金其煌[1]2004年在《乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的作用及G418诱导细胞凋亡的分子机制》文中提出哺乳动物的多种细胞在多种条件诱导凋亡过程中会表达乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE),用反义核酸抑制 AChE 的表达可以抑制一部分细胞的凋亡,但 AChE 在凋亡中的功能仍不清楚。为研究其可能的功能,我们通过转基因方法在 NRK(Normal Rat Kidney)细胞中过表达 AChE。正常 NRK 细胞中检测不到 AChE 的酯酶活性,但用 Western blot 方法可检测到 AChE 蛋白的存在。在多种细胞凋亡诱导因子刺激下,凋亡的 NRK 细胞中出现了 AChE 酯酶活性,并且 AChE 的 mRNA 和蛋白也随着增加。在 NRK 细胞中过表达 AChE 蛋白没有诱导细胞凋亡,并且我们得到了稳定表达的细胞株,但这种细胞株的生长明显延缓了,而用稳定表达 AChE 反义核酸抑制 AChE 蛋白的表达却能促进细胞的生长。在无血清诱导下,MTT 实验结果显示 AChE 表达株的残留细胞活性比对照的低,而 AChE 反义核酸表达株的残留细胞活性比对照的高。这些结果说明在凋亡过程中 AChE 有两个作用,先是增加的 AChE 抑制细胞的生长,然后是促进细胞凋亡的进程。为检测 NRK 细胞中的无酯酶活性 AChE 在凋亡中可能的功能,我们用一种蛋白合成的抑制剂 G418 来诱导细胞凋亡。G418 诱导的凋亡 NRK 细胞中有非常明显的 AChE 酯酶活性,而这种 AChE 酯酶活性不依赖于新蛋白的合成和 caspases 的活性。用共聚焦显微镜观察 AChE 的细胞定位,观察到正常 NRK细胞中 AChE 定位于内质网上,而在凋亡的细胞中 AChE 分布于整个细胞。用透射电镜观察 AChE 酯酶活性的产物分布,发现产物主要定位在细胞核中,并有一
范文辉[2]2016年在《Furin和NPAS4对阿尔茨海默病的神经保护作用及机制研究》文中研究表明背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经退行性疾病,其主要神经病理学特征包括细胞外神经炎性斑(senile plagues,SPs,又称老年斑)、细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)以及由此造成的神经元和神经突触的缺失。AD的病因及其发病过程仍未彻底阐明,但目前已确定Aβ沉积是老年斑的主要成分,而tau蛋白过度磷酸化导致神经元纤维缠结。神经生长因子(NGF)已用来治疗AD并进入II期临床试验。而研究发现介导NGF由前体NGF转化而来的Furin在AD脑中也降低。Furin是一种前体蛋白转化酶,它还催化脑源性神经生长因子(BDNF)前体和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的成熟。这表明Furin在AD发病中的作用可能远大于NGF。目的:本研究(1)通过建立稳定表达Furin的神经元细胞系,分析Furin与细胞凋亡、内质网应激之间的关系以及Furin对Abeta代谢的影响;(2)通过真核表达质粒NPAS4转染原代神经元,分析NPAS4与tau蛋白清除之间的关系,基本解明Furin和NPAS4在AD病理环节中的作用及机制,为筛选治疗AD的靶分子奠定基础。方法:神经元细胞系sh-sy5y转染furin后经过筛选建立稳定表达furin的细胞系,然后采用免疫印迹(westernblot,wb)方法检测自噬、凋亡、内质网应激及其abeta代谢相关分子。通过真核表达质粒npas4转染原代神经元,采用免疫荧光(immunofluorescence,if)和免疫印迹(westernblot,wb)方法分析自噬相关分子的变化及其tau蛋白表达情况,然后用自噬药物处理细胞后wb检测tau蛋白变化。结果:(1)furin过表达能诱导自噬、保护氧化应激诱导的凋亡、抑制内质网应激。我们还发现,在稳定表达furin的细胞中,ire1α的磷酸化显著增加,在h2o2和tunicamycin存在时更加明显。但perk、atf6的变化不显着,提示furin选择性激活了ire1α,但这一现象还需要动物实验验证。(2)jnk和erk是ire1α的下游分子,ire1α在ers时独立促进了依赖于jnk的自噬,且这种作用只依赖于ire1α的激酶活性,而与ire1α的内切酶活性无关。结果提示ire1α可能是通过jnk/erk调节自噬的。因此我们推测furin促进自噬的作用可能与ire1α-jnk/erk通路有关。(3)furin能影响app代谢酶类和减少aβ产生。根据以上结果我们推测:furin一方面通过bdnf促进神经元树突生长和学习和记忆,并对抗氧化应激损伤和凋亡;另一方面furin通过ire1α-自噬途径,以及通过影响adam10/ps1活性,最终减轻aβ沉积,从而改善ad的认知障碍。(4)npas4过表达诱导神经元自噬。cq处理后lc3-ii和p62蛋白水平增加比npas4组更明显,说明npas4能诱导自噬通量。(5)自噬抑制(3-ma或cq)或诱导(血清饥饿)后,我们发现,血清饥饿诱导的自噬降低了内源性总的和磷酸化tau蛋白水平,在NPAS4过表达时这一现象更加明显。3-MA或CQ处理后内源性总的和磷酸化tau蛋白均升高,但是NPAS4过表达反转了它的提高。这些结果表明自噬活性提高对tau蛋白的清除是有益的。(6)我们用MG132抑制UPS后发现tau清除被抑制,同时MG132并没有影响自噬(LC3-II没变),暗示出NPAS4可能通过一个未知的UPS机制清除tau蛋白。(7)NPAS4并没有影响使tau磷酸化的激酶。结论:Furin一方面通过BDNF促进神经元树突生长和学习和记忆,并对抗氧化应激损伤和凋亡;另一方面Furin通过IRE1α-自噬途径,以及通过影响ADAM10/PS1活性,最终减轻Aβ沉积,从而改善AD的认知障碍。NPAS4过表达能诱导自噬并降低内源性tau表达,且这一机制由自噬介导。Tau蛋白尤其是磷酸化tau蛋白的清除对于治疗AD等tau病具有重要意义。因此本研究的发现可能对于神经退行性疾病的治疗提供新的思路。
周小霞[3]2009年在《东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因克隆及其功能研究》文中认为乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE, EC 3.1.1.7)是分布于脊椎动物胆碱能神经节、线虫及无脊椎动物神经肌肉接头处的重要水解酶。在生物体内,它能特异性催化乙酰胆碱的水解反应,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递。由于有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂能特异性抑制乙酰胆碱酯酶的活性,阻断乙酰胆碱的水解,使乙酰胆碱在突触间隙积累并引起昆虫中毒死亡,因此乙酰胆碱酯酶是有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis, Meyen)是我国重点防治的迁飞性农牧业害虫。目前,有机磷杀虫剂仍然是杀灭东亚飞蝗的主要化学农药。在长期的选择压力下,东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性种群已经产生。对东亚飞蝗自然种群乙酰胆碱酯酶敏感性的对比研究结果显示:抗性种群乙酰胆碱酯酶对毒死蜱、内吸磷、对硫磷的敏感性分别是敏感种群的62倍、2.0倍和1.6倍。因此,不敏感型乙酰胆碱酯酶很可能是引起东亚飞蝗杀虫剂抗性的机制。尽管不敏感型乙酰胆碱酯酶已被证明是引起许多昆虫抗药性的重要机制,但对东亚飞蝗而言,由于未知其乙酰胆碱酯酶基因序列,因此不敏感型乙酰胆碱酯酶产生的分子生物学机制尚不清楚。本研究通过比对昆虫乙酰胆碱酯酶蛋白质序列,找出其氨基酸保守区域,兼顾东亚飞蝗密码子使用频率,设计简并引物,PCR扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因保守片段;以东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因保守序列为依据,设计基因特异性引物,采用RACE技术扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶cDNA全长;在得到东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶cDNA全长的基础上,通过基因干扰和基因表达研究东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的功能。东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的克隆及其功能研究,有助于从分子水平上阐明东亚飞蝗有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂抗性产生的分子生物学机制,对于开发新型化学及生物杀虫剂具有十分重要的意义。1.乙酰胆碱酯酶基因的克隆以东亚飞蝗基因组DNA为模板,用根据乙酰胆碱酯酶保守序列设计的简并引物进行PCR实验,获得了一个263 bp的基因片段。生物信息学分析表明,该片段编码的氨基酸序列与德国小蠊(Blattella germanica)AChE1有93%的相似性,与嗜卷书虱(Liposcelis bostrychophila) AChE有90%的相似性,与黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)AChE2有89%的相似性。在东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶保守序列基础上,设计基因特异性引物,采用RACE技术克隆了东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因,登录到GenBank,登录号为EU231603。克隆到的东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因cDNA序列长2255bp,开放阅读框长1638bp,共编码546个氨基酸,5′-和3′-端非编码区分别长286bp和328bp。进化树分析表明,该基因的编码产物属于Ⅰ型乙酰胆碱酯酶,其一级结构具有如下乙酰胆碱酯酶的共同特征:①保守的催化叁联体活性位点,即S151(S200 in Torpedo),E277(327)和H391(440);②胆碱结合位点W36(W84 in Torpedo);③形成链内二硫键的6个半胱氨酸(C67-C94、C254-C265、C402-C521 in Torpedo),东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶有5个保守的半胱氨酸(C26, C205–C218和C353–C519),缺乏形成第一个链内二硫键的第一个半胱氨酸;④形成催化谷内衬的14个芳香族氨基酸残基(Y70、W84、W114、Y121、Y130、W233、W279、F288、F290、F330、F331、Y334、W 432和Y442 in Torpedo),有12个在东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶中保守(W36、W66、Y73、Y82、W184、W232、F240、F242、F280、F281、Y284和W 373);⑤包含丝氨酸活性位点的FGESAG序列,该序列在所有胆碱酯酶中保守。2.东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶与有机磷抗性之间的关系将体外转录制备的乙酰胆碱酯酶基因特异性dsRNA注射到东亚飞蝗四龄若虫血腔,检测dsRNA介导的基因沉默情况。实时荧光定量PCR结果显示,在mRNA水平上,乙酰胆碱酯酶基因表达下调了46.14%;ELISA结果显示,在蛋白质水平上,乙酰胆碱酯酶基因表达下调了47.36%;酶活测定结果显示,乙酰胆碱酯酶基因干扰组东亚飞蝗的乙酰胆碱酯酶比活是对照组的40%。说明RNA干扰能特异性沉默东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因的表达。马拉硫磷敏感性测定结果显示,干扰组蝗虫半数致死剂量LD_(50)为1.73μg/头,对照组LD_(50)为4.34μg/头,两者存在显着性差异(p<0.05)。该结果提示乙酰胆碱酯酶基因干扰会引起东亚飞蝗马拉硫磷敏感性增加,说明该乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂作用靶标和东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性相关基因。3.东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的表达构建了东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶真核表达载体,获得了高表达毕赤酵母菌株,经2.5%甲醇诱导培养九天,其表达量可达500μg·mL~(-1)。毕赤酵母表达上清经50%饱和度硫酸铵沉淀和His-Tag亲和层析后,可以获得纯净的重组乙酰胆碱酯酶,其比活可达8.1U·mg~(-1)。对重组乙酰胆碱酯酶的酶学特性研究显示,该酶对硫代乙酰胆碱的催化活性高于硫代丁酰胆碱,其催化硫代乙酰胆碱水解的Km为67.77μM;毒扁豆碱和BW284C51能特异性抑制重组乙酰胆碱酯酶的活性,当抑制剂的浓度为1×10~(-4)mol·L~(-1)时,酶活可分别被抑制69%和76%。
刘晓瑜[4]2011年在《阿尔茨海默病细胞损伤的相关机制及加兰他敏的神经保护作用研究》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种进行性中枢神经系统退行性疾病。其主要病理变化是脑内胆碱能神经元大量丢失和死亡。研究表明在AD病人脑组织中有大量p淀粉样蛋白(Aβ)沉积。作为细胞存活和功能的重要细胞器,以往研究已经证实线粒体的形态、运动和功能在AD时会受到影响,但关于其运动的长时程连续动态研究尚未见报道。另外,研究也表明AD病人脑内存在胆碱能系统功能异常,而囊泡乙酰胆碱转运体(vesicular acetylcholine transporter, VAChT)是胆碱能神经系统的重要组成部分,已有文献通过免疫组化和放射免疫方法证实AD病人脑内VAChT表达降低,但关于该囊泡的细胞内运动过程及在疾病中的作用的研究较少,且研究手段较单一。根据AD的相关病理变化和发病机制,目前临床上主要采用胆碱酯酶抑制剂治疗AD,加兰他敏就是其中的一种。关于其作用机制,已有研究证实它能够抑制Ap聚集、氧化应激和神经元凋亡等。但是,加兰他敏具体的神经保护机制还没有完全清楚,有待进一步探讨。本论文首先用Ap蛋白活性片段Aβ25-35诱导高分化PCI2细胞凋亡建立AD体外细胞模型,确定20μM Aβ25-35作用24 h为造模的最佳条件。然后在该模型基础上,利用激光共聚焦显微技术、流式细胞术、荧光酶标仪、活细胞工作站、全内反射荧光显微镜(TIRFM)、荧光染料染色、质粒转染、分子生物学技术和计算机图像处理等,对Aβ25-35诱导PC12细胞线粒体运动和功能变化、VAChT运动和蛋白表达变化及加兰他敏的神经保护机制进行了研究。结果发现：(1)Aβ25-35可以诱导PC12细胞线粒体形态运动和功能异常,在Aβ25-35作用早期,线粒体动力学改变是可逆的,依赖于暴露的时间和药物浓度；(2)正常情况下PC12细胞中单个囊泡在膜融合之前的转运,发现VAChT囊泡的运动主要有3种类型,分别为单个囊泡沿一条轨迹长距离运动、多个囊泡沿同一条轨迹运动和单个囊泡沿一条轨迹的双向往返运动,且以第1种运动类型最为常见。在此基础上进一步研究了Aβ25-35对VAChT运动的影响,发现20μM Aβ25-35作用24 h能明显抑制VAChT运动。同时检测到Aβ25-35能显着抑制VAChT蛋白的表达；(3)加兰他敏能抑制Aβ25-35聚集、Aβ25-35诱导的内质网钙释放、内质网应激相关蛋白GADD153和Grp78/94表达上升和下游的caspase-12活化增加。另外加兰他敏也能抑制Aβ25-35诱导的线粒体膜电位崩解、ROS产生、细胞色素c释放、Bcl-2/Bax比值下降和随后的caspase-9活化,最终抑制caspase-3活化,降低细胞凋亡。以上结果提示线粒体和VAChT在AD发生过程中起了重要作用,并且加兰他敏通过线粒体和内质网两条通路发挥了抗凋亡及神经保护作用；为进一步理解AD的病理机制提供了理论基础,也为相关药物研发提供了新的药物靶点。
魏传杰[5]2014年在《抑制Beclin1促进TOCP诱导人成神经瘤SH-SY5Y细胞产生凋亡》文中指出目的探讨自噬与凋亡在叁邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）诱发SH-SY5Y细胞神经毒性中的关系，进一步阐述TOCP神经毒性的作用机制。方法1．采用RNAi技术，构建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体；将重组质粒转染SH-SY5Y细胞，G418筛选出Beclin1稳定低表达的SH-SY5Y细胞系（sh-Beclin1细胞系），RT-PCR与Western blot检测sh-Beclin1细胞系Beclin1基因的mRNA与蛋白表达。2．不同浓度TOCP（0，0.5mM）分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h，MDC染色观察两组细胞系自噬泡的数量变化，Western blot检测两组细胞中LC3-II蛋白的表达。3．不同浓度TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h，Hoechst33258染色观察两组细胞系细胞核形态，流式细胞仪检测两组细胞系细胞周期的变化,Western blot检测两组细胞系凋亡相关基因Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白的表达。结果1．测序证实pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体构建成功。荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot技术鉴定Beclin1基因稳定敲减SH-SY5Y细胞系建立成功。2．MDC染色结果和Western blot结果显示，与对照组SH-SY5Y细胞比较，TOCP (0.5mmol/L)处理sh-Beclin1细胞系48h后，产生自噬泡的数量明显减少，LC3-II蛋白表达明显降低。3．与对照组SH-SY5Y细胞比较，sh-Beclin1细胞经不同浓度TOCP（0，1.0mM）处理48h后进行Hoechst33258染色，在荧光显微镜下可见细胞核蓝色荧光增强，染色质聚集明显，且有部分细胞出现细胞核碎裂、溶解，细胞出现典型的凋亡现象，且产生核碎裂的细胞数量随TOCP浓度升高而增加。4．不同浓度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后，流式细胞仪检测细胞周期结果显示：与对照组SH-SY5Y细胞比较，sh-Beclin1细胞G1期前有亚二倍体凋亡峰的出现，并凋亡细胞数量随着TOCP浓度增高而增多，并呈现剂量-效应关系（P<0.05）。5．不同浓度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后，Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示：在SH-SY5Y细胞中，凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值无升高或降低趋势，Cleaved-caspase-3蛋白表达无显着变化，在sh-Beclin1细胞中，凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值呈降低，并呈剂量-效应关系（P<0.05），cleaved-caspase-3蛋白表达无显着变化。结论1．干扰Beclin1基因的表达可抑制TOCP诱导的SH-SY5Y细胞产生自噬，Beclin1蛋白在TOCP诱导的自噬中起重要的作用。2．TOCP诱发Beclin1基因敲减SH-SY5Y细胞系产生线粒体介导的非Caspase-3依赖的凋亡。
常婷[6]2010年在《AChR-Fc融合蛋白靶向BCR治疗重症肌无力的基础研究》文中认为重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是由自身抗体介导、T细胞参与、补体依赖的自身免疫性疾病,其致病性自身抗体以及病理作用靶点明确,动物模型易建立,是研究自身免疫性疾病治疗手段的理想模型之一。位于神经肌肉接头突触后膜的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AChR)是MG致病性自身抗体攻击的靶点,患者体内的抗AChR抗体与AChR结合后,在补体等因素协同下破坏突触后膜的AChR,临床出现横纹肌收缩无力等症状,严重者累及呼吸肌出现肌无力危象而死亡。目前主要采用胆碱酯酶抑制剂和免疫抑制剂进行治疗,但治疗效果仍然不理想。因此,人们一直在探索一种特异而有效的治疗手段。近年来,越来越多的证据表明B淋巴细胞在免疫应答中具有更为广泛的作用,而不仅仅是被动接受信号刺激而分泌抗体。B细胞还可以递呈抗原、调节抗原递呈细胞和T细胞的功能、分泌多种细胞因子,并表达以往认为只限于其他细胞类型的多种受体/配体。而当机体免疫系统对自身成分失耐受时,病理性B细胞的作用就更加复杂,也更加重要,尤其在以自身抗体为主要效应机制的体液自身免疫性疾病中。因此,以B细胞为靶细胞进行免疫治疗将会有效控制多种自身免疫性疾病。鉴于AChRAb是MG的重要致病因子,如果能从源头上清除分泌AChRAb的B细胞,将会有效控制病情。然而,目前尚无特异性清除AChR反应性B细胞的手段。本研究拟将AChRα亚单位胞外段基因与Fc基因连接,表达AChR-Fc融合蛋白,其AChRα亚单位胞外段特异性结合AChR反应性B细胞,同时Fc段结合该B细胞表面抑制性受体FcγRⅡB,抑制B细胞活化、促进其凋亡,或Fc结合于单核-巨噬细胞、补体表面的Fcγ受体,介导单核-巨噬细胞或补体对该致病B细胞的特异性杀伤。我们利用AChRAb杂交瘤细胞分析融合蛋白的结合、抑制作用以及其介导的细胞毒作用,同时用重组表达的AChRα亚单位胞外段(extracellular domain,ECD)蛋白免疫Lewis大鼠制备实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)动物模型,分别通过体外以及在体研究,观察融合蛋白对AChR反应性B细胞的作用。一、AChR-Fc融合蛋白的表达、纯化和鉴定以AChRα亚单位基因片段为模板,通过PCR的方法扩增AChRα亚单位胞外段全长基因片段(Hα1-210),将其插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3的基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210;瞬时转染CHO-K1细胞后取上清,ELISA和Western blot鉴定AChR-Fc融合蛋白的表达;G418筛选转染后细胞,建立稳定表达细胞系;Protein A亲和层析柱纯化表达的融合蛋白,SDS-PAGE进一步分析AChR-Fc融合蛋白的表达和纯度。二、体外细胞系实验分析AChR-Fc融合蛋白对分泌AChRAb杂交瘤细胞的结合和抑制作用用含10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)RPMI1640适应性培养分泌AChRAb的杂交瘤细胞系TIB175,利用FITC-anti rat CD32和FITC-anti ratκ+λ轻链抗体,流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析表明杂交瘤细胞表面表达BCR和FcγRⅡB;将融合蛋白同杂交瘤细胞共孵育之后,利用Biotin-anti humanγchain的抗体结合FITC-Avidin显示融合蛋白对杂交瘤细胞具有较强的结合能力。将融合蛋白以不同浓度(100μg/ml, 50μg/ml, 10μg/ml以及0μg/ml)分别与培养的杂交瘤细胞TIB175共孵育,以人IgG作为对照,48小时后活细胞计数结果显示融合蛋白作用组活细胞所占比例呈剂量依赖方式下降;AnnexinV/PI染色,FCM分析结果显示融合蛋白可显着促进杂交瘤细胞的凋亡;Tunel染色、激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察进一步证实了细胞的凋亡;在孵育结束前16h加入BrdU,孵育结束后用BrdU试剂盒进行检测,FCM分析结果显示融合蛋白治疗组BrdU阳性细胞数明显低于其他治疗组;细胞周期结果也显示融合蛋白可使细胞发生G1期阻滞,从而抑制细胞的增生。此外,融合蛋白与杂交瘤细胞共孵育后加入人外周血单核细胞作为效应细胞、补体作为效应分子,FCM分析表明融合蛋白可通过其Fc段介导效应细胞和补体特异性诱导杂交瘤细胞的凋亡。叁、分析AChR-Fc融合蛋白对EAMG动物模型AChR反应性B细胞的作用用重组表达的ECD蛋白混合完全弗氏佐剂免疫Lewis大鼠构建EAMG动物模型。分离大鼠脾细胞,体外同融合蛋白孵育后,FCM分析结果显示融合蛋白和脾细胞有较高的亲和力;ELISPOT检测发现融合蛋白作用组AChR反应性B细胞数目呈剂量依赖式下降,将融合蛋白和脾细胞作用48h后,FCM结果显示融合蛋白在体外可诱导CD19+B细胞的凋亡。将融合蛋白以及人IgG尾静脉注射EAMG大鼠,对照组给予PBS,每周3次,共4周进行治疗。每周留取血清标本,ELISA检测发现融合蛋白治疗组血清中抗体滴度明显下降。进一步用ELISPOT分析发现融合蛋白治疗组脾脏中AChR反应性B细胞数清除率明显增高。本研究成功表达了AChR-Fc融合蛋白,并通过体内外实验初步分析了融合蛋白对AChR反应性B细胞的作用,为进一步研究融合蛋白对MG的治疗作用奠定了基础。本研究首次提出靶向清除自身反应性B细胞的新策略,有望建立特异性治疗自身免疫病的新平台。
滕晓华[7]2002年在《突变型Presenilin-1基因对全反式维甲酸诱导PC12细胞功能的影响》文中研究说明Presenilin-1(PS-1)基因突变是引起早发性家族性常染色体显性遗传性阿尔茨海默病(EOFAD)的主要原因之一。研究表明PS-1基因突变可以导致APP的异常裂解，使有害的Aβ42生成增多；并可以增强细胞对凋亡诱导因子的敏感性。现有的资料，无论是形态学还是相关的功能研究结果均已证实，阿尔茨海默病(AD)的发病主要累及胆碱能神经元。以胆碱能神经元作为靶细胞研究AD的发病机制及相关的诊断、治疗措施得到人们的公认。然而，目前在体外分离、纯化培养神经元依然面临许多困难，因此，寻找一种替代途径成为人们研究的又一个重点。本课题利用全反式维甲酸(RA)作为诱导剂，体外诱导PC12细胞，运用MTT法、免疫细胞化学、免疫荧光染色、流式细胞仪、放射酶学和TUNEL法等方法，通过观察形态学、细胞生长曲线和生长周期、胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AchE)活性变化及细胞凋亡的情况，研究不同浓度RA诱导PC12细胞呈现拟胆碱能神经元表型的情况，探讨RA诱导PC12细胞呈现拟胆碱能神经元表型的最佳条件，为体外研究AD的发病提供细胞模型；同时，利用基因工程技术，将野生型(WT)和突变型PS-1基因L286V转染诱导的拟胆碱能神经元，观察突变型PS-1基因L286V对拟胆碱能神经元形态、细胞生长曲线、生长周期、ChAT和AchE活性的变化，以及细胞凋亡的影响，探讨PS-1基因突变引起细胞形态和功能改变的可能机制。主要结果如下：
王彬彬[8]2015年在《突变对家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因结构及功能的影响研究》文中进行了进一步梳理乙酰胆碱酯酶(acetylcholinestrase, AChE, EC 3.1.1.7)是一种重要的丝氨酸水解酶,其经典功能是在神经传导中,将神经递质乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)催化水解为乙酸和胆碱,终止神经冲动,维持正常的神经传导。AChE主要存在于神经元和肌肉接头处,终止神经冲动向肌肉细胞的正常传递。AChE是有机磷(OPs)和氨基甲酸酯(CBs)类杀虫剂的作用靶标。杀虫剂与AChE活性中心位点丝氨酸残基结合,占据酶的催化区域,ACh不能进入和降解。ACh长时间结合在乙酰胆碱受体(AChR)上,持续刺激肌肉细胞,引起昆虫抽搐甚至死亡。此外,AChE还与神经发育、神经细胞分化与迁移、突触的形成有关；AChE参与造血细胞的增殖与分化,参与巨核细胞的形成；AChE还与肿瘤增殖、细胞凋亡有关。AChE表达量的增加、膜锚定的增加、特定位点的突变是昆虫抗药性增加的重要原因。家蚕AChE有两种类型(AChE1和AChE2),家蚕AChE1对农药相对敏感。为了研究特定位点的突变(A286S、G312A、L537S)对家蚕AChE1结构、活性以及对农药敏感性的影响,本研究利用原核表达系统表达了突变前后的AChE1基因(wace1和mace1),经过分离和纯化制备了有活性的AChE,研究了活性及抑制动力学的变化；对突变前后的AChE1结构进行了预测,分析了影响AChE1功能的原因；将wace1及mace1转入BmN细胞,研究其在细胞中的表达特征,并进一步确定突变对AChE1活性及抑制动力学的影响；构建了家蚕通用型基因打靶载体(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk),并利用此载体对BmN细胞acel进行敲除；将mace1转入到家蚕,构建携带mace1的家蚕。主要研究结果如下：1 wace1和mace1的原核表达及功能分析为了研究突变对AChE1活性和抑制动力学的影响,本研究利用原核表达系统,对家蚕野生型AChE1 (wAChE1)和突变型AChE1 (mAChE1)进行了表达；经过复性和纯化得到有活性的AChE1,两者活性差异不显着；用10-6M的毒扁豆碱和10-3mg/mL的辛硫磷孵育后, mAChE1的剩余酶活力分别比w AChE1高4.42%和8.86%。结果表明,突变对AChE1酶的活性无明显影响,但降低了其的对毒扁豆碱和辛硫磷的敏感性。2 wAChEl和mAChE1的结构分析为了探究突变对AChE1结构的影响,本研究对突变前后AChE1的二级结构及叁维结构进行了预测和分析。结果发现,突变改变了AChE1的二级结构和叁维结构,影响了催化活性中心部位的空间构象。A286S、G312A突变后的氨基酸残基大于原先的残基,突变后氨基酸侧链伸向活性中心部位,距离仅有2.80 A和3.68 A。推测这影响大分子抑制剂与活性中心丝氨酸残基的结合,是mAChE1抑制剂敏感性降低的原因。3 wacel和mace1转基因细胞构建为了研究wace1与mace1在家蚕细胞中的表达特征及蛋白活性,本研究将vace1与mace1连接到转基因载体pIZT/V5-His,转入BmN细胞,通过筛选和鉴定得到转基因细胞。经过PCR和Western检测,acel在细胞中正常表达。测定了wace1和mace1转基因细胞中acel表达量,分别是对照的21.51倍和21.69倍。对转基因细胞AChE活力的检测显示,wace1和mace1转基因细胞AChE活力分别比对照组高10.62%和20.21%。用10-6M毒扁豆碱和10-3mg/mL辛硫磷分别与wace1和mace1转基因细胞酶液孵育后,mAChE的剩余酶活力比wAChE分别高7.47%和17.41%。结果表明,转入acel可以显着提高acel的表达量,acel特定位点的突变可以降低AChE对抑制剂的敏感性。4家蚕通用型基因打靶载体的构建及应用为了构建适合在家蚕中使用的通用型基因打靶载体,方便实现家蚕的简单基因敲除、条件基因敲除及基因敲入,打靶阳性个体的筛选。本研究以pBluescript ⅡSK+为骨架,插入了一个Actin3启动子驱动的GFP报告基因和一个IE启动子驱动的正向选择标记基因(新霉素磷酸转移酶基因,neo),并在其两侧各添加一个方向相同的FRT位点,以方便打靶成功后去除正向筛选标记基因,在GFP上游加入多克隆位点(multiple cloning site, MCS) MCSII,在MCSII和下游FRT两侧加入一个方向相同的LoxP以方便实现条件基因敲除,在两个LoxP外侧各加一个多克隆位点,加入一个attP以方便基因的敲入,加入一个Actin3启动子驱动的负选择标记基因(单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,HSV-tkl),构建家蚕通用型基因打靶载体(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk)。为了验证基因打靶载体的可行性,本研究利用此载体对家蚕BmN细胞的ace1进行了敲除。克隆acel的两段序列到家蚕通用型基因打靶载体,分别做为上下游交换臂,转染BmN细胞后,采用G418进行筛选,经筛选后细胞可见绿色荧光,表明GFP和neo正常表达。通过PCR鉴定,外源基因与基因组发生同源重组。结果表明构建的家蚕通用型基因打靶载体可用于家蚕基因打靶。5 mace1转基因家蚕的制备本研究将pIZT-mace1与脂质体混合,用精子介导法进行转基因,产下的蚕卵正常催青饲养至化蛹,记为GO代。利用体视荧光显微镜对绿色荧光蚕蛹进行筛选,取荧光蚕蛹,正常化蛾并交配产卵,催青饲养,记为G1代,并依次类推。提取G2代蚕蛾基因组,PCR鉴定GFP和转入的mace1,结果检测到GFP和mace1,表明转基因家蚕构建成功。本研究首次研究了突变对家蚕AChE1结构和功能的影响,发现叁个关键位点的突变,改变了AChE1的结构,降低了其对抑制剂的敏感性；构建了家蚕通用型基因打靶载体,利用此载体对家蚕acel进行打靶；构建转基因载体,并将mace1转入家蚕。本研究阐明了家蚕AChE1叁个位点的突变可以降低对抑制剂的敏感性,为研究AChE突变与抗药性的关系提供新的思路；为家蚕基因敲除和转基因提供素材；也为培育家蚕抗药性新品种提供材料。
余光[9]2012年在《阿尔茨海默病中I_2~(PP2A)/SET核运输障碍的机制研究》文中研究表明背景：阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者脑中蛋白磷酸酯酶PP2A活性降低，并被认为是导致tau蛋白过度磷酸化促细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles, NFTs)形成的主要原因。然而，AD脑内参与调节PP2A活性的机制尚未明了。Li等从牛肾抽提物中纯化出两种热稳定蛋白I1PP2（APHAP I）和I2PP2（ASET），二者均能特异且高效地抑制PP2A活性。在AD患者脑内，核蛋白SET水平显着增高，且主要分布在嗅球、海马、大脑皮质、尾壳核、丘脑等脑区；作为核蛋白，SET从核转运至胞浆，并发现与神经元胞浆内PP2A及异常过度磷酸化的tau蛋白共定位。上述研究说明AD患者脑内出现了胞浆SET异常聚积并且是tau蛋白过度磷酸化的关键上游机制。然而，核蛋白SET如何滞留并聚积于胞浆以及SET抑制PP2A活性的分子机制尚不清楚。亲核蛋白的核运输过程主要通过核定位信号(nuclear localization signal, NLS)和核输出信号(nuclear export signal, NES)来调节。其中，核定位信号NLS通常是亲核蛋白内具有一个带正电荷的肽核心（多聚赖氨酸），并且能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体(Nuclear Pore Complex,NPC)被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。核输出信号NES是指可被核孔复合体上的输出受体所识别，引导大分子从细胞核经NPC输出到细胞质的一段氨基酸序列，通常富含亮氨酸。本课题组近期研究发现：分别转染SET及携带外源性NLS的SET/NTF（N-Terminal Fragments, NTF即SET的N端片段，包含有在两个loxP位点间插入了外源性核定位信号NLS）于COS7细胞株，48h后，发现全长SET定位于核内、携带外源性NLS的SET/NTF片段也主要定位于细胞核内；但用Cre重组酶切除loxP位点间的NLS后，SET的N端片段转位于胞浆，且与tau共定位。这些结果提示：核定位信号NLS异常可能是导致SET核运输障碍的一个关键因素；内源性PP2A特异性抑制剂SET高表达可能通过抑制PP2A活性及其下游因素在AD样神经病变及学习记忆障碍中发挥重要作用。磷酸化修饰是核运输的重要调节机制，尤其是NLS磷酸化修饰被认为是影响其与核输入蛋白结合形成核输入复合物的一个重要因素。通过磷酸氨基酸分析、HPLC和放射性序列分析鉴定，Ser-9确定为SET主要的磷酸化位点。巧合的是，以Ser-9为中心的一段结构域序列(6-10aa)AKVSKK富含赖氨酸(lysine, K)，与目前多个公认的富含赖氨酸(碱性氨基酸，易于锚定核输入蛋白)的核定位信号NLS序列KKXXKX或XKXXKK(X为其它氨基酸)一致。因此，此段结构域中Ser9的磷酸化可作为研究NLS调节SET核运输的一个重要靶点。作为NLS特征性的富聚赖氨酸，其中每一赖氨酸对NLS锚定核输入蛋白的贡献进而影响核蛋白输入的作用可能会有不同，从而影响NLS的功能。目的：探讨SET核运输障碍的调节机制以及SET对PP2A活性抑制的分子机制，进一步阐明AD发病机理和寻求有效药物开发的分子靶点。方法：利用人类最长（tau441）基因稳定转染人胚肾HEK293细胞，即HEK293/tau细胞。在37C含95％的空气和5％CO2饱和湿度培养箱中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293/tau细胞。磷酸化丝氨酸9位点SET多克隆抗体anti-SET(phospho S9) antibody rabbit polyclonal antibody由Abmart公司提供。Iqbal博士友情馈赠AD患者以及年龄匹配的正常组大脑皮层切片。利用免疫组织化学方法检测AD大脑皮层神经元SET丝氨酸ser9位点的磷酸化程度及其亚细胞定位。通过基因定点突变SET内丝氨酸Ser-9为非极性氨基酸丙氨酸(Ala, A)，即SET(S9A)和极性带负电荷氨基酸(Glu, E)，即SET(S9E)，分别携带His标签，模拟SET的持续非磷酸化与磷酸化；再分别突变His-SET此段序列中的碱性氨基酸赖氨酸Lys-7，Lys-10和Lys-11为中性氨基酸丙氨酸，分别转染SET及SET突变体于HEK293/tau细胞株，48h后，通过激光共聚焦检测上述突变SET的亚细胞分布。通过免疫共沉淀方法检测相比于野生型SET，SET突变体与核输入蛋白Importin的结合程度。通过丝氨酸/苏氨酸检测试剂盒(Promega, Cat.#V2460)测定SET磷酸化修饰对PP2A活性的影响；利用免疫印迹方法检测SET磷酸化修饰后对tau蛋白Ser396,Thr231, Ser262, Thr205, Ser214, Ser404和Ser199位点磷酸化程度的影响。为了进一步明确6AKVSKK11序列是SET的核定位信号，并且在SET核运输中起到关键作用，通过人工合成Tat-NLS (Tat-AAKVSKKE)肽段，利用激光共聚集荧光显微镜观察Tat-NLS对内源性SET核定位及细胞内分布的影响。结果：本实验中我们发现AD大脑皮质神经元中SET丝氨酸Ser-9位点发生磷酸化，并且磷酸化SET在胞浆中发生聚集。基因定点突变SET内丝氨酸Ser-9为His-SET(S9A)和His-SET(S9E)，分别模拟SET的持续非磷酸化与磷酸化。然后分别转染野生型SET(His-SET WT)及SET突变体His-SET(S9A)和His-SET(S9E)于HEK293/tau细胞株，48h后，发现野生型SET及SET突变体His-SET(S9A)定位于核内，然而His-SET(S9E)，即模拟SET Ser-9持续磷酸化的SET突变体，大部分转位于胞浆，并在胞浆中滞留。利用核蛋白提取试剂盒分离提取胞浆胞核蛋白，发现核蛋白中SET突变体His-SET(S9E)的量明显减少，而在胞浆蛋白中明显增加；通过免疫共沉淀方法检测到模拟Ser-9磷酸化修饰的His-SET(S9E)与importin α，importin β的结合减少，引起SET核输入复合物形成障碍，导致SET入核困难而滞留于胞浆。作为SET磷酸化修饰的上游激酶酪蛋白激酶Ⅱ（Casein Kinase II, CKII）水平在AD脑内上调，为进一步探讨外源性刺激对内源性SET磷酸化修饰及其亚细胞分布的影响。我们在细胞水平上调CKⅡ表达水平，结果显示：CKⅡ可以显着磷酸化内源性SET，并且磷酸化修饰后SET在胞浆中大量聚集。因此，CKⅡ可能成为AD治疗的一个新的药物靶点。我们还观察到SET丝氨酸Ser-9位点磷酸化修饰后与PP2A催化亚基C结合更强，从而显着抑制PP2A活性，并导致tau蛋白在Ser396, Thr231, Ser262, Thr205, Ser214, Ser404, PHF-1和Ser199位点发生过度磷酸化。为明确以Ser-9为中心的此段结构域序列(6-10aa)AKVSKK可能为SET的核定位信号，我们通过基因定点突变SET此段结构域上的赖氨酸，发现仅His-SET(K11A)突变体在胞浆中出现滞留现象，免疫共沉淀的结果显示His-SET(K11A)突变体与importin α，importin β的结合减少，确定Lysine11对SET锚定核输入蛋白的贡献最大，是影响SET入核的功能氨基酸。固相合成并纯化肽段Tat-NLS (Tat-AAKVSKKE)，将肽段加入到HEK293/tau细胞中孵育48小时，激光共聚集荧光显微镜下观察到Tat-NLS可以竞争性抑制内源性SET与核输入蛋白importin结合，从而导致内源性SET入核障碍而滞留胞浆。上述结果提示6AKVSKK11是SET的核定位信号；位于SET核定位信号的Ser-9磷酸化修饰导致SET滞留胞浆，进而PP2A活性并引起下游AD样病理学变化。结论：1. AD患者脑内神经元SET Ser-9位点显着磷酸化是导致SET滞留胞浆的关键原因；2.6AKVSKK11序列是SET的核定位信号，其中赖氨酸Lysine11是SET核定位信号上的功能氨基酸。背景：黄连素，又称小檗碱(Berberine, BR)，是从中草药黄连等植物中提取分离得到的一类异喹啉类生物碱，属季铵类化合物。黄连素具有多种保健作用，并拥有各种生化和药理活性，包括抗腹泻，抗心律失常和抗肿瘤等活性。近年来，药效学研究发现小檗碱对治疗AD有潜在作用，包括对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型大鼠空间学习记忆障碍的改良；改变β-淀粉样蛋白前体（AβPP）加工处理过程和减少Aβ的分泌；通过降低海马神经元细胞内游离Ca2+从而减少Aβ诱导的细胞凋亡；以及具有抗胆碱酯酶活性。此外，黄连素还能在HCT-116细胞调节GSK-3β活性。根据以上报道，黄连素可能是一个治疗AD的潜在药物。由过度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白构成的皮层神经原纤维缠结NFTs数量与阿尔茨海默病的临床痴呆程度呈正相关，提示tau蛋白过度磷酸化促NFTs形成在AD发病中起关键作用。到目前为止，受累神经元内蛋白激酶/蛋白磷酸酶动态平衡失调是导致AD样tau蛋白异常过度磷酸化的直接原因。其中糖原合酶激酶-3(GSK-3）和蛋白磷酸酶(PP）-2A，分别是最有关联的激酶和磷酸酶。然而，到现在为止，一直没有研究报道黄连素是否影响tau蛋白磷酸化。为此，本研究探讨了在人胚肾转tau细胞（HEK293/tau）中小檗碱对花萼海绵诱癌素（Calyculin A, CA, PP2A和PP1的抑制剂）诱导tau过度磷酸化的影响及其相关酶活性的变化。方法：利用人类最长（tau441）基因稳定转染人胚肾HEK293细胞，即HEK293/tau细胞。在37C含95％的空气和5％CO2饱和湿度培养箱中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293/tau细胞。在6孔培养板中培养24小时后，无血清培养基稀释的2.5nMcalyculin A预处理细胞12小时，然后分别给予0，5，10，20，50，或100微克/毫升小檗碱处理细胞24小时。用CCK-8细胞计数试剂盒来测定细胞活力和小檗碱的最佳剂量。随后，通过显微镜成像，Hoechst33342染色，TUNEL法，流式细胞仪和caspase-3活性测定来观测黄连素对calyculin A诱导的形态学变化和HEK293/tau细胞凋亡的影响。利用免疫印迹来检测20微克/毫升小檗碱对calyculin A诱导的Ser198/199/202（Tau-1位点），Ser396，Ser404，Thr205和Thr231等位点tau蛋白过度磷酸化的影响，以及糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）Tyr216和Ser9的磷酸化程度。采用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性检测试剂盒（Promega公司，货号V2460）来测定PP2A活性。通过测定丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性来检测小檗碱对calyculin A诱导氧化应激的保护作用。结果：1)20μg/ml小檗碱作用人胚肾293/tau细胞24小时可显着减少2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的细胞死亡，而仅给予小檗碱处理对正常细胞无任何影响；2)20μg/ml小檗碱可显着减少2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的细胞形态改变及凋亡；3)20μg/ml小檗碱可显着降低2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的tau蛋白Ser198/199/202(Tau-1位点), Ser396, Ser404, Thr205,和Thr231位点过度磷酸化程度；4)20μg/ml小檗碱可显着逆转2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的PP-2A活性下降和GSK-3β活性增强，研究其作用机制发现GSK-3β在Tyr216位点磷酸化程度明显下降而Ser9位点磷酸化程度明显增强；5)20μg/ml小檗碱可通过降低丙二醛水平和增加超氧化物歧化酶活性从而保护2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的氧化应激。结论：小檗碱能减轻由花萼海绵诱癌素CA诱导的人胚肾293/tau细胞毒性作用；可能通过恢复蛋白磷酸酶PP2A活性和下调糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）活性降低tau蛋白过度磷酸化水平；并且小檗碱可通过降低丙二醛水平和增加超氧化物歧化酶活性从而保护2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的氧化应激。以上结果提示小檗碱可能是一种治疗阿尔茨海默病的潜在药物。
卢芹[10]2012年在《抗老年性痴呆药物先导化合物的发现及相关药理机制研究》文中研究指明老年性痴呆(又称阿尔茨海默病,Alzheimer's disease, AD)是一种神经退行性疾病,临床表现为记忆力减退和认知功能障碍。随着人口老龄化的加剧,AD患者也迅速增长,给家庭和社会带来了沉重的负担。研究表明,细胞外淀粉样肽(β-amyloid peptides, Aβ)异常分泌和聚集形成的淀粉样蛋白斑以及细胞内由于微管相关蛋白tau高度磷酸化形成的神经纤维缠结是造成AD的主要原因,也是AD的主要病理特征。但是,到目前为止还没有很好的治疗方法和特效药物。本论文的研究目的就是以抑制Aβ含量为研究策略,筛选和评价小分子抑制剂对于AD治疗的潜在价值。Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经β-分泌酶(beta-site APP-cleaving enzyme1, BACE1)和γ-分泌酶的连续水解产生的,在这一过程中,BACE1是Aβ产生的限速酶,因此BACE1是治疗AD的一个潜在的靶点。基于此,我们对实验室的化合物库进行了BACE1抑制剂的筛选,得到了BACE1的一个竞争性抑制剂L655,240,其抑制BACE1活性的IC5α为4.47+1.37μmol/L；利用表面等离子共振技术确证了该抑制剂与BACE1之间确实存在直接的相互作用,平衡解离常数(KD)为17.9+0.72μmol/L；在稳定表达APP瑞典突变的人胚胎肾细胞(HEK293-APPswe cells)中发现L655,240抑制BACE1活性,减少BACE1水解APP的直接产物——可溶性APPβ (the soluble APPβ, sAPPβ)的产生,以及Aβ40和Aβ42的产生,同时L655,240并不影响BACE1和APP的mRNA和蛋白水平,以及α-分泌酶和γ-分泌酶的活性,这些结果进一步确证了该化合物能通过显着降低BACE1活性而减少Aβ产生。因此L655,240作为BACE1的抑制剂,为抗AD药物先导化合物的发现提供了重要的结构信息,具有重要的意义。此外,我们在细胞水平筛选到一个能够降低Aβ含量的化合物ACT。在细胞水平研究发现ACT能够抑制BACE1的蛋白表达,从而降低Aβ的生成；另外我们还发现ACT能够通过激活AMPK (AMP激活的蛋白激酶)或抑制Akt(蛋白激酶B)而降低mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)活性,从而抑制自噬相关蛋白Ulk1磷酸化,激活自噬起到清除Ap作用。因此,我们发现了一个新的降低Aβ含量的化合物——ACT,并揭示了ACT减少Aβ含量的机制,同时我们的工作也进一步提示了激活白噬可以作为治疗AD的一个潜在策略。
参考文献：
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