酵及医药行业等领域应用广泛。生物素不能直接从自然界获得,而我国所用的生物素均从日本、美国等国家进口,且价格昂贵,因此,进行生物素合成的研究是非常必要的。目前,利用基因工程技术生产生物素是国际上高技术竞争的又一热点。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌,细胞壁不含内毒素,能分泌大量蛋白到体外,为一些重要工业酶制剂的生产菌种。而影响克隆基因表达效率的因素有2个:第一是启动子的强度;第二是基因的拷贝数,但由于其在枯草杆菌中存在分离复制的不稳定及外源基因的克隆表达效率低的现象,将外源目的基因整合到染色体上复制表达是解决染色体外复制质粒在宿主中遗传不稳定现象的有效策略。因此本研究以枯草芽孢杆菌1A747菌株为研究材料,通过同源重组,将强的启动子pglv以及Cm基因整合到枯草杆菌染色体上,增加生物素操纵元基因的拷贝数,对其进行功能表达及检测。设计引物以PCR方式扩枯草杆菌生物素操纵元基因bioWAFDB,得到整合载体YG50,根据这五个基因同源于与枯草杆菌1A747,通过单交叉整合方式将质粒YG50滚环式全部带入1A747染色体基因组,得到单交叉整合菌BI1。分别用五对引物,即intedia-1,intedia-2,bioW-bioB,bioB-bioW,Spec-bioF,PCR扩增法鉴定整合菌BI1。设计引物Con-up和Con-down,以T载体为模板,PCR扩增出Con片断,从TA克隆的质粒BL46上用限制性内切酶KpnI和ApaI消化,与相同酶切消化回收的E3骨架连接,得到质粒BL57。设计引物Cm-up和Cm-down,以PDL为模板,PCR扩增出Cm基因,用限制性内切酶ApaI和BamHI消化TA克隆的质粒BL47,与相同酶切消化回收的BL57载体连接,得到质粒BL59。同样设计引物pglvW-up和pglvW-down,从实验室已构建好的质粒QJ34上PCR扩增出启动子pglv与bioW基因,TA克隆的质粒为BL48,用限制性内切酶BamHI和SacI消化,与相同方式酶切消化回收的E3骨架连接,得到质粒BL56。再用限制性内切酶KpnI和BamHI消化BL59,回收Con片断和Cm基因,用相同的酶消化回收的BL56载体连接,得到最终的双交叉载体BL60。用限制性内切酶ScaI线性化质粒BL60,由于Con片断和bioW基因分别同源于单交叉整合菌BI1染色体上的同名基因,因此,它们之间的Cm基因和pglv启动子通过双交叉整合方式替换掉枯草杆菌BI1原来染色体上的Spec抗性基因和P_(bio)启动子,得到整(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2006-05-01）

杨朝霞^[2]（2004）在《枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆与功能表达研究》一文中研究指出本研究以大肠杆菌（E. coli）克隆载体pUC19为模板，分别用两对引物扩增了含有复制起始序列（ori）和复制蛋白基因（rep）的700bp 片段，以枯草芽孢杆菌（B.subtilis）质粒载体pGDV1为基本骨架，构建了叁个带有氯霉素抗性基因的大肠杆菌－枯草芽孢杆菌小型穿梭载体pGDVM、pGDVM1和pGDVM2。经大肠杆菌－枯草杆菌反复穿梭实验和细菌连续培养分析检测，结果证明：含大肠杆菌pUC19复制起始区（ori）和复制起始蛋白基因（rep）的700bp克隆片段在大肠杆菌中具有完全的复制功能；构建的叁个质粒载体在大肠杆菌和枯草杆菌中能稳定地遗传。这叁个穿梭质粒载体分子较小，仅3kb左右；具有较高的拷贝数（在枯草杆菌中约150-200拷贝数），带有多个不同的克隆位点，方便插入目标基因，并且带有氯霉素抗性基因，可以为受体菌提供理想的抗性筛选标记。该系列载体可以作为枯草杆菌理想的基因工程菌构建骨架。本研究成功地克隆了枯草杆菌生物素操纵子基因bioB、bioW 和基因簇bioWAFDB片段；以大肠杆菌表达质粒载体pEXT20为骨架，分别构建了bioW、bioB和bioWAFDB诱导型表达载体pEXT20bioW、pEXT20bioB和pEXT20bioWAFDB，可以通过IPTG诱导，在大肠杆菌中进行表达。通过它们与大肠杆菌生物素生物合成基因系列bioF、bioB、bioC、bioD和bioA缺陷株R874、R875、R876、R877和R879的遗传互补实验，证明：枯草杆菌生物素基因bioA、bioB、bioD和 bioF在大肠杆菌中功能正常； bioW基因（编码庚二酰CoA合成酶）的表达载体对大肠杆菌缺陷株没有遗传互补作用，但是bioW基因编码的庚二酰CoA合成酶在大肠杆菌中有催化活性，可以催化外源的庚二酸合成庚二酰CoA，为生物素合成途径提供底物。经过IPTG不同水平的诱导表达实验，发现：枯草杆菌生物素基因bioWAFDB的过量表达对受体菌的生长有严重抑制作用，该抑制作用主要是由bioW引起，并且不能通过添加二氨基庚二酸而解除。枯草杆菌bioB基因诱导表达产物未对大肠杆菌的生长造成抑制，实验结果为枯草杆菌生物素基因工程菌的构建及生物素发酵生产提供了有价值的理论依据。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2004-06-01）

林峰^[3]（2003）在《枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆、序列改造及功能表达研究》一文中研究指出利用基因工程技术生产生物素是国际上高技术竞争的又一热点。由于生物素能够提高家畜胴体质量和改善肉质，提高家畜繁殖力，是家畜品种性能正常发挥所必需的物质。目前，生物素只能通过化学合成方法获得，且均从国外进口，价格昂贵，制约了我国畜牧科技和产业的发展。随着基因工程技术的兴起，人们开始转向生物素生物合成的研究。生物合成方法可以进行生物素的专一性合成，克服了化学合成法收率低，不能专一性合成，需经高成本化学拆分过程才能获得d-生物素的弊端，可使生物素的生产成本降低，从而提高畜牧业的经济效益。我国尚无这方面的研究，因此，开展本研究具有重要的理论意义和经济价值。本研究以枯草杆菌ASl.1094菌株为研究材料，克隆了生物素操纵子基因，并对基因序列进行改造。而后对改造后的生物素操纵子基因进行了功能表达检测及bioW与bioB基因的诱导表达。旨在探索如何提高生物素操纵子基因的表达效率，为该操纵子基因的高效表达提供可行的研究路线和理论依据。并构建了可商业化操作的研究素材，为以后的研究提供探索性经验。本论文主要作了以下几方面的研究： 1．大片段基因组DNA的提取为了获得用于PCR扩增(长距离PCR扩增和分段PCR扩增)的高纯度、大片段(至少为PCR产物长度的4倍)的DNA模板，应用叁种方法：低熔点琼脂糖包埋法，SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提法和细菌基因组DNA提取试剂盒法，分别提取获得了枯草杆菌基因组DNA，并对3种方法的操作程序进行了不同程度的改进，结果表明：低熔点琼脂糖包埋法提取的基因组DNA片段明显大于后两种方法，采用0.5％琼脂糖凝胶电泳3h，仍然跑不出加样孔。将该方法提取的基因组DNA稀释100倍作为模板，采用长距离PCR方法，获得了枯草杆菌生物素操纵子基因全长。说明以低熔点琼脂糖包埋法提取枯草杆菌基因组DNA，并获得较大的DNA片段，是完全可行的。 2．枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆将枯草杆菌基因组DNA稀释后，通过PCR反应条件的优化，分别扩增得到了生物素操纵子基因的长距离PCR产物(10.3kb)和3个分段PCR产物。而后采用TA克隆方法，经PCR产物的纯化、两端加A、pGEM-T载体连接、转化大肠杆菌、阳性克隆的酶切鉴定及重组质粒测序，分别获得了生物素操纵子基因3个片段(bio-1、bio-2、bio-3)的克隆质粒。应用分子生物学软件对测序结果进行了分析，并与Genebank中枯草杆菌168菌株的生物素操纵子基因序列进行了对比分析：共有12个碱基差异，且7个碱基导致了氨基酸变异，但未出现移码突变现象。利用长距离PCR扩增引物为测序引物，利用PCR产物直接测序法，在长距离PCR产物两侧各测了1个反应，并与Genebank中168菌株序列进行了对比分析：两个菌株的序列基本吻合，只有1个碱基的差异。通过2种方法对3个基因片段的转化效率比较和质粒浓度的测定(重复多次)，结果表明:biow基因作为大肠杆菌的外源基因，插入高拷贝的pGEM一T载体中，重组后的质粒具有不稳定性。 3.枯草杆菌部分基因组文库的构建及筛选首先，通过对枯草杆菌生物素操纵子基因序列和基因组序列的分析，选择刀。脚Hl和KPnl位点。用这2个内切酶分别将基因组DNA和BluescriPt SKM13载体完全酶切消化，分别纯化回收(酶切的基因组DNA回收4.3一7kb间的片段)，并用几DNALigase连接，转化大肠杆菌DHS。。应用PCR快检法对构建的枯草杆菌部分基因组文库进行了筛选，共检测了250个菌落，得到了3个阳性克隆子，经酶切鉴定和测序，获得了生物素操纵子5.Ikb的BamHI一KPnl亚克隆片段。测序结果表明:ASI .1 094菌株与168菌株bioAFDB基因序列完全一致，9个差异碱基是由于PCR扩增导致的。枯草杆菌生物素操纵子基因4个亚克隆序列的测序结果证实，ASI .1 094菌株和168菌株生物素操纵子基因序列是完全一致的(见附件1)。 4.枯草杆菌生物素操纵子基因序列的改造基因序列改造的关键是删除bioB与biof基因间的终止子，在Bowe:等(1 996)[’97]序列研究分析的基础上，设计一对PcR引物，以bi。一2片段克隆质粒为模板，采用Skip PCR方法，得到了约4.3kb产物，以TA克隆方式，插入pGEM一T载体中。将经鉴定的阳性克隆质粒进行测序，结果表明:bioB与biol基因间的5 lbp的终止子序列已被删除。在基因序列分析的基础上，采用特征酶酶切的方式，还删除了生物素操纵子基因上、下游与生物合成无关的序列。并将改造后的枯草杆菌生物素操纵子基因的3个片段依次插入pGEM一T载体中。并经binw、bioB及biol基因3’端的引物进行PCR扩增和重组质粒酶切鉴定而得到证实。 5.改造后的生物素操纵子基因的功能表达检测及biow和 bioB基因的诱导表达为了检测改造后的生物素操纵子基因是否能够正常表达，我们利用生物素是细菌生长的必需物质这一特点，用4种大肠杆菌生物素缺陷株(R874、R875、R877、R879)经遗传互补分析表明:改造后的生物素操纵子中的bioA、binF、bioD、bioB4个基因均能够表达。因此，bioB与biof基因间终止子序列的删除，不影响基因的表达。同时也证实，虽然所克隆的枯草?(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2003-05-01）

生物素操纵子基因论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本研究以大肠杆菌（E. coli）克隆载体pUC19为模板，分别用两对引物扩增了含有复制起始序列（ori）和复制蛋白基因（rep）的700bp 片段，以枯草芽孢杆菌（B.subtilis）质粒载体pGDV1为基本骨架，构建了叁个带有氯霉素抗性基因的大肠杆菌－枯草芽孢杆菌小型穿梭载体pGDVM、pGDVM1和pGDVM2。经大肠杆菌－枯草杆菌反复穿梭实验和细菌连续培养分析检测，结果证明：含大肠杆菌pUC19复制起始区（ori）和复制起始蛋白基因（rep）的700bp克隆片段在大肠杆菌中具有完全的复制功能；构建的叁个质粒载体在大肠杆菌和枯草杆菌中能稳定地遗传。这叁个穿梭质粒载体分子较小，仅3kb左右；具有较高的拷贝数（在枯草杆菌中约150-200拷贝数），带有多个不同的克隆位点，方便插入目标基因，并且带有氯霉素抗性基因，可以为受体菌提供理想的抗性筛选标记。该系列载体可以作为枯草杆菌理想的基因工程菌构建骨架。本研究成功地克隆了枯草杆菌生物素操纵子基因bioB、bioW 和基因簇bioWAFDB片段；以大肠杆菌表达质粒载体pEXT20为骨架，分别构建了bioW、bioB和bioWAFDB诱导型表达载体pEXT20bioW、pEXT20bioB和pEXT20bioWAFDB，可以通过IPTG诱导，在大肠杆菌中进行表达。通过它们与大肠杆菌生物素生物合成基因系列bioF、bioB、bioC、bioD和bioA缺陷株R874、R875、R876、R877和R879的遗传互补实验，证明：枯草杆菌生物素基因bioA、bioB、bioD和 bioF在大肠杆菌中功能正常； bioW基因（编码庚二酰CoA合成酶）的表达载体对大肠杆菌缺陷株没有遗传互补作用，但是bioW基因编码的庚二酰CoA合成酶在大肠杆菌中有催化活性，可以催化外源的庚二酸合成庚二酰CoA，为生物素合成途径提供底物。经过IPTG不同水平的诱导表达实验，发现：枯草杆菌生物素基因bioWAFDB的过量表达对受体菌的生长有严重抑制作用，该抑制作用主要是由bioW引起，并且不能通过添加二氨基庚二酸而解除。枯草杆菌bioB基因诱导表达产物未对大肠杆菌的生长造成抑制，实验结果为枯草杆菌生物素基因工程菌的构建及生物素发酵生产提供了有价值的理论依据。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。