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伪结核棒状杆菌的分离鉴定和传代致弱及类毒素的免疫应用

2020-12-08阅读(564)

伪结核棒状杆菌的分离鉴定和传代致弱及类毒素的免疫应用

论文摘要

伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberulosis,C.p）是一种人畜共患病原菌,在养殖业中能对多种动物感染,其中以羊的感染最为多见,能够引起羊干酪性淋巴结炎（Caseous lymphadenitis,CLA）,在国内外均有其流行报道。羊群感染伪结核棒状杆菌后,常不致死,多呈慢性经过,病羊表现为渐近性消瘦、被毛粗乱、局部干酪样脓肿病变等症状,除影响皮毛、肉制品、乳制品质量和降低其经济价值外,还能够威胁公共卫生安全,已经对世界养羊业发展造成较大损失。近年来,在我国畜牧业快速发展的同时,羊干酪性淋巴结炎也在我国多省份出现流行,其中山羊发病报道多于绵羊,且有更加严重的流行趋势。羊干酪性淋巴结炎发病数量逐渐增多,但目前对该病原及防控方法研究较少。本研究在陕西宝鸡和铜川两地的关中奶山羊养殖场中,采集干酪性淋巴结炎发病羊脓肿组织病料,通过细菌分离培养方法获得疑似伪结核棒状杆菌菌株两株,对其进行了挑纯、染色镜检、生化试验、分子生物学鉴定和动物致病性试验;对分离鉴定的两株伪结核棒状杆菌LX1和TC11菌株进行体外连续传代培养,用两株细菌的原代、50代、100代、150代和200代菌株分别进行小鼠致病性试验,同时使用致弱效果较好菌株的200代菌株注射小鼠14 d后,用致病性较强的原代菌株进行攻菌试验,以研究传代致弱方法对开发弱毒疫苗的可行性;为开发类毒素疫苗,将表达的毒素磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）用5%的甲醛（V/V）,室温作用48 h进行灭活制成类毒素制剂,分别免疫小鼠和两批山羊,用间接ELISA测免疫后30 d、90 d和150 d山羊血清抗体。试验结果如下:1.分离菌株LX1和TC11经37℃培养48 h后,在麦康凯琼脂培养基不生长,在营养琼脂培养基生长贫瘠,鲜血琼脂培养基上可见乳白色、干燥、易于刮落、不透明、边缘较整齐,直径约1 mm2 mm的菌落。革兰氏染色阳性,呈球状、球杆状或棒状,生化试验和16S rRNA的PCR鉴定结果确定分离菌株为伪结核棒状杆菌,且两株分离菌株均能使小鼠死亡或注射部位引发干酪样脓肿病变;药敏试验结果表明,两菌株对磺胺类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内脂类等抗生素均敏感,多粘菌素均耐药。2.LX1和TC11菌株的原代与第50、100、150和200代菌株接种小鼠后7 d内,LX1原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠注射部位脓肿病变区域平均直径为8.7mm,传代菌株注射小鼠均未死亡,病变平均直径分别为4.6 mm、2.6 mm、1.4 mm和1 mm;TC11原代菌株注射的小鼠死亡2只,未死亡小鼠平均病变直径为9.3 mm,传代菌株注射小鼠均未死亡,病变平均直径分别为5.4 mm、2.8 mm、1.8 mm和1.4 mm。LX1第200代菌株接种小鼠14 d后攻菌,10只实验组小鼠无死亡个体,平均脓肿直径为2.0 mm,10只对照组小鼠死亡4只,未死亡小鼠平均脓肿直径为7.8 mm;3.类毒素免疫试验中,攻菌7 d内,试验组小鼠10只均未死亡,1只小鼠发病,保护率为90%（9/10）,对照组小鼠死亡4只,剩余6只全部发病;羊群预实验中,90 d内实验组干酪性淋巴结炎发病1头,病原为金黄色葡萄球菌;对照组发生干酪性淋巴结炎3头,分离到伪结核棒状杆菌两株;羊群大规模免疫试验中,150 d内实验组干酪性淋巴结炎发病羊为8头,分离到1株伪结核棒状杆菌,伪结核棒状杆菌感染率为0.9%（1/114）,对照组干酪性淋巴结炎发病羊23头,分离到9株伪结核棒状杆菌,伪结核棒状杆菌感染率为7.9%（9/114）;免疫羊血清OD450检测结果表明,在免疫后30 d内抗体水平最高,而后呈下降趋势,在150 d时接近阳性血清临界值。以上研究结果证实,连续传代的方法可有将伪结核棒状杆菌毒力致弱,为伪结核棒状杆菌弱毒疫苗开发奠定理论基础;羊伪结核棒状杆菌类毒素疫苗能够为免疫小鼠和免疫羊只提供一定的免疫保护,但存在免疫有效期短的问题,需要后期研究延长免疫有效期。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 主要符号对照表
  • 文献综述
  •   第一章 羊伪结核棒状杆菌研究进展
  •     1.1 病原学
  •       1.1.1 发现史及分类地位
  •       1.1.2 菌体染色形态
  •       1.1.3 生长特性与营养要求
  •       1.1.4 生化特性
  •     1.2 流行病学特征
  •       1.2.1 流行特点
  •       1.2.2 国内外流行状况
  •     1.3 感染机理与免疫应答
  •       1.3.1 感染机理
  •       1.3.2 免疫应答
  •     1.4 临床症状与病理变化
  •       1.4.1 体表型
  •       1.4.2 内脏型
  •       1.4.3 混合型
  •     1.5 毒力因子
  •       1.5.1 磷脂酶D
  •       1.5.2 分枝菌酸
  •       1.5.3 σ因子
  •       1.5.4 铁元素摄取调节相关毒力因子
  •       1.5.5 其他毒力因子
  •     1.6 诊断方法
  •       1.6.1 病原分离鉴定
  •       1.6.2 血清学诊断
  •       1.6.3 分子生物学诊断
  •       1.6.4 其他诊断方法
  •     1.7 疫苗研究概况
  •       1.7.1 灭活疫苗
  •       1.7.2 类毒素制剂
  •       1.7.3 基因工程疫苗
  •       1.7.4 活疫苗
  •     1.8 本研究的目的意义
  • 试验研究
  •   第二章 羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定
  •     2.1 材料和方法
  •       2.1.1 病变样品
  •       2.1.2 实验动物
  •       2.1.3 主要试剂
  •       2.1.4 主要仪器设备
  •       2.1.5 主要溶液配制
  •       2.1.6 临床样品采集
  •       2.1.7 组织涂片制备
  •       2.1.8 革兰氏染色
  •       2.1.9 病变样品接种培养
  •       2.1.10 细菌分离纯化
  •       2.1.11 菌落染色镜检
  •       2.1.12 生化试验
  •       2.1.13 细菌扩增
  •       2.1.14 PCR诊断方法
  •       2.1.15 小鼠致病性试验
  •       2.1.16 菌株药敏试验培养基筛选
  •       2.1.17 分离菌株纸片法抗菌药物敏感性试验
  •     2.2 试验结果
  •       2.2.1 细菌培养和镜检结果
  •       2.2.2 生化试验结果
  •       2.2.3 液体培养和药敏试验培养基筛选
  •       2.2.4 PCR诊断结果
  •       2.2.5 小鼠致病性试验
  •       2.2.6 药敏试验结果
  •     2.3 讨论
  •     2.4 小结
  •   第三章 伪结核棒状杆菌的传代致弱
  •     3.1 材料和方法
  •       3.1.1 传代菌株
  •       3.1.2 实验动物
  •       3.1.3 主要试剂
  •       3.1.4 主要仪器设备
  •       3.1.5 主要试剂配制
  •       3.1.6 细菌传代培养
  •       3.1.7 菌株PCR鉴定
  •       3.1.8 小鼠致病性试验
  •       3.1.9 LX1传代菌株小鼠免疫保护试验
  •     3.2 试验结果
  •       3.2.1 菌株传代培养
  •       3.2.2 菌株PCR产物电泳和测序结果
  •       4.2.3 菌株PLD基因PCR检测结果
  •       3.2.4 小鼠致病性试验结果
  •       3.2.5 LX1传代菌株小鼠免疫保护试验
  •     3.3 讨论
  •     3.4 小结
  •   第四章 伪结核棒状杆菌类毒素的免疫应用
  •     4.1 材料和方法
  •       4.1.1 磷脂酶D（PLD）
  •       4.1.2 实验动物
  •       4.1.3 主要试剂
  •       4.1.4 主要仪器设备
  •       4.1.5 主要溶液配制
  •       4.1.6 类毒素制备
  •       4.1.7 小鼠类毒素免疫试验
  •       4.1.8 羊群类毒素免疫预试验
  •       4.1.9 羊群类毒素免疫及抗体监测
  •     4.2 试验结果
  •       4.2.1 小鼠类毒素免疫试验结果
  •       4.2.2 羊群类毒素免疫预试验结果
  •       4.2.3 羊群类毒素免疫及抗体监测结果
  •     4.3 讨论
  •     4.4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王斌

    导师: 王兴龙

    关键词: 伪结核棒状杆菌,分离鉴定,传代致弱,类毒素

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家绒毛用羊产业技术体系项目(编号:CARS-39-14)

    分类号: S852.61

    总页数: 63

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