王雪飞[1]2016年在《中药复方体外抗TGEV诱导猪小肠黏膜上皮细胞凋亡的机制研究》文中进行了进一步梳理猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。该病虽有疫苗预防,但免疫失败时有发生,而西药应用又存在着药物残留等一系列影响人体健康的食品安全问题。开发安全、有效、绿色、环保的新型中兽药成为当务之急。故此,本研究以中药复方为试验材料,以猪小肠黏膜上皮细胞(SIEC)为研究对象,应用流式细胞术、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR及荧光显微镜等手段和方法,通过对细胞周期、相关细胞信号通路途径、猪氨基肽酶N及抗病毒因子的检测,探讨中药复方干预TGEV诱导SIEC凋亡的作用机制,为临床应用中兽药防控畜禽传染病奠定基础。试验结果显示：1、通过显微镜观察结合MTT法,筛定出中药复方对SIEC的最大安全浓度：复方参术汤为6.25mg/mL,复方连翁汤为1.5625mg/mL,复方参附汤为3.125mg/mL。2、通过MTT法,检测中药复方干预TGEV诱导SIEC与PK-15细胞的活性的影响,结果显示叁种中药复方均能体外抑制TGEV对SIEC与PK-15细胞的吸附作用。3、通过流式细胞术,检测中药复方干预TGEV诱导SIEC细胞周期的影响,结果显示中药复方可以改变由TGEV引起的细胞周期在G2/M期发生的阻滞；qRT-PCR检测参与细胞周期调控的蛋白,结果显示中药复方能够显着上调周期蛋白cyclinA与cyclinB1的转录量(P<0.05)；荧光显微镜观察经过中药复方处理后感染TGEV的SIEC,结果显示细胞形态比较清晰、完整,呈规则的长梭形,大部分细胞的细胞核结构较清晰,染色质着色较均一,凋亡现象不明显。4、通过Western blot检测,结果显示中药复方可下调TGEV感染SIEC后Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、Cyt c及Bid蛋白表达；qRT-PCR和Western blot检测,结果显示中药复方可以极显着上调Fas和Bcl-2 mRNA的转录(P<0.01)及其蛋白的表达,极显着下调Fasl和Bax mRNA的转录(P<0.01)及其蛋白表达；SIEC经Caspase抑制剂处理后与TGEV组相比,可下调Caspase-8、Caspase-9、 Caspase-3蛋白的表达。5、通过qRT-PCR检测,结果显示中药复方可下调TGEV的受体pAPN mRNA表达水平和正向调控GRP78 mRNA表达水平。6、通过qRT-PCR检测,结果显示中药复方TNF-a mRNA转录量高于对照组；中药复方IFN-p mRNA转录量高于TGEV组；中药复方TLR3 mRNA转录量在24h、48h、72h时均极显着低于对照组(P<0.01),而高于TGEV组但差异不显着。中药复方NF-kB mRNA转录量在各时间段均显着高于对照组(P<0.05)。结论：1、中药复方在适宜浓度范围内(复方参术汤为6.25 mg/mL,复方连翁汤为1.5625mg/mL,复方参附汤为3.125mg/mL),对SIEC既安全又无毒副作用,且能有效抑制TGEV对SIEC的吸附,明显改善由TGEV感染SIEC产生的CPE现象,从而起到保护细胞的作用。2、中药复方能够正向调控SIEC关键的凋亡因子(Fas/Fas1、Bcl-2/Bax、Cyt-c、Bid)、周期蛋白(cycliA、cyclinB1)及TGEV受体(pAPN)基因或蛋白的表达水平,从而抑制Caspase的活性、改善细胞周期活动、阻断TGEV的吸附和在细胞内的复制,达到抑制TGEV诱导SIEC凋亡的目的。3、中药复方可以通过提高相关抗病毒因子(IFN-β、TNF-α、 TLR3、NF-kB)的转录量,抑制病毒基因组复制或干扰其蛋白合成等方式发挥抑制TGEV增殖的作用。整体研究最终表明,中药复方具有预防TGEV感染SIEC的作用。
王大会[2]2016年在《猪源益生菌对宿主肠道病毒的抗病毒作用研究》文中提出益生菌的应用已持续数十年,虽然其益生作用机理尚不清楚,但在临床上对消化道疾病的显着疗效已经得到充分的证实,对机体免疫功能的保护和增强作用愈加受到关注。一般认为益生菌在临床治疗肠道感染性腹泻的分子和细胞机制主要涉及叁个方面:(1)益生菌可产生抗菌物质并竞争性与病原性微生物黏附于肠上皮细胞来阻止病原体在肠道的黏附和定植;(2)益生菌可提高病毒感染时肠上皮细胞的存活率和保护肠道的正常生理结构并刺激保护性免疫反应来调节机体免疫;(3)益生菌可通过调节肠道微生态平衡来保护和抵御病原微生物的侵袭。本研究主要从分子水平、细胞水平以及动物体内试验叁个方面阐述猪肠道益生乳酸菌对传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抑制作用和免疫调节作用,获得了以下结果:(1)分离筛选出在猪睾丸细胞(ST细胞)上对TGEV具有抑制作用的3株猪源肠道益生菌Y091231、Y091221和Y224031,经16S rDNA鉴定分别为唾液乳杆菌(Lactobacillus saliarius),约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。(2)筛选菌对感染TGEV的ST细胞具有保护作用。3株益生菌及其代谢产物接入顺序不同,对病毒的抑制率也不同,Y091231菌悬液在预先接入的情况下可以达到最大抑制率(65%),而Y091221和Y224031则在与病毒共同接入时表现出较高的抑制率。通过半定量RT-PCR检测结果可知,3株益生菌及其代谢产物均可以降低TGEV在ST细胞内的增殖,Y091231菌悬液在各处理组中具有稳定的较高的病毒抑制力。益生菌在体外抗TGEV作用中,可以通过上调IL-8和IL-12、下调IL-4和INF-α这4种细胞因子在细胞培养上清中的表达量,从而刺激细胞免疫,起到抵御病毒入侵的作用。(3)分离鉴定PEDV-WN株,构建动物模型。从临床病料中分离得到PEDV,然后对毒株进行RT-PCR鉴定及M、S基因序列分析,与CV777株对比分析,PEDV-WN株的M基因具有高度保守性,可以作为检测PEDV的靶基因;S基因变异较大,S蛋白内分的核心和表位(CEO,499-638aa)共有9个氨基酸位点发生了突变。将PEDV-WN株回归试验动物,成功构建了典型PEDV感染动物模型。(4)唾液乳杆菌(Lactobacillus saliarius)对PEDV-WN株具有抑制作用,对病毒感染的仔猪具有保护作用。该菌株的预防性干预和治疗性干预均能提高仔猪存活率,提高仔猪生长性能,减轻病毒对肠道组织的病理损伤,并能降低病毒在机体内的增殖。益生菌可以调节机体IL-4、IL-8、IL-12、INF-α4种细胞因子和MHCⅡ的表达量,从而刺激机体的细胞免疫和体液免疫,起到抗病毒的作用。(5)PEDV感染严重破坏了正常的肠道菌群结构和菌种丰度,唾液乳杆菌的干预可以保护肠道微生态保持健康的平衡状态,并能迅速修复失调的肠道微生态。通过对粪便菌群的16S rDNA高通量测序的方法,对PEDV感染和益生菌干预的不同试验组的肠道菌群的变化规律和差异性进行了对比分析。
朱蕴暖[3]2017年在《猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析》文中研究表明猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)是猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)的病原体。TGE是猪的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪具有高度致死率(通常为100%)为特征。该病于1946年在美国首次报道,目前已呈世界性分布。TGE常在每年的冬季和早春季节呈暴发性流行,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究以检测为TGEV阳性的猪小肠内容物为材料进行病毒分离;在添加0.3%胰酶的条件下分离到1株能在PK15细胞上稳定增殖并能产生明显的细胞病变(CPE)的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV-AHHF毒株)。为了确定新分离的TGEV-AHHF毒株对仔猪的致病性,用第五代分离毒(TCID50为10-4.12/0.1m L)对仔猪进行攻毒实验,本研究选取了TGEV、PEDV、PORV和SDCV抗原阴性,且TGEV抗体阴性的健康3日龄仔猪12头,随机分成2组,命名为攻毒组(T组)和阴性对照组(N组),每组6头。攻毒组每头口服1×106.12TCID50病毒液。阴性对照组口服10 m L DMEM,攻毒后每3 h观察记录临床症状。结果显示,攻毒后48 h,攻毒组出现呕吐、腹泻症状;阴性对照组未出现任何临床症状。病理剖检,攻毒组小肠壁变薄、变透明,肠内充满黄色液体,阴性对照组没有明显病理变化。病理切片结果显示,攻毒组仔猪的肠道粘膜上皮细胞发生变性、坏死和溶解,十二指肠和空肠的肠绒毛显着萎缩,阴性对照组没有明显病理变化。荧光定量PCR检测各组织脏器中的病毒含量结果显示,攻毒组的空肠中的TGEV含量最高,其次是回肠、盲肠、结肠、直肠、胃和十二指肠,其他组织和阴性对照组均未检测到TGEV。结果证实分离的TGEV-AHHF毒株能够引起仔猪典型的TGE临床症状、病理和组织学变化,具有致病性。通过RT-PCR,5′RACE和3′RACE扩增方法,获得了该毒株的全基因序列,序列全长为28614 nt,包括5′非编码区(nt 1-314),ORF1ab基因(nt 315-20368),S基因(nt 20365-24711),3a基因(nt 24830-25045),3b基因(nt 25139-25873),E基因(nt 25860-26108),M基因(nt26119-26907),N基因(nt 26920-28068),ORF7基因(nt 28074-28310)和3′非编码区(nt28311-28614),全基因组序列分析显示,TGEV-AHHF毒株核苷酸序列与猪传染性胃肠炎病毒WH-1和SHXB毒株同源性最高(99.6%);进化树分析表明,由全基因构建的进化树显示TGEV-AHHF毒株与purdue群亲缘关系较近,而与Miller群亲缘关系较远;重组性分析显示,TGEV-AHHF毒株基因组中存在两个潜在的重组区域,分别在ORF1a和S基因中,可能是purdue群与Miller群毒株之间重组的结果。本研究对TGEV现地流行毒株进行分离鉴定、致病性及基因组结构特性分析,不仅对于TGEV的遗传进化、致病机理等基础性研究提供重要的理论基础,也在疾病的诊断、生物制品研制和防治工作方面具有重要意义。
郭锦玥[4]2016年在《猪FcRn介导IgG转运及TGEV感染激活NF-κB信号通路调控FcRn表达的研究》文中研究表明大约95%以上病原微生物都是通过黏膜途径入侵机体的,因此黏膜免疫日益受到人们的重视。一般认为黏膜免疫主要是通过多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)介导IgA转运到黏膜表面发挥作用。研究发现,在黏膜分泌物中也存在一定量的IgG,并在黏膜表面保护机体防止病原入侵的过程中起到重要作用。而IgG转运到黏膜表面主要是通过新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)介导的。目前大量的研究主要集中在对人和小鼠的FcRn功能及表达调控方面的研究,但是对于猪源的FcRn功能的研究比较少,同时国内外尚未见到有关病原感染对FcRn表达调控方面的研究。因此,本研究拟应用猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)构建体外胞转模型,研究猪FcRn介导IgG的转运功能;同时研究猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染IPEC-J2细胞激活NF-κB信号通路对FcRn的表达调控。取得的主要研究结果如下:1.猪小肠上皮细胞FcRn的表达及分布根据已经报道的猪FcRnα链基因序列设计特异性引物,以IPEC-J2细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增获得了FcRnα链基因片段。经Western blot检测发现FcRn蛋白在IPEC-J2细胞系上的表达。进一步通过间接免疫荧光检测发现FcRn主要分布在极化的IPEC-J2细胞的顶膜侧;仔猪空肠组织切片检测结果也显示FcRn主要分布在小肠绒毛上皮细胞的顶膜侧。2.猪FcRn介导IgG双向胞转作用的研究以IPEC-J2细胞构建体外胞转模型,将生物素标记的猪IgG(biotin-IgG)加入到胞转模型,进行Western blot检测。结果发现极化的IPEC-J2细胞在37°C可以双向转运IgG,在4°C不能转运IgG。以上结果证明IgG是跨细胞途径转运穿过上皮细胞屏障。为了进一步研究IgG跨极化上皮细胞双向转运是由FcRn特异性介导的,在biotin-IgG胞转过程中加入protein A或未标记的IgG作为抑制剂。结果显示在加入protein A或未标记的IgG后,明显抑制了IgG双向转运。激光共聚焦显微镜结果也证明了FcRn可以与IgG在细胞内结合并介导Ig G跨上皮细胞转运。运用免疫共沉淀的方法证明了FcRn与IgG结合是pH依赖的,即在酸性条件下pH<6.5,FcRn与IgG结合,在中性偏碱性条件下pH>7.0,FcRn与IgG不结合。由于FcRn可以介导IgG的转运,因此,在胞转模型中,以TGEV为模式病原,将抗TGEV特异性IgG加入到细胞底侧小室,在极化的IPEC-J2细胞顶侧小室加入0.1 MOI TGEV病毒液。结果发现FcRn转运特异性IgG能够中和病毒。以上结果说明Fc Rn介导IgG转运穿过黏膜屏障,在保护机体防止病原通过黏膜表面入侵的过程中起到重要作用。3.TGEV感染IPEC-J2细胞激活NF-κB信号通路对FcRn表达调控的研究NF-κB是一个广泛表达的转录因子,主要涉及与免疫应答、炎症反应、细胞分化相关的基因转录。本研究发现TGEV感染IPEC-J2细胞能够激活NF-κB信号通路。首先,运用NF-κB荧光素酶报告系统检测TGEV感染IPEC-J2细胞对NF-κB的激活情况,结果发现能显着增强NF-κB荧光素酶活性。进一步通过pEGFP-p65质粒转染IPEC-J2细胞,在TGEV感染后,激光共聚焦显微镜结果显示p65转位入核。TGEV感染IPEC-J2细胞,通过荧光定量PCR和Western blot方法检测发现能显着上调FcRn的表达。经在线软件分析FcRn启动子转录因子结合位点,发现除了具有NF-κB转录因子结合位点还有MAPK下游的转录因子结合位点,因此为了确定NF-κB和MAPK在FcRn上调表达中的作用,应用NF-κB抑制剂和MAPK相关抑制剂处理细胞,结果发现NF-κB抑制剂处理的细胞能显着抑制TGEV诱导的FcRn表达,而MAPK抑制剂处理的细胞不影响TGEV诱导的FcRn表达。说明FcRn的上调表达与NF-κB信号通路密切相关。进一步根据在线软件预测转录因子结合位点将FcRn启动子区域不断截短,最终构建了9个不同长度的FcRn启动子荧光素酶报告质粒,经荧光素酶活性检测发现FcRn启动子区NF-κB主要结合位点位于上游的-1381~-208之间。最后应用染色质免疫共沉淀(CHIP)和凝胶迁移实验(EMSA)证明这个区域具有4个p65转录因子结合位点。
许丹[5]2016年在《MGAT2/DGAT1与LPGAT1/ALCAT1在TAG合成、线粒体损伤和病毒复制中作用及机制研究》文中研究指明酰基转移酶在细胞的生命活动中扮演着重要的角色。首先,它能够调控细胞能量的贮存、传递和释放;其次,它能够调控磷脂的结构从而维持细胞膜和细胞器的结构与功能的完整性;再次,它的底物还可以作为第二信使,调控细胞的生理功能,并参与各种疾病的病理过程。其中,单酰基甘油单酯转移酶-2(Monoacyglycerol Acyltransferases-2,MGAT2)和二酰基甘油二酯转移酶-1(Diacylglycerol Acyltransferases-1,DGAT1)是调控甘油叁脂(Triacylglycerols,TAG)合成的关键酶;心磷脂酰基转移酶-1(Lysocardiolipin Acyltransferase-1,ALCAT1)和溶血酰磷脂酰基转移酶-1(Lysophosphatidylglycerol Acyltransferase-1,LPGAT1)是调控磷脂代谢和线粒体功能的关键酶。目前,MGAT2和DGAT1的相互作用位点以及这种相互作用在催化甘油叁酯(Triacylglycerols,TAG)合成过程中的作用与机制,ALCAT1和LPGAT1表达变化对线粒体的形态与功能的影响以及其对氧化应激引起线粒体损伤的调控作用,MGAT2/DGAT1与LPGAT1/ALCAT1在病毒复制中的作用,还有待进一步的深入研究。本文分别通过过表达和下调的方式,研究MGAT2/DGAT1、LPGAT1/ALCAT1这两组酶在TAG合成、线粒体损伤和病毒复制中的作用和机制。研究取得以下结果。1.MGAT2和DGAT1是TAG在小肠合成中的关键酶,为了研究这两者的相互作用及对TAG合成的影响,将这两个酶在细胞中过表达。Tris-甘氨酸-PAGE电泳显示,MGAT2自身能够形成二聚体和四聚体,也可以与DGAT1形成特异性的二聚体,但并不与DGAT2形成二聚体。通过构建片段序列删除的MGAT2和DGAT2质粒,并进行分析表明,MGAT2的信号肽序列虽然与二聚体的形成无关,但是对酶的活性至关重要,而DGAT1序列中的第35~80个氨基酸是形成自聚体并且与MGAT2形成相互作用的位点。异源性的MGAT2与DGAT1复合酶二聚体有助于加速和促进细胞内TAG的合成。2.构建了能够稳定表达LPGAT1、ALCAT1的H9C2细胞系。首先在线粒体形态上,激光共聚焦实验显示LPGAT1能够显着降低由ALCAT1过表达所引起的线粒体点状断裂,使其向棍棒状与点状的混合态转变。在H2O2刺激的氧化应激条件下,LPGAT1能够缓解ALCAT1上调所引起的H2O2泄露、mtDNA丢失、细胞内脂质过氧化、以及细胞内氧化应激基因的升高。线粒体呼吸功能检测结果显示,LPGAT1单独高表达组的线粒体的耗氧率最高,LPGAT1可以缓解由ALCAT1单独高表达引起的线粒体呼吸功能障碍,LPGAT1同时也可以缓解由ALCAT1引起的自噬小体的增加。上述结果说明,在氧化应激条件下,LPGAT1和ALCAT1可以通过相互间的作用进而调控细胞线粒体的结构与功能,进而影响细胞的能量代谢与生长活性。3.在传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)感染的PK-15细胞,油红O染色显示细胞内中性脂肪酸含量随着病毒感染剂量的增加而增加。ELISA试剂盒检测进一步证实细胞中增加的中性脂肪酸主要是DAG而非TAG。qPCR检测显示TGEV感染后MGAT2,DGAT1,ATGL的表达量增高,通过siRNA分别下调细胞中的DAG合成酶和分解酶,发现DAG的含量变化与病毒的复制量和病毒的滴度成正相关,但对病毒的吸附和进入无显着相关性。Western blotting显示TGEV感染后可以通过调节DAG的量进而激活PKC信号通路。此外,TGEV感染会引起线粒体形态学上的损伤。但是ALCAT1和LPGAT1的表达量在感染后并没有明显变化,因此ALCAT1和LPGAT1并没有参与TGEV诱导的线粒体损伤过程。本研究阐明了MGAT2能够通过与DGAT1形成多聚体的形式促进TAG的合成;在LPGAT1与ALCAT1共同存在的情况下,LPGAT1可以在一定程度上缓解在氧化应激条件下ALCAT1上调所引起的线粒体损伤;TGEV感染PK-15细胞后,细胞内的MGAT2、DGAT2、ATGL表达量升高,从而使第二信使DAG含量的增加,激活PKC信号通路,继而影响病毒的复制,但TGEV感染并不引起ALCAT1和LPGAT1的表达量的变化。研究结果揭示了酰基转移酶MGAT2/DGAT1与LPGAT1/ALCAT1在脂肪合成、线粒体损伤和病毒复制中的作用及机制,为进一步探索脂代谢关键酶在细胞生理代谢和病毒复制中的作用奠定基础。
金修哲, 何雷, 程相朝, 张春杰, 余祖华[6]2016年在《6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用》文中研究表明【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞(ST)的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID_(50),用细胞维持液配成100·TCID_(50)病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6种中药成分与病毒作用后,测定TGEV的病毒滴度并进行比较分析、RT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200μmol·L~(-1);抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为:160、100、20、62.5、25、100μmol·L~(-1)。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID_(50)为10~(-6.25)/0.1 m L;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5μmol·L~(-1)时与100·TCID_(50)病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72 h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID_(50)为10~(-3.75)/0.1 m L,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10~(-6.45)/0.1 m L差异极显着(P<0.01);通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显着。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为:10~(-4.75)、10~(-5.55)、10~(-5.55)、10~(-5.65)、10~(-5.75)/0.1 m L,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显着,抑制率大多在50%以下。另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显着;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显着,有望被开发成抗病毒药物。
魏广丽[7]2008年在《干酪乳杆菌表面展示表达TGEV-S抗原表位及其免疫原性分析》文中认为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)主要引起仔猪严重腹泻,死亡率高,给养猪业造成极大危害。为了利用乳酸杆菌表达有效的抗原物质,构建重组基因工程乳酸菌,我们利用TGEVS基因cDNA为模板,PCR扩增了TGEV-S主要抗原表位BC片段和A片段。首先将它们亚克隆到pQE-30xa表达载体的多克隆位点BamHI和SalI之间,转化入大肠杆菌XL1-Blue中,构建的大肠杆菌重组菌株分别命名为pQE-BC和pQE-A,经酶切鉴定和DNA序列分析,重组质粒中含有目的基因且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株进行IPTG诱导,融合蛋白获得大量表达,Western-blot分析,重组蛋白能够被Anti-His-Tag单克隆抗体和抗TGEV血清所识别,将表达的蛋白通过镍颗粒纯化,-20℃保存用作诊断抗原。运用相同的限制性内切酶将目的片段从pQE-BC和pQE-A载体上切割下来,连接到pLA乳酸菌表面表达载体上,构建了重组质粒pLA-BC和pLA-A,电转化至干酪乳杆菌内,通过pgsA基因锚定到细胞表面获得表达,经SDS-PAGE、免疫荧光技术和流式细胞术检测,表明约有60kD和58kD的融合蛋白成功表达在菌体表面。Western-blot检测所表达的蛋白具有与TGEV相同的抗原特异性。将获得的阳性重组菌株pLA-BC/L.casei和pLA-A/L.casei口服或滴鼻免疫BALB/c SPF级小鼠,运用间接ELISA方法分别分析血清中IgG和粪便中IgA抗体的动态产生规律。结果表明重组菌口服或滴鼻免疫小鼠后,能够产生明显的抗TGEV IgG和IgA抗体,可诱导小鼠产生特异性粘膜免疫和体液免疫应答,通过对抗体IgG亚类分析,IgG1/(IgG2a+IgG2b)<0.4,产生了偏向TH1型细胞免疫反应。重组乳酸杆菌可能成为抵抗TGEV感染的候选疫苗。
刘玲玲, 曹贝贝, 张利卫, 韩丽, 韦学雷[8]2016年在《新发PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用》文中研究表明猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的冠状病毒,临床上主要引起感染仔猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状,和猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染引起的临床症状极为类似,且临床上PDCoV和TGEV混合感染时有发生,单靠临床诊断很难区分两种疾病,因此建立同时检测且区分PDCoV和TGEV的检测方法具有重要的临床意义。本研究根据Gen Bank中收录的PDCoV N基因和TGEV N基因序列设计了2对引物,在同一反应体系中同时扩增PDCoV的N基因片段和TGEV的N基因片段,通过对RT-PCR反应条件的优化,建立了同时检测PDCoV和TGEV的双重RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、灵敏性和重复性研究。结果显示,所建立的双重RT-PCR对PDCoV和TGEV的最低检测量分别是3.14×102copies/μL和3.68×103copies/μL,利用该双重RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBo V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病毒(P.pseudorabies virus,PRV)的扩增结果均为阴性,显示出较好的特异性。为了解所建立的双重RT-PCR方法的临床应用效果,对252份临床样品进行了检测。结果表明,双重RT-PCR检出PDCoV阳性样品31份(阳性率为12.30%),TGEV阳性样品12份(阳性率为4.76%),同时感染PDCoV和TGEV的阳性样品2份(阳性率为0.79%),且检测结果与单一PDCoV和TGEV RT-PCR相符。因此,本研究所建立的双重RT-PCR方法可用于PDCoV和TGEV的临床检测,为进一步研究PDCoV和TGEV的临床鉴别诊断和流行病学调查提供了理论依据和技术支持。
罗华林[9]2018年在《TGEV CN12株自然传代与化学诱变传代的遗传变异及生物特性研究》文中进行了进一步梳理猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染引起的一种高度接触性肠道传染病。猪传染性胃肠炎病毒可引起各个年龄段的猪发病,其中一周龄仔猪的临床症状最为严重,死亡率极高。而断奶后仔猪感染TGEV的死亡率要比未断奶仔猪感染TGEV的死亡率明显更低,但是断奶后仔猪感染TGEV可造成饲料报酬降低、僵猪等情况,从而给养殖业造成了巨大的经济损失。该病最早于1946年在美国被发现,之后在世界范围内均有该病流行。我国于上世纪50年代发现该病的流行,近年来TGEV也一直在我国流行,近年来不断有新的TGEV毒株被发现,同时发现各毒株之间具有一定的差别。为了预防该病毒对猪场的侵袭,研究该病毒的变异规律并将分离到的野毒株进行疫苗研究并显得尤为重要。将本实验室一株命名为CN12株的TGEV毒株在连续传代条件下从120代传代至200代,成功构建了一株TGEV疫苗株。通过TCID_(50)测定,该毒株滴度为10~(7.0)/mL。将该连续传代的TGEV CN12株进行外源病毒检测,并进行间接荧光实验和中和抗体实验,在外源病毒检测中未发现相关检测病毒的存在。间接荧光抗体实验中实验组荧光明显,对照组无荧光。中和抗体实验中发现在相同时间条件下实验组细胞无细胞病变,而对照组则出现了明显的细胞病变。以上实验进一步确定了CN 12株为TGEV毒株,且在该毒株中未发现有外源病毒存在。将该毒株分别在第135代、200代时进行全基因组测序,这两个代次碱基序列和氨基酸序列与第5代、80代的碱基序列与氨基酸序列进行对比分析。发现TGEV CN12株在长期连续传代的过程中,主要是ORF1基因与S基因的变异为主,并且可以明显看到ORF1基因以碱基替换为主,而S基因则主要以缺失或插入为主。其中ORF1基因的变异比较稳健,变异幅度较小,相应的氨基酸变异也少。TGEV CN12株的S基因变异幅度较大,且其氨基酸变异大。为了扩大疫苗备选株的选择范围,将TGEV CN12株从135代开始使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)进行化学诱变,在诱变传代65代后成功得到一株新的疫苗株TGEV M株。该毒株滴度可达到10~(6.8)/mL。在TGEV M株的外源病毒检测中未发现相关检测病毒的存在。将TGEV M株200代与正常传代的135代进行序列对比发现ORF1中以碱基替换为主,S基因以碱基的缺失或插入为主而ORF3基因的变异则是缺失、插入、替换都存在。在分析中可以发现TGEV M株碱基序列随着病毒代次的增加而有了明显的变化,其中增加了ORF3基因的碱基突变,而正常传代的TGEV CN12株则没有发生ORF3基因的变异。
张赟硕[10]2007年在《抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究指明分别用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达的重组猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)S蛋白和含有猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因主要抗原位点的重组质粒PCI-Sa免疫BALB／c小鼠，按常规方法进行细胞融合。间接ELISA方法进行筛选，前者筛选抗原为TGEV细胞培养物上清；后者筛选抗原为纯化的乳酸乳球菌表达重组TGEV S蛋白。采用有限稀释法，经过叁次克隆，最终前者获得两株抗TGEV S蛋白的杂交瘤细胞株(C7C882和B5G8G7)；后者获得一株抗TGEV S蛋白的杂交瘤细胞株(E6D9A12)。叁株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类分别为IgM、IgM、IgG2a类，杂交瘤细胞体外长期培养和冻存均不影响抗体的分泌。杂交瘤细胞的平均染色体数为88±10对，用相应的筛选抗原经间接ELISA检测C7C882、B5G8G7、E6D9A12细胞培养上清的抗体效价分别为1：200、1：100、1：500，腹水抗体效价分别为1：2×10~5、1：1×10~4、1：6×10~5。以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)细胞培养物上清液为抗原，与叁株杂交瘤细胞上清经间接ELISA检测结果显示，这叁株单抗与TGEV显示良好的特异性，而与PEDV、PRV和PrV不存在交叉反应。说明获得的单抗具有高度的特异性。用实验获得的单克隆抗体和SP2／0细胞培养上清对感染TGEV的ST细胞培养物进行了间接免疫荧光检测病原的比较研究：间接免疫荧光染色后，与单抗作用的细胞培养物中，多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现黄绿色闪亮荧光，且荧光强度强，与SP2／0细胞培养上清作用的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光，结果表明，利用所制备的抗TGEV S蛋白的单克隆抗体进行间接免疫荧光对病原检测具有较高的特异性。以纯化的TGEV为抗原，Dot-ELISA检测实验获得的单克隆抗体与TGEV的反应性，结果叁株杂交瘤细胞上清与TGEV反应均出现灰色印记，可判定为阳性；与SP2／0细胞上清反应为阴性。证明单克隆抗体与TGEV具有特异性反应。上述实验结果均表明，所制备的抗TGEV S蛋白的单克隆抗体对病原检测具有较强的特异性，为TGEV病原特性的基础性研究和病原的快速检测提供了重要的物质基础。
参考文献：
[1]. 中药复方体外抗TGEV诱导猪小肠黏膜上皮细胞凋亡的机制研究[D]. 王雪飞. 内蒙古农业大学. 2016
[2]. 猪源益生菌对宿主肠道病毒的抗病毒作用研究[D]. 王大会. 西北农林科技大学. 2016
[3]. 猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析[D]. 朱蕴暖. 黑龙江八一农垦大学. 2017
[4]. 猪FcRn介导IgG转运及TGEV感染激活NF-κB信号通路调控FcRn表达的研究[D]. 郭锦玥. 华中农业大学. 2016
[5]. MGAT2/DGAT1与LPGAT1/ALCAT1在TAG合成、线粒体损伤和病毒复制中作用及机制研究[D]. 许丹. 西北农林科技大学. 2016
[6]. 6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用[J]. 金修哲, 何雷, 程相朝, 张春杰, 余祖华. 中国农业科学. 2016
[7]. 干酪乳杆菌表面展示表达TGEV-S抗原表位及其免疫原性分析[D]. 魏广丽. 黑龙江八一农垦大学. 2008
[8]. 新发PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 刘玲玲, 曹贝贝, 张利卫, 韩丽, 韦学雷. 农业生物技术学报. 2016
[9]. TGEV CN12株自然传代与化学诱变传代的遗传变异及生物特性研究[D]. 罗华林. 华南农业大学. 2018
[10]. 抗猪传染性胃肠炎病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 张赟硕. 东北农业大学. 2007
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