辣椒bHLH基因家族的鉴定、表达分析及CabHLH94在应答青枯菌侵染中的作用

论文摘要

辣椒（Capsicum annuum L）是一种在世界范围内广泛种植的大田蔬菜,容易受青枯病等土传病害的危害而减产,培育和推广应用抗病品种是解决辣椒病害问题的最有效对策,而剖析辣椒抗病的分子机制有利于辣椒抗病遗传改良。对模式植物拟南芥和水稻的研究发现植物应答病害的防御反应在很大程度上受到转录水平的调节,包括bHLH在内的各类转录因子在其中起重要作用,但人们对于大多数转录因子家族成员在植物防御反应中作用的认识还仅限于部分成员。目前,关于bHLH转录因子在辣椒等茄科植物中的作用鲜少报道。本研究对辣椒全基因组中的bHLH转录因子进行鉴定、系统进化和表达模式分析,并对其中的CabHLH94在辣椒应答青枯菌侵染的防御反应中的作用进行了分析。主要结果如下:（1）在辣椒蛋白数据库中共鉴定到132个编码bHLH转录因子的基因,并对其染色体定位、系统进化、保守基序、基因结构和表达模式进行分析。结果表明:辣椒bHLH基因以不均匀的方式定位在12条染色体上,并有13个基因发生串联复制。系统进化将其分为23个亚族。同一亚族内含有相同的保守基序和基因结构。bHLH基因应答外源脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）转录表达的聚类热图分析表明,ABA和SA处理后部分基因表达升高,随机挑选8个表达较高的基因进一步通过实时荧光定量PCR验证。结果显示:在外源ABA和SA处理后,8个基因呈现出表达上调或下调趋势,表明这8个基因可能与ABA和SA介导的信号通路有关。（2）在上述8个基因中,CabHLH94在ABA和SA处理后有较高表达的,暗示该基因受到ABA和SA介导的信号通路的协同调节,可能在辣椒抗病及应答非生物逆境胁迫中起重要调节作用。为了验证这一假设,本研究从辣椒cDNA文库中克隆出CabHLH94基因cDNA的长度为744bp的开放阅读框,编码含有248个氨基酸残基的蛋白质。亚细胞定位发现CabHLH94分布在细胞核上。CabHLH94的启动子序列含有TCA-element、ERE、ABRE、CGTCA-motif、Box和G-box等元件,说明该基因可能与辣椒应答这些逆境相关。通过实时荧光定量PCR检测发现CabHLH94在接种青枯菌1 h后转录表达开始显著上调,6 h后达到最大值,此外还可被外源激素SA、ABA、MeJA、ETH和BR处理诱导上调。（3）通过农杆菌诱导的瞬时超表达实验分析CabHLH94在辣椒免疫应答中的作用。结果表明:瞬时超表达CabHLH94能激活辣椒叶片产生过敏性细胞坏死和H2O2的积累,与对照组相比表现为较深的Trypan blue和DAB染色,并能诱导CaPR1、CaACO、CaABR1、和CaDEF1抗性相关的标记基因的表达上调。（4）在辣椒植株中通过病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing）使CabHLH94沉默,分析其对辣椒接种青枯菌的影响。结果表明:CabHLH94的沉默辣椒植株在青枯菌接种后的抗病能力与对照相比显著降低,相应的,CaPR1、CaACO、CaABR1、和CaDEF1抗性相关的标记基因的表达显著下调。综上所述:通过对辣椒bHLH基因家族的鉴定、系统进化、表达模式分析方面的生物信息学进行分析,为bHLH基因家族的进化和候选基因的筛选与功能分析提供了参考。对辣椒CabHLH94基因功能的初步探究发现,该基因在辣椒应答青枯菌侵染过程中具有一定的作用,且在这个过程中起正调节作用。

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摘要

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前言

第一章文献综述

1.1 转录因子

1.2 bHLH转录因子的结构特点与分类

1.3 bHLH转录因子的研究进展

1.4 植物bHLH转录因子的生物学功能

1.4.1 bHLH转录因子在植物生长发育中的作用

1.4.2 bHLH转录因子在生物合成和信号转导中的作用

1.4.3 bHLH转录因子在非生物胁迫中的作用

1.4.4 bHLH转录因子在生物胁迫中的作用

1.5 研究意义

第二章辣椒bHLH基因家族的鉴定、表达分析

2.1 研究材料

2.1.1 植物材料与培养

2.1.2 引物

2.1.3 主要实验试剂和设备

2.2 研究方法

2.2.1 辣椒bHLH转录因子的鉴定与染色体定位

2.2.2 辣椒bHLH转录因子的系统进化树构建

2.2.3 辣椒bHLH转录因子保守基序和基因结构

2.2.4 聚类热图分析

2.2.5 外源激素处理

2.2.6 辣椒叶片总RNA提取和实时荧光定量PCR

2.3 结果与分析

2.3.1 辣椒bHLH转录因子的鉴定与染色体定位分析

2.3.2 辣椒bHLH转录因子系统进化树分析

2.3.3 辣椒bHLH转录因子保守基序和基因结构分析

2.3.4 辣椒bHLH基因在ABA和 SA处理后的表达模式分析

2.4 讨论

第三章 CabHLH94 在辣椒应答青枯菌侵染中的作用分析

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料及培养

3.1.2 菌株

3.1.3 载体

3.1.4 主要试剂和仪器

3.2 实验方法

3.2.1 载体构建

3.2.2 青枯菌接种

3.2.3 农杆菌的培养及侵染

3.2.4 亚细胞定位

3.2.5 Westernblot

3.2.6 瞬时超表达

3.2.7 DAB和 Trypanblue染色

3.2.8 电导率测定

3.2.9 外源激素处理

3.2.10 病毒诱导的基因沉默

3.2.11 实时荧光定量PCR

3.3 结果与分析

3.3.1 CabHLH94 基因全长cDNA的克隆与序列分析

3.3.2 青枯菌接种和外源激素处理下CabHLH94 的表达分析

3.3.3 CabHLH94 亚细胞定位

3.3.4 瞬时超表达CabHLH94 对辣椒免疫应答和抗性相关基因的表达调控作用

3.3.5 基因沉默CabHLH94 对辣椒抗青枯病的影响

3.4 讨论

参考文献

附录

致谢

硕士期间成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 薛宝平

导师: 王延峰,何水林

关键词: 辣椒,生物信息学,青枯菌

来源: 延安大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,植物保护,园艺

单位: 延安大学

分类号: Q943.2;S436.418.1

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辣椒bHLH基因家族的鉴定、表达分析及CabHLH94在应答青枯菌侵染中的作用

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