酪氨酸对rCHO细胞培养和单克隆抗体表达的影响及其作用机制

论文摘要

近年来抗体类药物产业快速发展,利用动物细胞培养技术高效表达抗体类药物已成为生物制药产业的核心技术。在QbD理念指导下建立高产优质的细胞培养过程是抗体类药物产业发展的必然要求,其中培养基营养组成的理性设计是实现这一要求的重要保障,而认识酪氨酸等营养物质对细胞生长和产物表达的作用以及确保它们的均衡供给至关重要。为此,本文以表达抗CD20单克隆抗体的重组CHO（rCHO）细胞为研究对象,以经常遇到的流加培养工艺后期活细胞密度和抗体比生成速率下降等共性问题为切入点,首先研究和分析酪氨酸对rCHO细胞流加培养过程的影响,以及因酪氨酸限制所导致的细胞死亡方式及其机制。然后从细胞胞外培养环境和细胞胞内抗体合成两方面研究分析酪氨酸浓度对抗体比生成速率的影响。最后,结合流加培养过程细胞胞外和胞内的环境变化以及抗体关键质量属性的改变,进一步探究酪氨酸限制影响抗体合成加工和修饰的途径及其机制,为优化酪氨酸等关键营养物质的供给策略、建立高产优质的抗体类药物等重组蛋白生产工艺奠定科学基础。本文首先在前期建立的流加培养工艺过程的基础上,发现在不同的输入条件下rCHO细胞表现出某些相同的特征:细胞培养大约至第9天之后,抗体的比生成速率出现快速下降,抗体的表达量进入平台期;培养至第11-13天时,活细胞密度和细胞活率快速下降,并在24小时内细胞全部死亡,同时发现培养液的pH值快速下降至6.5以下。以上现象的出现严重影响了抗体的高效表达。为此,本文筛查3个过程参数和18种关键培养基组分,来考察它们对流加培养过程的影响,结果发现只有提高酪氨酸的添加量时,培养过程的抗体表达量才会显著提高。进一步通过单因素梯度实验考察酪氨酸累积添加量对流加培养工艺过程表现的影响,结果发现当酪氨酸的累积添加量达到4.3 mmol/L及以上时,流加培养过程后期的活细胞密度、细胞活率、抗体的比生成速率以及培养液的pH值才能得以维持。而当酪氨酸累积添加量低至1.9 mmol/L及以下时,流加培养过程的细胞生长、活细胞密度维持以及抗体表达均会受到严重限制,并且培养结束时培养液的pH值也会显著降低,说明酪氨酸是影响该流加培养过程后期细胞生长、抗体表达以及培养液pH值的关键因素。针对酪氨酸限制引起rCHO细胞在流加培养过程后期快速死亡的问题,本文首先选择了两组酪氨酸累积添加量截然不同的典型流加培养工艺过程,其中能满足细胞需求的高添加量实验组,定义为对照组（Ctrl）;而酪氨酸严重供给不足的低添加量组,定义为酪氨酸限制组（Tyr-Limit）。通过考察培养过程中酪氨酸浓度的变化以及细胞的生长状态,发现酪氨酸限制组在培养至第7天后即发生了酪氨酸限制,随后细胞活性逐渐下降,至第11天后活细胞密度和细胞活率出现快速下降,直至第12天时细胞全部死亡。而酪氨酸供给充足的对照组,培养过程中细胞一直处于相对稳定的状态。此外,实验还发现酪氨酸限制造成的细胞损伤具有不可逆性。进一步考察典型流加培养过程中细胞自噬、凋亡、坏死及有丝分裂灾难四种死亡方式,结果发现酪氨酸限制条件下与有丝分裂灾难相关的G2/M期检查点没有出现异常,凋亡以及坏死的细胞比例也没有比对照组高,且凋亡和坏死的细胞比例总和仅约6%。但实验发现在酪氨酸限制组的第7天到1 1天期间,细胞胞内的LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3I水平均逐步升高,且显著高于对照组,第8和11天时单丹磺酰戊二胺（MDC）阳性率分别达到31.7%和53.8%,远高于第3天以及整个对照组培养过程的检测结果（约5%）。由此说明在酪氨酸限制的培养过程中细胞的死亡方式有可能以细胞自噬为主。在此基础上本文进一步采用换液实验将酪氨酸浓度控制在0-1.8 mmol/L之间,考察酪氨酸浓度对细胞生长特征以及死亡方式的影响,结果表明当酪氨酸浓度低至0.1 mmol/L以下时,细胞生长会受到限制,当酪氨酸浓度进一步降低至0.01 mmol/L及以下时,细胞将快速死亡。同时发现当酪氨酸浓度控制在0-1.0 mmol/L之间时,酪氨酸浓度越低,细胞自噬水平越高,进一步说明在酪氨酸限制的条件下细胞会发生自噬性死亡。这其中的原因是酪氨酸限制导致了mTOR信号途径被抑制,进而激活了mTOR介导的自噬起始蛋白ULK,从而促使细胞自噬水平升高。对于酪氨酸限制培养后期细胞死亡的同时出现培养液pH值快速下降的现象,研究结果表明培养液pH值快速下降主要是由酪氨酸限制导致的细胞自噬引起。实验还发现虽然培养环境的低pH值会导致细胞逐渐死亡,但其与酪氨酸限制培养后期的细胞快速死亡截然不同,培养液pH值下降至6.5以下发生的细胞死亡方式是以细胞坏死为主。说明在酪氨酸限制过程中细胞自噬性死亡带来的pH下降进一步加快了细胞死亡的进程。本文通过考察典型流加培养过程后期的抗体表达差异,发现酪氨酸浓度过低会使得抗体的比生成速率大幅降低。进一步从细胞胞外培养环境和细胞胞内抗体合成两方面研究分析酪氨酸浓度对抗体比生成速率的影响,发现培养环境中渗透压、乳酸浓度和氨浓度的升高仅仅是酪氨酸限制导致细胞代谢发生变化的表现结果而已,并不是限制抗体表达速率的主要因素,而细胞胞内的抗体翻译过程才是酪氨酸限制培养过程中抗体表达的主要限制节点。通过对比维持培养后期抗体比生成速率所需的酪氨酸供给速率（0.008 pmol/cell/day）,发现酪氨酸限制实验中抗体翻译过程存在底物限制现象,另外,mTOR途径被限制以及供能效率下降会进一步限制抗体翻译过程,最终导致抗体翻译效率的大幅下降。与此同时,实验发现酪氨酸限制还会影响抗体的合成加工和修饰,造成抗体片段化、聚体以及电荷变体等关键质量属性的改变。其中,酪氨酸限制组的抗体片段含量比对照组高了4个百分点,仅HHL片段就占了其中的3个百分点。进一步研究表明,这种抗体片段化过程主要发生在培养上清中,与酪氨酸浓度过低时培养环境的还原能力上升、细胞死亡释放的谷胱甘肽酶系和硫氧环蛋白酶系等有关。酪氨酸限制实验所获抗体的聚体含量只有正常水平的一半左右,显著低于对照培养,其主要原因在于酪氨酸限制培养过程中的胱氨酸和半胱氨酸累积。酪氨酸限制组的抗体赖氨酸变体含量显著高于对照培养,这可能与酪氨酸限制培养过程中CpB和CpH两种碱性羧肽酶的mRNA转录水平下调有关,而两者总的碱性电荷变体含量无显著差异,其原因可能与抗体碱性电荷变体中的脯氨酸酰胺化程度的不同有关。通过本文的研究,一方面深入认识了酪氨酸在rCHO细胞高密度流加培养过程中所发挥的关键作用,另一方面也更加透彻地理解了酪氨酸限制对细胞生长、抗体合成及其加工修饰的影响和机制,这些认识可为未来理性设计培养基的营养组成、优化酪氨酸等关键营养物质的供给策略提供科学指导。

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摘要

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缩略词

氨基酸缩写说明

第1章前言

1.1 动物细胞培养技术和抗体类药物产业的发展概况

1.1.1 动物细胞培养技术的发展概况

1.1.2 抗体类药物产业的发展概况

1.1.3 抗体类药物产业化的动物细胞培养关键技术

1.2 培养过程中动物细胞对营养物质的需求

1.2.1 营养物质与细胞生长

1.2.2 营养物质与产物表达

1.2.3 营养物质与产品质量

1.2.4 高密度细胞培养过程的营养物均衡供给

1.3 细胞培养过程中酪氨酸的供需

1.3.1 酪氨酸的性质

1.3.2 酪氨酸的来源

1.3.3 细胞对酪氨酸的需求

1.3.4 细胞培养过程中酪氨酸的供需矛盾

1.3.5 细胞培养过程开发和优化面临的主要问题

1.4 本文的研究内容、目的及意义

第2章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 培养基

2.1.3 实验仪器及耗材

2.2 细胞培养

2.2.1 细胞复苏及传代培养

2.2.2 细胞培养管中的细胞培养

2.2.3 生物反应器中的细胞培养

2.3 检测分析方法

2.3.1 细胞密度、细胞活率及细胞直径的测定

2.3.2 细胞形态的检测

2分压的测定'> 2.3.3 营养物、代谢物浓度以及CO₂分压的测定

2.3.4 培养液PH值的测定

2.3.5 培养上清渗透压的测定

2.3.6 细胞活性的检测

2.3.7 细胞周期的测定

2.3.8 细胞凋亡的检测

2.3.9 细胞总蛋白的提取及含量的测定

2.3.10 Western blotting检测

2.3.11 荧光定量PCR

2.3.12 培养液氧化还原电位（ORP）的测定

2.3.13 细胞培养上清液中抗体浓度的测定

2.3.14 细胞胞内抗体含量的测定

2.3.15 抗体的纯化

2.3.16 抗体片段化的检测

2.3.17 抗体聚体的检测

2.3.18 抗体电荷变体的检测

2.3.19 抗体N-糖基化构型的检测

2.4 数据统计学分析

第3章 rCHO细胞生长和抗体表达的基本特性及其关键因素

3.1 前言

3.2 实验设计

3.3 结果与讨论

3.3.1 流加培养工艺过程表现的共同特征

3.3.2 影响流加培养过程表现的关键因素

3.3.3 酪氨酸对流加培养过程的影响

3.4 本章小结

第4章酪氨酸限制导致的rCHO细胞死亡及其作用机制

4.1 前言

4.2 实验设计

4.3 结果与讨论

4.3.1 酪氨酸限制对细胞生长状态的影响

4.3.2 细胞死亡方式及其机制

4.3.3 培养液pH值下降的原因及其与细胞死亡之间的关系

4.4 本章小结

第5章酪氨酸对抗体表达的影响及其作用机制

5.1 前言

5.2 实验设计

5.3 结果与讨论

5.3.1 典型流加培养过程中抗体表达特征分析

5.3.2 酪氨酸影响抗体比生成速率的作用及其机制

5.3.3 酪氨酸对抗体关键质量属性的影响及其机制

5.4 本章小结

第6章全文总结与展望

6.1 全文总结

6.2 本文创新点

6.3 建议与展望

参考文献

致谢

研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 唐红萍

导师: 谭文松

关键词: 细胞,抗体,酪氨酸,自噬,表达量,质量

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q813

总页数: 128

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酪氨酸对rCHO细胞培养和单克隆抗体表达的影响及其作用机制

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