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磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

2020-12-08阅读(340)

磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

论文摘要

磷脂酶D（EC 3.1.4.4）可以磷脂酰胆碱为底物转化合成磷脂化合物,在医药和食品领域具有良好的应用价值。磷脂酶D产生菌的传统获取方式为土壤筛选,但是野生菌来源的磷脂酶D因酶活水平偏低,发酵周期长而限制了其广泛应用。随着分子生物学和基因工程技术的快速发展,通过分子改造策略获得高表达量和高酶活的磷脂酶D迫在眉睫。本研究首先考察了磷脂酶D在不同宿主体系中的表达,筛选获得最优表达宿主,进而开展一系列基因工程改造以期提升磷脂酶D的表达水平并对磷脂酶D制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行探究。本论文的主要研究内容如下:（1）以实验室前期获得的具有良好磷脂酰基转化能力的磷脂酶D sspld序列为目的基因,分别构建了重组菌株Bacillus subtilis/pMA5-pld,Pichia pastoris/pPIC3.5K-pld和Corynebacterium glutamicum/pDXW-pld,实现了磷脂酶D在枯草芽孢杆菌,毕赤酵母和谷氨酸棒杆菌中的异源表达,重组菌酶活分别为8.4 U/mL,13.2 U/mL和15.0 U/mL。为此将谷氨酸棒杆菌作为后续改造的表达宿主。（2）为降低下游纯化成本和缓解胞内酶蛋白积累对宿主菌生长的影响,本研究利用信号肽在谷氨酸棒杆菌体系中构建了6种分泌型重组表达菌株,成功实现了磷脂酶D的分泌表达。其中,在WapA信号肽的作用下,磷脂酶D胞外酶活最高,为54.6 U/mL。核糖体结合位点决定蛋白质合成的速度,通过文献调研和位点分析发现,在信号肽编码基因前添加一段15 bp的核糖体结合位点序列AGAAGGAGATATACC,可将重组酶的酶活进一步提高至63.6 U/mL。启动子可通过与转录因子结合而控制基因活动,为继续提升该重组磷脂酶D的表达水平和应用潜力,本研究进行了启动子适配性改造,将原质粒上的启动子分别替换为其他12种启动子,其中p WapA启动子适配性改造重组菌的酶活水平最高,达到78.0 U/mL。SDS-PAGE分析结果表明重组菌实际分子量约为60 kDa,与理论值一致。（3）对重组磷脂酶D进行酶学性质研究,结果表明重组菌所产磷脂酶D的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7.5。5 mM的Ca2+、K+、Mg2+和Li+可促进酶活,采用50 mM的高离子浓度时,Ca2+仍然可促进酶活,而5 mM的Na+和Ag+对酶活具有一定抑制作用。化学试剂DTT、SDS和EDTA对酶活性均表现出抑制作用。（4）为考察该磷脂酶D对底物磷脂酰胆碱和丝氨酸的转化作用,本研究首先利用薄层色谱法对初始制备产物进行了定性分析。为获得磷脂酶D催化法制备磷脂酰丝氨酸的最适工艺,对转化条件中的有机溶剂种类、有机相与水相体积比、底物丝氨酸与磷脂酰胆碱的摩尔比、转化时间、转化温度和钙离子浓度这6个因素进行了系统优化,通过高效液相色谱检测,优化后的磷脂酰丝氨酸产量可达1.94 g/L,产率为48.6%。该重组磷脂酶D在生物催化合成磷脂酰丝氨酸方面具有良好的应用潜力。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 磷脂酶D概述
  •     1.1.1 磷脂酶D
  •     1.1.2 磷脂酶D的来源
  •     1.1.3 磷脂酶D的结构特征
  •     1.1.4 磷脂酶D的应用
  •   1.2 磷脂酶D的高效表达
  •     1.2.1 磷脂酶D的异源表达
  •     1.2.2 基因工程改造策略
  •   1.3 磷脂酰丝氨酸概述
  •     1.3.1 磷脂酰丝氨酸
  •     1.3.2 磷脂酰丝氨酸的结构和性质
  •     1.3.3 磷脂酰丝氨酸的功能
  •   1.4 磷脂酰丝氨酸的制备
  •     1.4.1 分离提取法
  •     1.4.2 酶转化法
  •   1.5 本课题立题意义与研究内容
  •     1.5.1 立题意义
  •     1.5.2 研究内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株和质粒
  •     2.1.2 培养基
  •     2.1.3 溶液配制方法与试剂
  •     2.1.4 实验主要仪器与与设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的表达
  •     2.2.2 磷脂酶D在毕赤酵母中的表达
  •     2.2.3 磷脂酶D在谷氨酸棒杆菌中的表达
  •     2.2.4 酶活检测和蛋白分析
  •     2.2.5 信号肽适配性改造
  •     2.2.6 核糖体结合位点的引入
  •     2.2.7 启动子适配性改造
  •     2.2.8 磷脂酶D粗酶液的酶学特性研究
  •     2.2.9 磷脂酶D合成磷脂酰丝氨酸的应用
  • 第三章 结果与讨论
  •   3.1 磷脂酶D的异源表达
  •     3.1.1 磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的表达
  •     3.1.2 磷脂酶D在毕赤酵母中的表达
  •     3.1.3 磷脂酶D在谷氨酸棒杆菌中的表达
  •   3.2 信号肽适配性改造
  •     3.2.1 信号肽适配性改造重组菌的构建
  •     3.2.2 重组菌发酵产酶研究
  •   3.3 核糖体结合位点的引入
  •     3.3.1 引入核糖体结合位点的重组菌构建
  •     3.3.2 重组菌发酵产酶研究
  •   3.4 启动子适配性改造
  •     3.4.1 启动子适配性改造重组菌的构建
  •     3.4.2 重组菌发酵产酶研究
  •   3.5 磷脂酶D的酶学特性研究
  •     3.5.1 最适反应温度和温度稳定性
  •     3.5.2 最适反应pH和pH稳定性
  •     3.5.3 金属离子和化学试剂对重组酶酶活的影响
  •   3.6 磷脂酶D制备磷脂酰丝氨酸的应用
  •     3.6.1 磷脂酰丝氨酸的分析
  •     3.6.2 磷脂酰丝氨酸制备工艺条件优化
  • 主要结论与展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 侯海娟

    导师: 龚劲松

    关键词: 磷脂酶,异源表达,分子改造,磷脂酰丝氨酸,生物合成

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 江南大学

    分类号: Q55;Q78

    总页数: 60

    文件大小: 2263K

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