植物海藻糖合成途径基因TPPB的克隆及抗旱功能分析

植物海藻糖合成途径基因TPPB的克隆及抗旱功能分析

论文摘要

油菜Brassica napus L.属于十字花科芸薹属,是我国重要的油料作物,也是需水量大、耐旱性差的植物。在油菜的生长周期内,季节性干旱频繁发生,常导致出苗不齐、生长缓慢乃至产量下降。因此,通过基因工程培育抗旱型油菜对于降低干旱对其产量的影响有着重要的意义。海藻糖作为重要的细胞渗透保护剂,在非生物胁迫包括干旱、盐渍、冷冻等逆境中都发挥着重要的作用。前人研究发现将水稻中海藻糖合成途径基因OsTPP1在玉米中过表达,可以提高转基因玉米的抗旱性并显著增加其产量,这暗示TPP基因家族有可能响应干旱逆境。拟南芥作为十字花科的模式植物,可以为油菜抗旱功能基因的挖掘提供众多的候选基因。通过海藻糖合成基因在拟南芥抗旱响应的分子机制研究,还可以为揭示TPP基因在油菜干旱响应及其动态调控的分子机制提供理论指导。本文中,我们发现拟南芥海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(TPP)家族的成员AtTPPB基因功能缺失增加植株的干旱敏感,而过表达AtTPPB可以提高植株的耐旱能力。通过酵母单杂交实验表明,DREB1A能够直接结合AtTPPB基因启动子区的DRE/CRT元件,说明DREB1A可能通过结合于AtTPPB基因的启动子来调控AtTPPB基因的表达。为了探索AtTPPB基因响应干旱胁迫的分子机制,我们进一步对野生型、突变体和过表达纯合株系进行了RNA-seq数据分析。GO富集分析显示在干旱胁迫条件下,差异基因显著性富集在与氧化胁迫相关的通路中,表明AtTPPB可能参与干旱条件下活性氧含量的调控。进一步的DAB染色结果表明,与野生型相比,干旱诱导的活性氧在tppb突变体中明显积累,而在AtTPPB过表达植株中降低。这表明AtTPPB可能通过影响活性氧的清除来保护细胞膜的稳定性,从而参与植物的抗旱响应。同时,DAB染色结果显示拟南芥dreb1a突变体相对于野生型活性氧水平明显提高,而DREB1A过表达植株表现出较低的活性氧水平,说明TPPB和DREB1A对干旱条件活性氧水平的调控具有一致性。综上所述,本研究结果显示,干旱胁迫下拟南芥AtTPPB基因表达受DREB1A激活,并通过影响清除活性氧相关基因的表达来维持体内的活性氧平衡,从而正调控干旱胁迫响应。本课题的研究有助于揭示TPPB基因调控干旱胁迫的分子机制。基于TPPB基因在拟南芥中干旱表型及其机制的探索,我们将AtTPPB过表达载体遗传转化甘蓝型油菜并已得到转基因植株,以期培育出抗旱型油菜。这对于提高干旱条件下油菜的产量和品质,扩大其种植范围,以及以后油菜的抗旱性研究和生产都有着重要意义。

论文目录

  • 缩略词表
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 前言
  •   1.1 油菜抗旱的研究现状
  •   1.2 植物响应干旱胁迫的分子机制和信号通路
  •     1.2.1 依赖ABA的干旱信号转导
  •     1.2.2 不依赖ABA的干旱信号转导
  •   1.3 氧化胁迫与干旱逆境
  •     1.3.1 干旱逆境下不同细胞器活性氧的调节
  •     1.3.2 ROS在信号转导途径中的功能
  •   1.4 TPP基因家族的研究进展
  •     1.4.1 海藻糖的作用及合成通路
  •     1.4.2 TPP基因家族的研究进展
  •   1.5 立题依据和研究意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 供试材料
  •     2.1.2 菌株、载体和引物
  •     2.1.3 实验试剂
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 植物材料的培养
  •     2.2.2 拟南芥材料的土壤干旱处理
  •     2.2.3 RNA的提取与反转录
  •     2.2.4 突变体基因型的检测
  •     2.2.5 过表达株系的获得
  •     2.2.6 离体叶片失水率测定
  •     2.2.7 RT-PCR和 qRT-PCR
  •     2.2.8 酵母单杂交实验
  •     2.2.9 RNA-seq文库的构建与数据分析
  •     2.2.10 DAB染色
  •     2.2.11 拟南芥AtTPPB基因转化甘蓝型油菜
  • 3 结果
  •   3.1 拟南芥AtTPPB基因调控干旱响应的功能分析
  •     3.1.1 拟南芥AtTPPB基因功能缺失降低抗旱性
  •     3.1.2 拟南芥AtTPPB基因的过表达提高抗旱性
  •     3.1.3 拟南芥AtTPPB基因回补系的表型鉴定
  •     3.1.4 拟南芥AtTPPB基因启动子区顺式作用元件的分析
  •     3.1.5 转录因子DREB1A直接结合AtTPPB基因启动子区的干旱响应性元件DRE/CRT
  •     3.1.6 转录组分析野生型和OEB31-8 植株差异基因
  •     3.1.7 拟南芥AtTPPB基因过表达降低过氧化氢的积累
  •   3.2 拟南芥AtTPPB基因转化甘蓝型油菜
  •     3.2.1 拟南芥AtTPPB基因转化甘蓝型油菜的愈伤
  •     3.2.2 真空法介导拟南芥AtTPPB基因转化甘蓝型油菜
  •     3.2.3 蘸花法介导拟南芥AtTPPB基因转化甘蓝型油菜
  • 4 讨论
  •   4.1 拟南芥AtTPPB基因响应干旱胁迫
  •   4.2 拟南芥AtTPPB基因通过减少ROS的积累提高植物的耐旱性
  •   4.3 AtTPPB基因是DREB1A的下游靶标基因
  •   4.4 TPPB基因对甘蓝型油菜抗旱改良的影响
  • 5 总结与展望
  •   5.1 AtTPPB正调控拟南芥的抗旱性响应
  •   5.2 AtTPPB基因转化甘蓝型油菜对其抗旱性的影响
  • 参考文献
  • 附录 A 质粒pMDC140 的图谱
  • 附录 B 拟南芥AtTPPB基因过表达纯合系T0代的筛选
  • 附录 C 拟南芥tppb纯合系中T-DNA单拷贝插入验证
  • 附录 D 154个差异基因及其注释
  • 攻读硕士学位期间发表论文
  • 致谢
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 朱虹

    导师: 王凯

    关键词: 基因,活性氧,干旱,甘蓝型油菜

    来源: 福建农林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 福建农林大学

    分类号: S565.4;Q943.2

    总页数: 73

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    • [1].细胞外信号调节激酶在TPPB促进PC12产生可溶性淀粉样前体蛋白中的作用[J]. 中国病理生理杂志 2008(01)

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