气肿疽梭菌NanA基因真核表达载体的构建及小鼠免疫初探

论文摘要

气肿疽（Clostridium chauvoei）是一种急性、热性、败血性传染病,主要感染反刍动物,其典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,患部皮肤干硬易形成坏疽,食欲减退,呼吸困难。该病的流行有一定的地域性和季节性,在天气炎热的多雨季节多发生于潮湿的山谷、牧场。近年来常有爆发气肿疽的报道,为畜牧业和养殖业的发展带来了巨大的冲击,同时也逐渐地威胁到人类的健康和经济。为了制备安全有效的气肿疽核酸疫苗,有效控制该病的发生,本研究根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了一对特异性引物,以气肿疽梭菌总DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,对测序正确的NanA基因进行分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达载体连接,成功构建p VAX 1-NanA真核表达重组质粒并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达。将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫BALB/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠进行采血并分离血清,通过ELISA法测定血清中的IgG,IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-y、IL-4细胞因子水平。第三次免疫2周后,通过流式细胞仪测定小鼠脾脏淋巴细胞中的CD4+和CD8+水平。通过对小鼠的抗体水平、细胞因子水平和T细胞亚群含量检测,综合评价小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。研究结果表明:本试验成功扩增了气肿疽梭菌NanA基因,片段大小为1950bp,与参考序列相比,共存在3处核苷酸突变,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99.8%。该蛋白三级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,蛋白表面有多个抗原表位区域。pVAX1-NanA核酸疫苗接种BALB/c小鼠后,其血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组（P<0.05）;IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组（P<0.01）。淋巴细胞亚群CD4+、CD8+分析表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫组的CD4+和CD8+水平显著高于 pVAX1 组和 PBS 对照组（P<0.05）,pVAX1-NanA极酸疫苗组的CD4+ 和 CD8+ 比值高于 pVAX1 空载体组与 PBS对照组,pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异。本试验为NanA蛋白功能的深入研究提供了参考,为气肿疽梭菌 NanA基因核酸疫苗的研发奠定了一定的基础。

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摘要

Abstract

前言

1 气肿疽概述

2 病原学特征

2.1 生物学特性

2.2 抗原及毒力因子

3 临床症状及病理变化

4 流行现状及发病原因

4.1 气肿疽流行现状

4.2 发病原因

5 诊断与防制

5.1 诊断方法

5.2 防制措施

6 气肿疽疫苗研究进展

7 研究目的与意义

材料与方法

1 材料

1.1 细胞与菌株

1.2 实验动物

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

1.5 济液配制

2 方法

2.1 引物设计

2.2 气肿疽梭菌的培养

2.3 气肿疽梭菌DNA的提取

2.4 气肿疽NanA目的基因的扩增

2.5 NanA目的基因的克隆

2.6 NanA基因的序列测定及分析

2.7 真核表达载体pVAXI-NanA的构建

2.8 细胞培养与传代

2.9 重组质粒pVAX1-NanA的表达分析

2.10 动物免疫试验

2.11 小鼠血清中免疫水平的检测

结果

1 细菌血平板培养及镜检结果

2 NanA基因的扩增

3 重组质粒pMD 18-T-NanA的鉴定

3.1 重组质粒pMD18-T-NanA的PCR鉴定

3.2 重组质粒pMD 18-T-NanA的双酶切鉴定

4 NanA基因克隆产物的序列测定及分析

4.1 NanA基因核苷酸和氨基酸同源性比对

4.2 NanA蛋白的理化性质分析

4.3 NanA蛋白的二级结构预测

4.4 NanA蛋白的三级结构分子模型

5 重组表达质粒pVAX1-NanA的鉴定

5.1 重组质粒pVAX1-NanA的PCR鉴定

5.2 重组质粒pVAX1-NanA的双酶切鉴定

6 IFAT检测NanA基因的表达

7 免疫效果评价

7.1 小鼠血清中IgG的水平

7.2 小鼠血清中IgG1的水平

7.3 小鼠血清中IgG2a的水平

7.4 小鼠血清中IFN-γ的水平

7.5 小鼠血清中IL-4的水平

7.6 小鼠血清中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群测定

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A （作者简介）

附录B （在研期间发表的论文）

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张皓

导师: 金鑫

关键词: 气肿疽梭菌,基因,真核表达,免疫学

来源: 延边大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 延边大学

分类号: S852.61

总页数: 59

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