安佳佳王文（北京大学第一医院100034）
【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）15-0039-05
【摘要】考察非甾体抗炎药双氯芬酸钠和糖皮质激素类药物地塞米松对Alzheimer病中炎症反应、外周炎性细胞浸润的影响。采用Griess法测定了各刺激剂及药物对U251人源星形胶质瘤细胞生成NO的影响。分别用RT-PCR法和ELISA法测定了IL-1β对U251人源星形胶质瘤细胞表达和分泌IL-6的影响。结果表明LPS（10ng/ml至10μg/ml）可呈剂量依赖性地刺激细胞释放NO，100μg/ml的Aβ25-35可明显刺激刺激NO的释放；非甾体抗炎药双氯酚酸钠和糖皮质激素类药物地塞米松可呈剂量依赖性地抑制1μg/mlLPS刺激的NO释放，IC50分别为1×10-5mol/L和3.62×10-10mol/L。而IL-1β（5ng/ml至125ng/ml）可呈剂量依赖性地刺激U251胶质瘤细胞分泌IL-6，也可明显诱导IL-6mRNA的表达。糖皮质激素类药物可呈剂量依赖性地抑制IL-6的分泌及mRNA表达。1×10-5mol/L的双氯酚酸钠也可抑制IL-6的分泌及mRNA表达。综上表明双氯芬酸钠及地塞米松均可抑制Alzheimer病中炎症反应、外周炎性细胞浸润。
【关键词】Alzheimer（AD）双氯芬酸钠（DS）地塞米松(DEX)一氧化氮IL-1β
随着世界人口老年化程度的不断升高，Alzheimer’s病（AD）的发病率也不断上升，现已成为老年人常见病之一。AD以神经元丢失、老年斑（senileplaque，SP）和神经原纤维缠结（neurofibrillarytangle，NFT）等为主要病理特征，在临床上主要表现为进行性智能减退及认知障碍，最终发展成为痴呆。虽然AD早在20世纪50年代即被发现，但到目前为止尚无根治AD的药物或治疗方案，所有的药物只能部分地控制症状或延缓其进展。
目前，人们对于AD的发病和进展还未完全清楚，仍存在不少争议。对于AD的治疗，虽然已有不少药物已上市，但仅能部分改善症状，并不能延缓AD的进展。与AIDS的治疗相似，将包括抑制Aβ生成、抗氧化、抗炎、增强胆碱能神经元功能在内的各种治疗方法结合起来的鸡尾酒疗法在近期内是有效治疗AD的方法。基于炎症在AD中的重要作用，本文意于从细胞水平上观察非甾体类抗炎药与糖皮质激素类药物对AD的淀粉样蛋白等病理性物质所引发炎症、外周炎性细胞浸润的作用。
材料与方法
细胞株：U251星形胶质瘤细胞，由中国医学科学院细胞中心提供。
受试药物：
双氯芬酸钠由济南东风制药厂提供；地塞米松苏州第六制药厂提供
配制方法：DMSO溶解成10-1mol/L储备浓度，用缓冲液稀释至10-3mol/L待用，终浓度为10-5mol/L。
试剂：脂多糖（LPS）购自Sigma公司。rhIL-1β购自CytoLab/PreproTechAsia。IL-6ELISA测定试剂盒购自R&D公司。β-Actin引物购自鼎国生物技术公司。IL-6引物购自北京赛百盛基因公司DMEM高糖培养基购自GIBCO。Trizol试剂购自GIBCO。随机引物、M-MLV逆转录酶、Taq酶预混液（GotaqGreenMasterMix）购自Progema。琼脂糖、溴化乙锭(EB)、多聚-D-赖氨酸、焦磷酸二乙酯（DEPC）、乙二胺四乙酸（EDTA）、谷氨酰胺（glutamine）、胰蛋白酶（trypsin）、台盼蓝（trypanblue）均购自Sigma公司。
U251星形胶质瘤细胞株的培养
U251用含10%FCS、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基，于37°C、5%CO2的培养箱中培养，每2-3天换液一次，长至融合时分瓶传代。
细胞一氧化氮（NO）释放量的测定
NO2-标准曲线的绘制：精密称取分析纯亚硝酸钠（NaNO2），以PBS缓冲液用容量瓶配成1mmol/L的标准溶液，然后用DMEM高糖培养基逐级稀释至125μmol/L、62.5μmol/L、31.25μmol/L、15.625μmol/L、7.813μmol/L，以不含NaNO2的DMEM高糖培养基为空白，各浓度的NaNO2溶液各取100ul和等量的Griess试剂混合,于室温下静置10分钟,550nm处测定其OD值，以OD对NO2-浓度作曲线。
细胞悬于含10%FCS、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中，以2×105/ml的密度种入96孔培养板中，于37°C、5%CO2的培养箱中培养。12小时后，换成不含血清的培养基，加入刺激剂，或在加入刺激剂前2小时预先加入相应的药物，24小时后收集细胞培养上清。96孔板中每孔加100ul上清和等量的Griess试剂混合,于室温下静置10分钟,550nm处测定其OD值,根据NO2-的标准曲线计算NO2-含量。
胶质细胞分泌IL-6的测定
U251细胞悬于含10%FCS、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中，以2×105/ml的密度种入48孔板中，于37°C、5%CO2的培养箱中培养。12小时后，培养基换成不含血清的培养基，加入刺激剂，或加入刺激剂前2小时加入相应的药物，24小时后收集细胞培养上清。上清2000RCF离心5分钟后按IL-6的ELISA试剂盒说明书绘制标准曲线和测定培养上清中的IL-6含量。
胶质细胞IL-6mRNA表达水平测定
U251细胞悬于含10%FCS、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中，以1×106/ml的密度种入60mm培养皿中，于37°C、5%CO2的培养箱中培养。12小时后，培养基换成不含血清的培养基，加入刺激剂，或加入刺激剂前2小时加入相应的药物，刺激12小时。
12小时后，小心吸去细胞上清。每皿加入1mlTrizol试剂，小心吹打，使细胞完全从培养皿脱落下来，将之转入1.5ml的Eppendorf管中。加入200μl氯仿，振荡20s，室温静置3分钟。4°C，12000×g离心15分钟。将水相移入另一无RNase的离心管中，加入4°C预冷的异丙醇500μl，振荡20s，-20°C静置1h。4°C,12000×g离心10分钟。倾去上清，沉淀用75%乙醇1ml洗涤二次，沉淀在超净台中吹干。加入25l无RNase的水溶解。测定260nm和280nm光密度，计算RNA的量，-20°C保存待用。
取2?g总RNA，加入RandomPrimer(50ng/μl)1μl，dNTPs(10mmol/L)2μl，无RNase的水至13μl。65°C加热5分钟，4°C静置5分钟将随机引物与总RNA退火。加入5×buffer4μl，DTT(0.1mol/L)2μl，MMLV1μl，于PCR仪中25°C10分钟，37°C60分钟合成cDNA第一链，70°C15分钟灭活M-MLV，然后4°C保持。在提取RNA及逆转录过程中所用器皿均用含0.1%DEPC的去离子水浸泡24小时，然后高压灭菌、70°C烘干。
取2μlcDNA进行PCR反应扩增cDNA。反应体系为RT产物2μl，10?buffer2.5μl，dNTPs(10mmol/L)2μl，AntisensePrimer(25?mol/L)0.5μl，SensePrimer(25?mol/L)0.5μl，Taq酶0.5μl，H2O补足体积至25μl。扩增条件为94°C5分钟，（94°C45s，Tm45s，72°C1分钟）28次循环，72°C8分钟，4°C保持。Tm表示反应退火温度。所用引物的模板，目标产物长度，Tm值和序列见下表。
引物的碱基序列如下：
β-Actinsense:5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’
β-Actinantisense:5’-CTTCCTTAATGTCACCCACGATTTC-3’
hIL-6sense:5’-GTCCAGTTGCCTTCTCCC-3’
hIL-6antisense:5’-CCTCTTTGCTGCTTTCACA-3’
将PCR产物10μl点样于含有0.1?g/mlEB的2%琼脂糖胶上，80V电泳40分钟，用紫外凝胶成相系统照相，并用KodakEDAS120进行灰度扫描。
数据统计与分析
数据用SPSS进行单因素方差分析（one-wayANOVA），每两组间进行SNK检验，各组与对照组间进行Dunnett检验。
实验结果
1、刺激剂对胶质细胞释放NO的作用
LPS可呈剂量依赖性地刺激U251细胞释放NO，结果如图Fig.1-1所示。观察药物对胶质细胞释放NO的影响时以1μg//ml的LPS为刺激剂。
Fig.1-1NOreleasedfromU251cellsstimulatedbyvariousconcentrationsofLPS.ConcentrationofNOinculturesupernatantwasshowed.1.Blank,2.LPS10ng/ml,3.LPS100ng/ml,4.LPS1μg/ml,5.LPS10μg/ml,,n=4.*:p<0.01,vsblank.
2、化合物对LPS刺激细胞释放NO的作用
双氯酚酸钠和地塞米松可呈剂量依赖性地抑制由1μg/mlLPS引发的U251胶质瘤细胞释放NO，IC50分别为7.62×10-10mol/L和7.55×10-10mol/L（tab.1-1、tab.1-2），两者之间无明显差别。
Tab.1-1InhibitoryeffectsofDSonNOreleasedfromU251cellsstimulatedby1μg/mlLPS.
Tab.1-2InhibitoryeffectsofDEXonNOreleasedfromU251cellsstimulatedby1μg/mlLPS
3、IL-1β对U251胶质瘤细胞分泌IL-6的影响
IL-1β可呈剂量依赖性地刺激U251胶质瘤细胞分泌IL-6（Fig.1-2）。观察化合物对IL-1β刺激U251胶质瘤细胞分泌IL-6的影响时，以50ng/ml的IL-1β为刺激剂。
Fig.1-5SecretionofIL-6inculturesupernatantstimulatedbyIL-1β.ConcentrationofIL-6inculturesupernatantwasshowed.1.Blank,2.IL-1β5ng/ml,3.IL-1β25ng/ml,4.IL-1β125ng/ml.,n=4.a:p<0.01(vsblank).
4、化合物对IL-1β刺激U251胶质瘤细胞分泌IL-6的影响
50ng/ml的IL-1β可显著刺激U251胶质瘤细胞分泌IL-6，双氯芬酸钠可强烈抑制50ng/mlIL-1β刺激的U251胶质瘤细胞分泌IL-6（1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L的抑制率分别为72.67%、62.52%、38.62%），1×10-5mol/L地塞米松也可抑制IL-6的分泌（抑制率为63.66%），两者的抑制效果无明显差异(p=0.595)。
Fig.1-6EffectsofcompoundsonIL-6secretedfromU251stimulatedbyIL-1β50ng/ml.ConcentrationofIL-6inculturesupernatantwasshowed.1.Blank,2.Control,3.DEX1×10-5mol/L,4.DS1×10-5mol/L5.DS1×10-6mol/L,6.DS1×10-7mol/L,n=4.a:p<0.05(vscontrol),b:p<0.01(vscontrol),#:p<0.01(vsBlank).
5、化合物对IL-1β诱导胶质细胞IL-6mRNA表达的影响
50ng/ml的IL-1β可诱导U251胶质瘤细胞的IL-6mRNA表达。双氯酚酸钠和地塞米松均可明显抑制IL-1β诱导的U251胶质瘤细胞的IL-6mRNA表达。结果如Fig.1-7及Tab.1-3所示。
Fig.1-7EffectsofcompoundsonIL-6mRNAexpressionofU251cellsafterstimulatedbyIL-1βatconcentrationof50ng/ml.Lane1-7isBlank,Control,DEX1×10-5mol/L,DEX1×10-6mol/L,DS1×10-5mol/L,DS1×10-6mol/L,DS1×10-7mol/Lrespectively.
Tab.1-3EffectsofcompoundsonIL-6mRNAexpressionofU251cellsmeasuredbyRT-PCR.
a:mRNALevelswerenormalizedtoβ-Actinandquantifiedbydensitometricscanning.
讨论
AD是一种渐进式的神经退行性疾病，以神经元丢失、老年斑（SP）和神经原纤维缠结（NFT）为主要病理特征。近年来许多证据显示，在疾病的发生、进展过程中免疫炎症反应起着至关重要的作用[1-4]。在发病早期，脑内的淀粉样蛋白前体物质代谢及各种信号转导途径发生紊乱，造成淀粉样蛋白老年斑沉积的形成、Tau蛋白的异常磷酸化及神经原纤维缠结的生成。这些病理性物质使小胶质细胞活化，小胶质细胞活化后生成各种炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α等，这些细胞因子又使星形胶质细胞活化[5-7]。小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的固有免疫炎症反应细胞，它们活化后引发强烈的炎症反应，造成严重的神经元损伤。
AD病理性物质所引发的炎症反应中，各种途径产生的自由基是造成神经元损伤、死亡的重要原因。而所产生的各类自由基中又以NO最为普遍而重要。NO及其代谢产物过氧化亚硝酸根离子使膜蛋白和膜脂质氧化，造成广泛的损伤，而且使线粒体的呼吸功能受损，产生更多的自由基[8]，形成恶性循环。另外包括过氧化亚硝酸根离子在内的活性氧可以阻止谷氨酸进入星形胶质细胞，造成星形胶质细胞摄取谷氨酸障碍，导致兴奋性氨基酸堆积，加重了兴奋性神经损伤。
NO由一氧化氮合酶（NOS）催化合成。NOS有三类，在脑内主要是nNOS和iNOS。nNOS为组成性表达，产生参与维持正常神经生理活动的NO。在病理条件下，iNOS诱导表达，产生过量的NO，造成神经损伤。经研究发现，iNOS主要表达于星形胶质细胞，因而本文选择星形胶质细胞及其胶质瘤细胞系来观察化合物对NO生成的作用。炎症介质诱导iNOS表达可能有不同的途径，但最终还是激活NF-κB从而诱导iNOS的表达。LPS可通过MAPK等信号转导途径激活NF-κB而诱导iNOS的表达[9,10]。故在观察化合物的作用时仅以LPS作为刺激剂。实验中也观察到非甾体抗炎药双氯酚酸钠可以抑制NO的生成，这可能是NSAID防治AD的分子机制之一。
脑内病变部位、脑脊液及外周血液的炎性细胞因子水平升高是AD的重要特征，IL-6是其中重要的细胞因子之一。在脑内，海马、新皮质及小脑是IL-6及其受体的高表达区域，神经元细胞和胶质细胞均表达IL-6及其受体。小胶质细胞活化后产生的IL-1β和TNF-α是IL-6的强诱导剂，淀粉样蛋白片段也可强烈刺激IL-6的生成[11]。
IL-6是具有双重作用的细胞因子。正常情况下，IL-6具有促进神经元存活、保护神经免受损伤、诱导神经分化、调节神经递质物生物合成、调节下丘脑-垂体-肾上腺轴体温枢纽及疼痛等作用。IL-6升高使LTP受到抑制[12]，造成认知能力下降[13]。IL-6可通过激活MAPK途径使Tau蛋白发生AD样磷酸化[14]，可促进神经纤维缠结的形成。而且，IL-6可增强NMDA的神经毒性[15]。AD时IL-6表达水平升高[16]，其水平与AD的严重程度呈正相关[17]。而且IL-6mRNA表水平升高在淀粉样蛋白沉积可检测出来之前即已发生，提示IL-6mRNA的诱导是Aβ所诱导级联免疫反应的早期事件，可能参与淀粉样变性[18]。最近研究显示，胆碱脂酶抑制剂可使AD患者的IL-6等炎性细胞因子水平下降，使脑内的炎症反应网络发生重构，抑制了炎症反应[19]。而且FDA目前批准、唯一用于治疗中、重度AD的药物美金刚是NMDA受体拮抗剂，其治疗AD的作用机制是拮抗NMDA的毒性作用[20]。因而抑制IL-6过度产生对于AD的预防和治疗有着重要的意义。
如上所述，IL-1β可强烈刺激IL-6的生成，它通过激活NF-κB而激发IL-6的转录和表达。本文的结果表明IL-1β可强烈刺激U251星形胶质瘤细胞表达IL-6mRNA并分泌入细胞培养上清中，非甾体抗炎药双氯芬酸钠和糖皮质激素类药物地塞米松可以抑制IL-6的表达和分泌，这将非常有助于AD的预防和治疗。
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