彭念寅[1]2004年在《Pinacidil预处理对损伤心肌细胞线粒体保护作用的实验研究》文中研究表明预处理不但对缺血性损害产生保护效应，而且对多种损伤如创伤、烧伤、氧化应激、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等也能产生保护效应。心肌缺血预处理对心肌具有明显的保护作用，但至今仍未找到一种临床上满意的预处理方法。新近研究发现，mitoK(ATP)通道开放剂(KCOs)可以模拟缺血预处理样效应，保护心肌收缩功能，显着缩小心肌梗死范围。如同时给予特异性的mitoK(ATP)通道阻断剂(5-HD)时，这种保护作用消失。mitoK(ATP)通道的开放是预处理保护作用的靶点之一。但其保护作用的机制尚未阐明。 ROS是缺血再灌注损伤的重要致损因素，在短暂缺血时产生的适量自由基却可明显减轻随后严重缺血造成的心肌梗塞，其作用可能与触发机体的应激反应、产生少量ROS、刺激mitoK(ATP)通道提前开放有关，基于吡那地尔(Pinacidil，PIN)是一种K(ATP)开放剂，我们推测，如果在损伤前给予适量的Pinacidil，使mitoK(ATP)通道提前开放，可能对损伤心肌产生一定保护效应。基于上述推论，本实验拟用Pinacidil预处理，观察其是否对烫伤大鼠心肌产生保护作用，并进一步探讨其作用机制，为心肌损伤的预防和治疗提供实验依据。 材料和方法 1．体内实验：将Wistar大鼠随机分为正常对照组，烫伤组(单纯给予烫伤)，Pinacidil预处理组(先用Piancidil预处理后再烫伤)，每组8只动物。腹腔注射Pinacidil(50μg／kg)或等容量的生理盐水(Ns)，完成预处理过程。半小时后复制大鼠Ⅲ°TBSA 30％烫伤模型。通过右颈总动脉插管监测大鼠血流动力学和心脏功能指标；差速离心法提取心肌线粒体检测大鼠心肌线粒体呼吸功能，MDA、超氧阴离子含量；电镜观察大鼠心肌线粒体超微结构的改变。研究Pinacidil预处理对严重烫伤大鼠的心肌保护作用以及对心肌线粒体结构和功能的影响。第叁军医大学博士学位论文 2.体外实验:培养心肌原代细胞，分别按照lxl05闹或5x10今而的密度接种于含有盖玻片的24或96孔培养板中，实验分4组:正常对照组、H20:组(4 00 0 mo比HZoZ)、P创组预处理组(HZoZ组+1 X 10一moFL Pinacidil)、5一HD组(Pm组+xx10一4mo比5一HD)、每组3个复孔。Pianeidil预处理药物提前半小时给予。用M仃检测心肌细胞活力;免疫组化法检测心肌线粒体细胞色素C的释放情况;激光共聚焦法测定线粒体膜电位。主要结果 1.严重烫伤大鼠血流动力学和心功能的变化特征及Pinacidil预处理对烫伤大鼠的影响 严重烫伤后，大鼠收缩压(sP)、舒张压(DP)、平均动脉压(MAP)急剧下降，与烫伤前比较差别显着(P<0.01)，烫伤后1h有所回升，但没有恢复到正常水平，烫伤后3h、6h又呈逐渐下降趋势。Pinacidil预处理组严重烫伤后血压虽然也有下降，但下降幅度较烫伤组明显减轻。两组大鼠心率在烫伤后并没有加快，而是减慢。烫伤组心率从烫伤后开始呈进行性下降，P水组亦呈逐步递减趋势，但较烫伤组明显减轻(P<0.05一0 .01)。 心室收缩压在大鼠烫伤后立即显着下降，并持续维持在低水平，和烫伤前比较有显着性差异，尤其到了6小时后，差别更明显;PIN组心室收缩压在烫伤后也有明显下降，但下降幅度较烫伤组轻。烫伤后各时相点P创组的LVSP与烫伤组比较，尸均<0.01。LVEDP的变化规律和LVSP相反，LVEDP烫伤后明显升高。PIN组虽然在烫伤后明显增高，但增高的幅度与烫伤组比较有所减轻(P<0 .05~0.01)。 烫伤后即刻+dP/d tmax、一dP/cttmax均显着下降，虽然烫伤lh后有所回升，但以后又呈进行性下降。P水组呈相似的变化趋势，但下降幅度明显减少。在相应的各时相点，两组比较有显着差异(P<0.05~0.01)。烫伤后t~dp/dtmax呈进行性的延长，烫伤后lh、3h、6h和烫伤前比较均有显着差异(P<0.05~0.01)。PIN组在烫伤后t一dP/drmax立即延长，于lh后明显缩短，和烫伤前比较没有差异。但于烫伤后3h、6h又延长。与烫伤组比较，其延长幅度明显减轻(P<0.05~0.01)。 2.严重烫伤大鼠心肌线粒体呼吸功能变化和Pinacidn预处理对其的影响 烫伤后各时相点大鼠心肌线粒体呼吸控制率均明显降低，直到烫伤6小时后仍然没有恢复。和正常组比较有非常显着的差异(P<0.01)。Pinacidil预处理组在烫伤后心肌线粒体呼吸控制率的降低幅度明显减轻。两组间比较p<0.05·0.01。第叁军医大学博士学位论文 3.严重烫伤大鼠线粒体MDA和超氧阴离子变化和Pinacidil预处理的影响 MDA含量在烫伤后1小时明显增加，和对照组比较有显着差异(p<0 .05)，烫伤后3h、6h增加更为显着(p<0.01);Pinaeidil预处理组MDA增加程度有所减轻，且升高的时间明显后延。和对照组比较，烫伤后6小时才出现显着性差异(P<0.01)。和烫伤组比较，烫伤后3h、6h MDA有明显差异伊<0.05一0.01)。 超氧阴离子含量在烫伤后呈逐渐递增趋势，和对照组比较在烫伤后各相应时相点均有显着差异(P<0.01);Pinacidil预处理组超氧阴离子增加缓慢，和对照组比较，烫伤后3小时才出现显着性差异(p<0.01)。和烫伤组比较，PIN组在烫伤后各相应时相点超氧阴离子含量均明显下降(P<0.05一0.01)。 4.严重烫伤大鼠心肌线粒体电镜结构的改变和Pinacidil预处
霍小萍[2]2002年在《吡那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究》文中提出大量研究表明预适应(preconditioning,PC)为预先给予机体或细胞某种有害刺激，当再次暴露后可产生对该种有害刺激的耐受性反应，是机体的一种保护性效应。在缺血预适应研究中发现有许多药物可以模拟其作用达到预适应的目的，如K_(ATP)通道开放剂吡那地尔(Pinacidil)、Nicorandil、Bimakalim、Aprikalim等可模拟缺血预适应对心肌具有保护作用，也称为药理性预适应(pharmacologic preconditioning)。内毒素耐受性(endotoxin tolerance,ET)为内毒素血症的PC过程，其机理与缺血预适应相类似，两者存在着交叉耐受性(cross-tolerance)。研究发现脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、单磷酸类脂质A(monophosphoryl lipid A, MLA)等可产生ET,也可以减轻缺血/再灌注对心脏、肝脏、肾脏的损伤，基于此思路，本实验首次用可模拟缺血预适应的Pinacidil预处理动物及细胞，观察对内毒素血症的预保护作用及其作用机理。 首先本课题在验证Pinacidil对内毒素血症有无预保护作用的基础上，以K_(ATP)通道关闭剂Glyburide为工具药，针对内毒素血症致死的主要机制，观察Pinacidil预处理对内毒素血症时血液凝血机制的影响，对内毒素血症细胞因子产生及其信号转导调控机制的作用，以及在Pinacidil预处理后对中性粒细胞呼吸爆发的影响，主要的结果及结论如下： 1．Pinacidil预处理后内毒素血症小鼠生存率明显增加，Glyburide可以拮抗Pinacidil的作用，使生存率与未治疗组相差不明显。内毒素血症大鼠表现为代谢性酸中毒伴呼吸性酸中毒，高钾血症及低钠、低氯的、低钙血症；Pinacidil预处理后加重代谢性酸中毒，减轻呼吸性酸中毒，有加重大鼠内毒素血症后高钾血症及低钠、低氯、低钙血症的作用，Glyburide可部分阻断 第叁军医大学博士研究生论文 毗那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究 Pinacidil的作用。表明Pinacidil对内毒素血症有药物预保护作用，但对于内 毒素血症所引起的代谢紊乱无明显作用。 2．用沉淀法对大鼠血液凝血因子＊、V、VIJ、X及纤维蛋白原含量研究 发现，Pinacidil预处理可使内毒素血症时凝血因子。11、V、皿、X减少滞后， 在各时相点均使纤维蛋白原量明显高于LPS组，Glyburide对Pinacidil有明 显的桔抗作用。此结果表明Pinacidil预处理可使内毒素血症凝血作用启动 晚，血液中微血栓形成较少，可减轻内毒素导致的凝血功能亢进的作用。 3．用ELISA法检测大鼠血液细胞因子IN’－－－－、、IL－6含量显示，Pinacidil预 处理使内毒素血症TN’－－－0、u－6含量明显降低；在用LPS攻击人单核细胞株 M－l时也发现，Pinacidil预处理可使M－l生成IN’－－、、IL6明显减少， Glyburide对Pinacidil预处理有明显的桔抗作用，表明Pinacidil预处理使SIRS 反应中单核／巨噬细胞生成细胞因子MO、IL6减少，继而降低血液中M－。。 IL6含量，减轻SIRS反应。 4．本文用流式细胞仪研究THP．l细胞膜表面抗体标记的hR4时发现，在 LPS的攻击下，LPS跨膜受体’－WWx的表达呈可诱导性表达；我们首次发现在 不同浓度的L陀刺激下，Phuldn预处理使Te－1细胞膜表面TLR4表达 量明显降低；在用 ELISA法研究核内 NF－K Bty65）表达量时也显示，Pinacidil 预处理使不同浓度 LPS刺激后 NF－。Bio65）表达量降低，Glyburide对以上 反应均有桔抗作用。由此说明Pinacidil预处理可下调LPS跨膜信号转导过 程，导致 M4 Bio65）表达下调，最终使 LPS诱导细胞因子生成的级联反应 降低，因此对SIRS反应具有预保护效应。 5．在研究中性粒细胞呼吸爆发和细胞内K 变化时结果显示，Pinacidil 预处理使 LPS攻击后胞内游离＊a2＋］升高程度明显降低，并使中性粒细胞在 PMA刺激下呼吸爆发明显减弱，Glybchde明显桔抗Pinacidil预处理的作用。 因此Pinacidil预处理可抑制中性粒细胞呼吸爆发作用，减少氧自由基生成， 减轻对器官和细胞的损伤。 综上所述，Pinacidil预处理对内毒素血症具有药理性预适应效应，其 作用机理为减轻LPS导致的凝血功能亢进，下调LPS跨膜信号转导过程并 Vll ／ 第叁军医大学博士研究生论文 毗那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究使SIRS反应减轻，降低中性粒细胞呼吸爆发作用。本实验拓宽了药理性预适应在内毒素血症中的研究思路，为临床脓毒症／感染性休克的预防和保护性治疗提供了新手段，同时也为KAT，通道参与调节跨膜信号转导过程的基础研究
许佳俊[3]2004年在《吡那地尔预处理对在体兔缺血再灌注心室肌的若干电生理参数影响》文中研究指明【目的】 观察不同浓度的吡那地尔( Pinacidil)预处理对在体兔缺血再灌注心室肌若干电生理参数的影响。【方法】 家兔32只,随机分为4组:即生理盐水+心室肌缺血再灌注组;吡那地尔预处理(浓度分别为0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg)+心室肌缺血再灌注组,每组各8只。冠状动脉左前降支结扎前10分钟耳缘静脉注射吡那地尔,对照组于结扎前10分钟静脉注射等量的生理盐水。分别应用心外膜单相动作电位(MAP)记录法测定在体兔的心室肌在缺血期及再灌注期不同时段的MAP参数及S1-S2程控电刺激法测定心室颤阈(VFT)和心室易损期(VVP)等电生理指标的变化。【结果】 1、对心外膜MAP的影响:(1)应用吡那地尔后,即刻动作电位90%( APD90)及50%复极化时程(APD50)缩短;在缺血区,缺血30分钟与同时段的对照组比较,吡那地尔0.8mg/kg预处理组心室肌MAPD90、MAPD50分别缩短15.4%和31% (均P<0.05); (2) 缺血期及再灌注期,不同浓度吡那地尔预处理组均明显消除早期后除极(EAD);(3) 缺血期和再灌注期与同时段的对照组比较,吡那地尔0.2mg/kg预处理组能缩短心室肌缺血区与非缺血区MAPD90、MAPD50离散度(均P<0.05);吡那地尔0.2mg/kg预处理组与吡那地尔0.8mg/kg预处理组比较P<0.05,提示后者有增加缺血区与非缺血区MAPD90、MAPD50离散度的趋势。2、对VFT及VVP的影响:(1)在缺血期及再灌注期,与对照组比较吡那地尔0.2mg/kg预处理组可提高VFT、缩短VVP(P<0.05);(2) 在缺血及再灌注期,与同时段的对照组比较,吡那地尔0.8mg/kg预处理组对VVP及VFT影响不显着(P>0.05);(3)在缺血15分钟及再灌注即刻,与0.2mg/kg预处理组比较,0.8mg/kg
文婷[4]2016年在《异甜菊醇钠对豚鼠心肌细胞sarcK_(ATP)和mitoK_(ATP)通道的调控作用及机制》文中认为K_(ATP)通道是一种ATP敏感型钾离子通道,在心肌细胞中广泛存在。K_(ATP)通道无论是在生理条件下还是在病理条件下对代谢调节都起着非常重要的作用。正常条件下,胞内ATP的浓度能够抑制心肌K_(ATP)通道开放,K_(ATP)通道可以将细胞代谢条件与膜电信号耦联起来;在心肌肥大等病理条件下,K_(ATP)通道对其开放剂或是ATP的敏感性降低,会使心肌对代谢压力的适应性降低,对于药物治疗是不利的。异甜菊醇(isosteviol,STV)是由甜菊醇(stevioside)酸水解得到的,异甜菊醇钠(STVNa)是异甜菊醇的钠盐形式。STV已经被证实对心血管疾病具有保护作用,比如具有抗缺血复灌损伤,抗高血压、抗高血糖等。本文主要研究了STVNa对细胞膜K_(ATP)通道(sarcK_(ATP)通道)和线粒体K_(ATP)通道(mitoK_(ATP)通道)的影响,研究内容如下:(1)以急性分离的豚鼠心室肌细胞为研究对象,研究了STVNa对sarcK_(ATP)通道的影响。结果表明STVNa可以增加心肌细胞sarcK_(ATP)通道对Pinacidil的敏感性,不仅增大了通道的电流密度,而且还加大了sarcK_(ATP)通道的开放速度,且STVNa对sarcK_(ATP)通道的影响是时间、剂量依赖性的。(2)研究了STVNa对心肌细胞膜上L型钙电流(Ica)、快速延迟整流钾离子电流(Ikr)以及动作电位(AP)的影响。结果表明,STVNa对L型钙电流、快速延迟整流钾离子电流和动作电位都没有显着影响。(3)研究了STVNa对mitoK_(ATP)通道的影响。用10μM STVNa孵育后,Dizoxide诱导的细胞线粒体黄素荧光蛋白的荧光强度显着增加(Dizoxide诱导的黄素荧光蛋白荧光强度变化可以间接的反应K_(ATP)通道活性的变化)。STVNa组Dizoxide诱导的黄素蛋白相对荧光强度是control组的2.5倍左右,P<0.05,而且STVNa本身不会引起黄素荧光蛋白荧光强度的改变。(4)为了验证STVNa对sarcK_(ATP)通道和mitoK_(ATP)通道的增敏作用是否与活性氧(ROS)有关,我们用ROS清除剂(NAC)和STVNa共孵育细胞。结果表明,100μM NAC与STVNa共孵育抑制了sarcK_(ATP)电流的增加,而100μM NAC本身并不影响sarcK_(ATP)电流大小;在线粒体中,NAC与STVNa共孵育也使Diazoxide激发的黄素荧光强度变弱。同样地,100μM NAC本身对Dizoxide激发的荧光强度也没有影响。结论:(1)STVNa增加了sarcK_(ATP)通道和mitoK_(ATP)通道的敏感性,增加了sarcK_(ATP)通道的开放速率;(2)STVNa对L型钙电流、Ikr电流以及动作电位都没有影响;(3)STVNa对K_(ATP)通道的增敏作用与ROS有关。
段大为[5]2004年在《药物预处理对离体心脏保存作用的实验研究》文中研究指明目的： 研究药物预处理及在改良的St.Thomas Ⅱ液中加入钾离子通道开放剂和阿片受体激动剂对离体心脏的保存效果。以及尼可地尔再灌注对减轻钙离子超载的作用。为改善供心保存寻求更有效的方法。 方法： 1．利用改良的Langendorff灌注装置，建立离体心脏灌注模型。 2．在ST，Thomans Ⅱ液中加入尼可地尔作为实验组Ⅰ组的离体心脏保存液(钾离子浓度8.0mmol／L)。观察药物预处理及低温保存不同时间和再灌注30min后离体心脏的恢复情况；对照组用UW液作为离体心脏的保存液； 3．在尼可地尔预处理和低温下保存8h的基础上，在K-H灌注液中加入尼可地尔，观察其保护效果。与尼可地尔预处理和低温保存8h组相比较。 4．在ST，Thomans Ⅱ液中加入U50，448H作为实验组Ⅱ组的离体心脏保存液(钾离子浓度8.0mmol／L)。观察药物预处理及低温保存不同时间和再灌注30min后离体心脏的恢复情况；与尼可地尔预处理低温保存组比较。观察二者对离体心脏保存作用的差异。 5．实验动物大白兔在麻醉前分别用尼可地尔或阿片受体激动剂U50，488H预处理。 6．实验动物依据离体供心的保存时间不同分为4个时间点进行观察：保存4h，6h，8h，10h。尼可地尔预处理和低温保存+尼可地尔再灌注组只观察保存8h的心脏变化。 7．记录冷灌前心功能指标。测定再灌注30min时离体心脏的左室发展压(DP)和左室压力微分(±dp／dt)、冠状动脉流量(CF)、并计算心功能恢复百分比，留取冠状动脉引流液测定心肌酶(LDH、CK)、心肌线粒体钙含量、肌浆 举四军反大掌硕士研究生毕业论文亘里旦口里国.里口口口里里里国旦里旦里里鱼旦旦里皿旦旦鱼旦旦旦旦鱼旦旦旦旦旦鱼鱼鱼旦里里旦鱼鱼鱼旦里旦~ 网ca2+一ATPase活性、心肌细胞ATP含量，心肌组织含水量，并观察心肌 超微结构。结果:1.尼可地尔预处理低温保存组:离体心脏在经尼可地尔预处理低温保存后随 着保存时间的延长钙离子仍有明显的超载，实验组与对照组相比心功能恢 复率及钙离子超载程度在保存6h内的结果差异性不显着(p>0.05);在 sh后二个时间点的钙离子超载程度结果差异性明显(p<0.01)。2.离体心脏在经尼可地尔预处理和低温保存后对Caz+一ATPase活性有保护作 用;实验组和对照组CaZ十一ATPase活性在相应的时间点存在明显差异(P< 0.01);两组线粒体钙离子含量在8h组存在明显差异(P<0.05)。3.尼可地尔预处理可以明显改善心肌结构的改变;Uw液对冠脉血管内皮损 伤严重，使心脏再灌注后冠状动脉流量恢复率明显减少4.尼可地尔预处理和低温保存+尼可地尔再灌注可以进一步减轻钙离子的 超载，减轻心肌结构的变化，但心功能的恢复较尼可地尔预处理和低温保 存组降低，且有明显差异(p<0.05)。5.U50，4 88H预处理和低温保存离体心脏可以减轻钙离子超载;实验组不同 保存时间点的组间比较，钙离子超载程度、Ca2+一ATPase活性、ATP含量 等相比较存在明显的差异。但与对照组相比较，钙离子的超载程度、 ca2+一ATPase活性在不同的保存时间点，没有明显的差异(p>0.05)。6.阿片受体激动剂U50488H和钾离子通道开放剂尼可地尔对离体心脏预处 理和低温保存作用没有明显的差异性结论:1.尼可地尔预处理和低温保存离体心脏可以减少心肌细胞的钙离子超载， 减轻缺血再灌注损伤.供心保存时间在6h内，与Uw液的保存效果相当。 在sh组UW液的保存效果较尼可地尔预处理和低温保存差2.改良ST，ThomanSH(K+浓度8n’uno1/L)液可以使心脏平稳的停跳，砂自脏停 跳所需时间较高钾的Uw液有所延长，但差异性不显着3.高钾的Uw液对心脏血管内皮有明显的损伤。并且使心肌组织的水肿程度 增加。注.尼可地尔再灌注可以进一步减轻钙离子超载，减轻缺血再灌注损伤，但举四军反大学硕士研究生华业论文 对心功能的恢复有一定的负面影响。尼可地尔再灌注与尼可地尔预处理 对心脏结构保存和保护有协同作用。5.阿片受体激动剂U50，488H预处理和低温保存对离体心脏有一定的保护作 用，其作用和钾离子通道开放剂尼可地尔作用效果基本相同。
凌明英[6]2013年在《K_(ATP)通道在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用及分子机制研究》文中研究说明研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是严重危害人类健康的疾病,其中易损斑块是急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)以及脑血管疾病的基础病变,易损斑块发病机制和治疗靶点的探索成为当今医学发展的重大挑战。动脉粥样硬化斑块的主要细胞成分包括巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。易损斑块的病理改变包括平滑肌细胞和胶原纤维含量减少,有大的脂质核,斑块内大量的巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润。越来越多的研究表明离子通道与血管功能密切相关,在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥重要作用。已有研究报道,内皮细胞钙离子通道、钾离子通道和氯离子通道在剪切力应激和炎症反应中具有调节作用；TRPC通道介导的血管平滑肌细胞、内皮细胞、单核/巨噬细胞和血小板功能失调参与了动脉粥样硬化的病理过程。由此可见,离子通道在动脉粥样硬化中的作用不容忽视。而且,钾离子通道是膜电位的重要组成部分,在维持细胞电稳态中具有重要作用,可以调节细胞内钙离子的浓度进而发挥对细胞功能的调节作用。叁磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)敏感的钾通道(KATP)是由四个孔道形成亚基-Kir6亚基和四个调节亚基-SUR亚基组成的八聚体蛋白。对细胞内腺苷酸变化敏感,是重要的代谢感受器,偶联细胞内代谢状态细胞膜电活动。近年来,KATP通道在糖尿病和心血管疾病中同时发挥的重要作用逐渐得到认可,作为几类不同药物的作用靶点,成为研究活跃的领域。现有的研究主要集中在以下几个方面：心脏功能的调节,包括缺血再灌注、心肌梗死、心肌重构、心衰、缺血预适应和应激的环境中心肌细胞KATP通道的调节作用；血管平滑肌细胞的KATP通道研究也很丰富,包括各种内源性和外源性血管舒缩物质的调节作用以及在高血压和感染的环境中的表达和功能的改变；同样的,血管内皮细胞的KATP通道也越来越受到重视,包括在内皮素和NO释放中的调节作用研究。但是,对于KATP通道在动脉粥样硬化中的作用却没有直接的报道。因此,本研究提出如下假说：KATP通道在动脉粥样硬化病变的病理生理过程中发挥重要作用,KATP通道可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。目的1.建立动脉粥样硬化病变发展的动物模型；2.观察斑块平滑肌细胞、巨噬细胞、胶原纤维和脂质表达,评测斑块易损性；3.探讨KATP通道药物体内干预对动脉粥样硬化病变发展的影响。方法本研究以ApoE-/-小鼠80只为研究对象,9周龄始予高脂饮食,10周龄时(25-30g)行右侧颈动脉套管术；8周后,高分辨率小动物显微超声检测颈动脉斑块病变,随后,小鼠随机分为空白对照组,转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.lacZ对照组和转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.p53实验组,后两组分为转染后1天组、4天组和14天组,转染后4天组和14天组又分为格列苯脲(Glibenclamide)干预组和非干预组,给予相应处理。检测下列指标：1.血生化分析：血液标本收集,检测血糖(glucose, Glu)、谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT)谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase, GOT)、甘油叁酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)含量；2. ApoE-/-小鼠取材,病理组织学检测：实验动物按照实验分组,分别于转染后0天、1天、4天和14天时处死,留取组织用于病理染色及分子生物学实验。苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色用以检测组织结构变化,油红O(Oil-red O)染色用以检测组织l脂质含量,天狼猩红(Sirius-red)染色用以检测组织胶原纤维含量,p53、SMC-α actin、MOMA-2的免疫组织化学染色分别用以检测组织p53的表达、平滑肌细胞和巨噬细胞的含量；3.计算斑块易损指数：易损指数=(MOMA-2阳性面积/斑块面积+脂质面积/斑块面积)/(SMC-α actin阳性面积/斑块面积+胶原纤维面积/斑块面积)。结果1.格列苯脲干预对ApoE-/-小鼠血生化及肝脏组织的影响格列苯脲灌胃后小鼠血糖、甘油叁酯、总胆固醇、转氨酶水平以及肝脏组织结构没有明显变化(P>0.05)。2.ApoE-/-小鼠颈动脉套管手术及p53转染效率检测小鼠显微超声示右侧颈动脉套管及套管近心端斑块形成；转染后1天、4天、14天,p53表达在Ad5-CMV.p53转染组比Ad5-CMV.lacZ组明显增多(P<0.05)。3.ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块平滑肌细胞及胶原纤维染色斑块平滑肌细胞含量与胶原纤维含量变化趋势基本一致,在p53转染4天和14天组明显少于相应时间点的lacZ转染组(P<0.05)。4.ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块巨噬细胞及脂质染色斑块巨噬细胞含量与脂质含量变化趋势一致,在转染后4天和14天时,p53组显着高于相应时间点的lacZ组(P<0.05)。5.ApoE-/-小鼠格列苯脲体内干预稳定颈动脉粥样硬化斑块格列苯脲体内干预14天,在p53转染组巨噬细胞含量、脂质含量明显降低(P<0.05),斑块胶原成分显着增加(P<0.05),尽管平滑肌细胞含量无明显变化(P>0.05),但是斑块病变改善显着。6.斑块易损指数计算在转染后4天和14天时,p53组易损指数比lacZ显着升高,而且时间点愈后p53转染组的易损指数升高愈显着(P<0.05)；在p53转染14天组,格列苯脲体内干预使易损指数明显下降(P<0.05)。结论1. ApoE-/-小鼠高脂饮食、颈动脉套管术后局部转染Ad5-CMV.p53诱导斑块易损指数增加；2.格列苯脲体内干预对Ad5-CMV.p53转染ApoE-/-小鼠血.生化及肝组织结构无明显影响；3. ApoE-/-小鼠格列笨脲体内干预改善p53转染诱导的颈动脉粥样硬化斑块病变。研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)与细胞膜离子通道关系密切。K+电流是细胞膜电位的主要组成部分,对于细胞功能至关重要。叁磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)敏感的钾通道(KATP)是细胞膜离子通道的重要组成部分,通过调节细胞内外钾离子浓度,在维持细胞膜电位、调节其他生物离子进出细胞和调市细胞功能中发挥不可替代的作用,而且是联系细胞电活动与细胞代谢的桥梁。缺血、缺氧、代谢性酸中毒等导致细胞内ADP/ATP升高时,KATP通道开放,细胞膜超极化,电压依赖性钙通道(voltage-dependent calcium channels,VDCCs)关闭,钙内流减少,细胞内[Ca2+]降低,介导缺血-再灌注损伤及心力衰竭中的心肌保护等作用。KATP,通道是一种异源八聚体复合物,四个Kir6.X亚基构成孔道形成亚基转运钾离子,四个SURs亚基组成调节亚基,根据细胞内ATP水平调节通道活性。Kir6.X存在Kir6.1和Kir6.2两个亚型；磺脲类受体SURs(sulfonylurea receptors)有SUR1和SUR2两种亚型,后者有两种主要的剪接体SUR2A和SUR2B,连接Kir6亚基构成功能性的K/ATP通道。KATP通道在多种组织农达,承载了重要的细胞功能,并且KATP通道的亚基组成具有组织特异性,在同时表达Kir6.1.Kir6.2亚基的细胞系,亚基常常以不同比例组成异源多聚体；相应地,不同组织中的KATP通道有不同的生理特性,也是特异性药物试剂作用于特定组织KATP通道以调节不同细胞功能的重要生理基础。例如,心肌细胞主要表达SUR2A/Kir6.2亚型,在缺血缺氧及其他应激的环境中发挥保护心肌细胞的重要作用；胰腺p细胞主要表达SUR1/Kir6.2亚型,可以调节胰岛素的分泌；SUR2B/Kir6.1主要在血管平滑肌细胞和内皮细胞表达,在调节血管张力、血管的舒缩和内皮保护中发挥重要作用。KATP通道是重要的代谢感受器,而动脉粥样硬化及炎症反应与细胞代谢密切相关。因此,本研究提出如下假说：KATP通道在动脉粥样硬化斑块的平滑肌细胞、内皮细胞和／或巨噬细胞中表达,与动脉粥样硬化斑块的易损性关系密切。目的1.检测KATP通道SUR1、SUR2A、SUR2B亚基和Kir6.1、Kir6.2亚基在动脉粥样硬化斑块的表达和分布；2.分析KATP通道亚基表达量和AS斑块成分含量、易损指数的相关性；3.探讨AS斑块平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中KATP通道在病变发展过程中的作用。方法本研究以50只ApoE-/-小鼠为研究对象,9周龄始予高脂饮食,10周龄时(25-30g)行右侧颈动脉套管术；8周后,高分辨率小动物显微超声检测颈动脉斑块病变,随后,小鼠随机分为空白对照组,转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.lacZ对照组和转染重组腺病毒载体Ad5-CMV.p53实验组,后两组分为转染后1天组、4天组和14天组,给予相应处理,分别于相应时间点处死小鼠,留取取标本,检测下列指标：1.病理组织学染色：HE染色检测组织形态结构的改变、油红O染色检测标本脂质含量、天狼猩红染色检测标本胶原含量；2. SMC-a actin和MOMA-2免疫组织化学染色：检测AS斑块平滑肌细胞和巨噬细胞含量；3. KATP通道亚基免疫组织化学染色：检测AS斑块KATP通道亚基SUR1、 SUR2A、SUR2B、Kir6.1和Kir6.2含量,观察各亚基在斑块平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞的表达分布情况；4.相关性分析：计算分析AS斑块成分含量、易损指数和KATP通道亚基SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6.1、Kir6.2表达的相关性；5.AS相关的KATP通道亚基和相应细胞的免疫荧光双标染色：观察AS斑块细胞和主要KATP通道亚型的共同定位表达；6. KATP通道亚基实时定量逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)定量分析：RT-PCR检测ApoE-/-小鼠颈动脉KATP通道亚基SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6.1和Kir6.2的(?)nRNA表达。结果1.AS斑块KATP通道亚基免疫组织化学染色结果SUR2A和Kir6.2亚基阳性染色主要积聚在粥样硬化斑块肩部和脂质条纹等巨噬细胞聚集的部位,定量分析表明二者变化趋势基本一致,在p53转染4天组表达最高,显着高于lacZ转染4天组(P<0.05); SUR1亚基阳性染色在巨噬细胞密集的斑块肩部和脂质条纹区域,以及血管内膜内皮细胞表现突出,定量分析显示,SUR1亚基表达在p53转染4天组增长最为显着,明显多于lacZ转染4天组(P<0.05); Kir6.1亚基阳性染色在斑块肩部及脂质条纹巨噬细胞聚集的区域、血管内皮细胞、血管中膜及纤维帽平滑肌细胞较丰富的区域均有表现,在转染后1天和4天,p53处理组Kir6.1亚基表达均高于lacZ处理组(P<0.05)；SUR2B亚基阳性染色主要分布在血管中膜及斑块纤维帽平滑肌细胞较集中的部位和血管内皮细胞,SUR2B亚基表达在p53转染4天组明显减少,显着少于lacZ转染4天组(P<0.05)。2. KATP通道亚基mRNA表达结果小鼠颈动脉RT-PCR结果显示,KATP通道SUR2A、Kir6.2和SUR1亚基mRNA表达在p53转染4天组增加最为显着,明显高于lacZ转染4天组(P<0.05);Kir6.1亚基在p53转染1天组表达高于lacZ转染1天组(P<0.05); SUR2B亚基在空白对照组表达水平最高(P<0.05)。3.AS斑块KATP通道染色与斑块负荷相关性分析结果KATP通道SUR2A亚基和Kir6.2亚基染色,与斑块易损指数正相关,与斑块巨噬细胞含量成正相关,与斑块平滑肌细胞含量负相关(P<0.05)。4.AS斑块MOMA-2与SUR2A、Kir6.2共表达免疫荧光双标染色显示,SUR2A亚基和MOMA-2共同定位表达于斑块内及血管壁粘附浸润的泡沫巨噬细胞,这些部位同样粘附聚集Kir6.2亚基和MOMA-2双染巨噬细胞。结论1. KATP通道亚基在AS斑块平滑肌细胞、内皮细胞以及巨噬细胞表达；2. KATP通道SUR2A、Kir6.2亚基与AS斑块负荷密切相关；3. KATP通道SUR2A/Kir6.2主要在斑块巨噬细胞表达。研究背景动脉粥样硬化斑块的主要细胞成分包括巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。与血管平滑肌细胞和内皮细胞显着不同,巨噬细胞来源于循环中的单核细胞,是免疫系统炎症反应的重要组成部分,单核/巨噬细胞粘附、聚集、迁移和分泌炎症因子的功能贯穿动脉粥样硬化斑块的起始、发展和破裂的全过程。以往的研究发现,单核/巨噬细胞离子通道在动脉粥样硬化病变中发挥重要作用。单核/巨噬细胞TRPC通道通过调节细胞内钙离子浓度,介导细胞的氧化应激,加剧动脉粥样硬化病变：周围的细胞因子和细胞本身的功能状态能够调节单核细胞电压依赖性内向整流钾通道Kir (voltage-dependent inwardly rectifying potassium channels)和延迟外向整流钾通道Kdr (delayed outwardly rectifying potassium channels)诱导单核细胞的活化和分化；单核/巨噬细胞容量调节性氯离子通道(volume-regulated Cl channels)功能失调,促进巨噬细胞吞噬脂质,形成泡沫细胞。更重要的是,MCP-1和LPC通过调节氯离子通道和钙离子激活的钾通道可以促进单核细胞的迁移。单核细胞的迁移是动脉粥样硬化的始动环节,而大量泡沫细胞的形成是不稳定粥样斑块的重要标志。然而,ATP敏感钾通道(ATP-sensitive K+channels, KATP)在动脉粥样硬化中的作用至今鲜有报道。KATP,通道是异源八聚体蛋白复合物,由四个内向整流K+通道(inwardly rectifying potassium channel, Kir) Kir6.X亚基形成孔道,四四个ATP结合盒(ATP binding cassette, ABC)家族的磺脲类受体(sulfonylurea receptor, SUR)蛋白组成调节亚基。不同组织表达的KATP通道Kir6.X和SUR亚基不尽相同,Kir6.X包括Kir6.1和Kir6.2亚型,SUR包括SUR1、SUR2A和SUR2B亚型,因而呈现出组织特异性的生理学和病理生理学特征。有研究报道,KATP通道阻断剂格列苯脲能够抑制低氧血症和酸中毒时脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的促炎性细胞因子的释放。而单核/巨噬细胞的炎症反应在动脉粥样硬化病变的形成、发展以及晚期易损斑块破裂中扮演重要角色。LPS是单核/巨噬细胞的有效激活剂,与Toll样受体(TLRs)结合,主要通过NF-κB和MAPKs信号通路的激活,后者包括p38、JNK和ERK1/2信号转导途径,诱导TNF-α等促炎性细胞因子分泌。因此,我们提出下列假说：单核/巨噬细胞KATP通道在LPS诱导的细胞炎症反应中发挥作用,从而影响动脉粥样硬化病变的发生、发展；单核/巨噬细胞KATP通道通过NF-κB和MAPKs (ERK1/2、p38和JNK)信号转导通路调节细胞的炎症反应。目的1.观察LPS对巨噬细胞KATP通道和TNF-α表达的影响；2.探讨KATP通道对LPS诱导的巨噬细胞TNF-α表达的调节作用；3.揭示KATP通道对LPS诱导的巨噬细胞内NF-κB和MAPKs信号通路的影响。方法本研究以单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,KATP通道开放剂吡那地尔或阻断剂格列苯脲预处理后予LPS刺激,采用实时定量聚合酶连反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(western blot)等实验方法,检测：1.LPS (1μg/ml)处理RAW264.7细胞不同时间(0、2、4、8、24h)后,检测KATP通道各亚基(SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6.1、Kir6.2)和炎症因子TNF-α表达；2. KATP通道开放剂(吡那地尔,10μM)或阻断剂(格列苯脲,10μM)预处理后,检测LPS刺激RAW264.7细胞TNF-α的表达,检测不同刺激时间(15min、30min、1h、24h) NF-κB和MAPKs信号通路蛋白的磷酸化改变；3. NF-κB信号通路抑制剂预处理后,检测KATP通道各亚基的表达改变,检测KATP通道干预对RAW264.7细胞TNF-α表达的影响。结果1.LPS诱导RAW264.7细胞KATP通道亚基和TNF-α表达与空白对照组相比较,KATP通道SUR1、SUR2A、Kir6.1和Kir6.2亚基在LPS (1μg/ml)刺激细胞4小时后表达明显升高(P<0.05),同时,TNF-α表达显著增加(P<0.05),但是各组均未检测到SUR2B亚基mRNA的表达。2. KATP通道药物干预后RAW264.7细胞TNF-α表达和NF-κB、MAPKs蛋白磷酸化改变与LPS刺激4小时组相比较,KATP通道阻断剂格列苯脲(10μM)预处理后细胞TNF-α表达降低(P<0.05),开放剂吡那地尔(10μM)预处理后细胞TNF-α表达略增加(P<0.05)。与LPS刺激15分钟组相比较,格列苯脲(10μ,M)预处理后细胞p65、ERK1/2蛋白磷酸化水平下降(P<0.05),而吡那地尔(10μ,M)预处理对细胞p65、ERK1/2蛋白磷酸化水平影响没有统计学意义(P>0.05)；格列苯脲和吡那地尔对p38蛋白磷酸化水平没有明显改变(P>0.05)；与空白对照组相比较,LPS刺激15分钟、1小时或24小时JNK蛋白磷酸化无显着变化(P>0.05)。3. KATP通道位于RAW264.7细胞LPS诱导活化的NF-κB信号通路上游与LPS刺激4小时组相比较,NF-κB信号通路抑制剂PDTC(100μM)和DMFR(100μM)预处理显着降低RAW264.7细胞TNF-α的mRNA表达(P<0.05)；KATP通道阻断剂格列苯脲(10μM)能够增强NF-κB抑制剂的作用(P<0.05),而开放剂吡那地尔(10μM)拮抗NF-κB抑制剂的作用(P<0.05)。与LPS刺激4小时组相比较,PDTC (100μM)和DMFR (100μM)预处理显着增加了RAW264.7细胞KATP通道SUR1、SUR2A、Kir6.1和Kir6.2亚基的表达(P<0.05)。结论1.LPS绣导巨噬细胞KATP通道表达：2.巨噬细胞KATP通道参与调节LPS诱导的炎症反应；3.巨噬细胞KATP通道通过NF-κB和ERK1/2信号转导通路调节细胞炎症反应。
徐鹏[7]2014年在《缺氧后处理、药物后处理激活Nrf2-ARE通路机制的研究》文中进行了进一步梳理目的：建立成年SD大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型，观察缺氧/乳化异氟醚(EI)/吡那地尔(P)后处理对大鼠心肌细胞的影响，目的：1.以核相关因子2(Nrf2)为靶点，探讨Nrf2-抗氧化反应元件（ARE）通路在缺氧/药物后处理心肌保护机制中的作用，应用活性氧清除剂N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸(MPG)处理，与不加MPG的组对比观察Nrf2-ARE通路下游产物HO-1、Nqo-1、SOD-1的mRNA及蛋白表达量的变化，以明确活性氧(ROS)在上述后处理方式心肌保护中的作用，即Nrf2-ARE通路激活的可能机制；2.通过对ROS浓度的测定，观察缺血后处理、两种药物后处理不同浓度以及脂肪乳对照组对ROS水平的影响，证明上述后处理方式诱发的ROS水平是否与心肌保护效果有关。方法：1.通过Langendorff灌注离体心脏，分离、培养成年大鼠心肌细胞，建立心肌细胞缺氧复氧损伤模型， Nrf2-ARE通路激活机制的研究将心肌细胞随机分为9个组，正常组（N组）、对照组（H/R组）、缺氧后处理组（HPO组）、乳化异氟醚（1.68mmol/L组）后处理组（EI2）、脂肪乳组（FAT）、吡那地尔（50μmol/L）后处理组（P50）及缺氧后处理和MPG处理组(HPO+MPG)、乳化异氟醚和MPG处理组(EI+MPG)、吡那地尔和MPG处理组(P+MPG)。分离后的心肌细胞培养20h，除N组持续培养110min，其余各组均缺氧45min，H/R组复氧60min；HPO组缺氧45min后缺氧、复氧重复3次，每次各5min，再继续复氧60min；EI2组缺氧45min后以1.68mmol/LEI处理5min，复氧60min；FAT组缺氧45min后以脂肪乳处理5min，复氧60min；P50组缺氧45min后以50μmol/L P处理5min，复氧60min；HPO+MPG组缺氧、复氧重复后MPG处理10min，复氧60min；EI+MPG组用EI处理5min、MPG处理10min，复氧60min；P+MPG组用P处理5min、MPG处理10min，复氧60min。2.荧光共聚焦显微镜下观察复氧末心肌细胞内钙离子水平及Nrf2核转位。3.透射电子显微镜观察缺氧复氧损伤后的心肌细胞超微结构并对其进行线粒体评分。4. Real-Time PCR及Western blot技术检测复氧末心肌细胞中Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1的基因mRNA表达及蛋白质表达情况。5. ROS浓度与后处理激活通路程度的相关性研究，用酶联免疫吸附剂ELISA法测定不加MPG的各组心肌细胞及乳化异氟醚不同浓度后处理组（0.84、1.68和2.52mmol/L，EI1,EI2,EI3组）和吡那地尔不同浓度后处理组（25、50和100μmol/L，P25，P50，P100组）心肌细胞的复氧5min和60min活性氧含量，并用复氧60min时ROS含量与Nrf2mRNA和蛋白的表达量作比较。结果：1.荧光共聚焦显微镜检测心肌细胞内钙离子：与N组比较，其它各组荧光强度明显增强（P <0.05）；与H/R组比较，其它各组荧光强度明显减弱（P <0.05），其中HPO组荧光强度明显低于H/R组和FAT组（P <0.05），HPO、EI2和P50组荧光强度相比，差异无统计学意义（P>0.05），而HPO、EI2和P50组荧光强度低于加用活性氧清除剂MPG处理组（P <0.05）。2.荧光共聚焦显微镜观察细胞内Nrf2的亚细胞分布：N组心肌细胞核内Nrf2蛋白荧光强度低；H/R组与N组比较心肌细胞核内Nrf2蛋白荧光强度增强（P <0.05）；与H/R组比较，其它各组荧光强度明显增强（P <0.05），其中HPO组、EI2组及P50组心肌细胞核内Nrf2蛋白荧光强度相比，差异无统计学意义（P>0.05），但是均强于FAT组（P <0.05）；而HPO、EI2和P50组荧光强度高于加用活性氧清除剂MPG处理组（P <0.05）。3.电镜结果显示N组心肌细胞线粒体结构正常；H/R组心肌线粒体损伤最严重；HPO组、EI2组与P50组心肌线粒体损伤较轻，且损伤程度明显低于FAT组(P<0.05)；FAT组心肌线粒体损伤程度轻于H/R组（P<0.05）；而HPO、EI2和P50组心肌线粒体损伤程度轻于加用活性氧清除剂MPG处理组（P <0.05）。4. Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1mRNA表达量：与N组相比，其它各组的Nrf2、HO-1、SOD1及NQO1基因mRNA表达量明显降低（P<0.05）；与H/R组相比，其它各组基因mRNA表达量显着增高（P<0.05）；其中HPO、EI2和P50组基因mRNA表达量无统计学意义(P>0.05），但叁组各基因mRNA显着高于FAT组（P<0.05）；HPO、EI2和P50组基因mRNA表达量均分别高于加用活性氧清除剂MPG处理组（P<0.05）。5. Nrf2、HO-1、SOD1、和NQO1蛋白质表达量：与N组相比，各组Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白质表达量显着降低（P<0.05)；与H/R组相比，其余各组蛋白质表达量增高（P<0.05)；其中HPO、EI2和P50组蛋白质表达量无统计学意义(P>0.05），但叁组蛋白表达量均高于FAT组（P<0.05）； FAT组蛋白质表达量略高于H/R组（P<0.05）；而HPO、EI2和P50组各蛋白表达量均分别高于加用活性氧清除剂MPG处理组（P <0.05）。6.活性氧含量：在复氧5min、60min时，与N组相比，各组ROS含量均显着增高（P<0.05)；与H/R组相比，其余各组ROS含量降低（P<0.05)；其中HPO、EI2和P50组ROS含量无统计学意义(P>0.05），但其ROS含量均低于FAT组（P<0.05）；FAT组ROS含量略低于H/R组，但无统计学意义（P>0.05）。EI1、EI2和EI3组ROS含量在复氧5min时随浓度升高而增加（P<0.05)；EI1和EI3组ROS含量复氧60min时差异无统计学意义（P>0.05)，均明显高于EI2组（P<0.05)；组内比较，与复氧5min相比，EI叁个不同浓度组复氧60min时ROS含量均显着降低（P<0.05)；P25、P50和P100组ROS含量在复氧5min时随浓度升高而增加（P<0.05)；P25和P100组ROS含量复氧60min时差异无统计学意义（P>0.05)，均明显高于P50组（P<0.05)；组内比较，与复氧5min相比，P叁个不同浓度组复氧60min时ROS含量均显着降低（P<0.05)。不同浓度乳化异氟醚后处理/吡那地尔后处理缺氧复氧心肌细胞后，在复氧后60min测得的ROS含量与Nrf2mRNA和蛋白的表达量均呈负线性相关（P<0.01）。结论：1.缺氧后处理/EI后处理/P后处理通过在再灌注时产生的ROS激活Nrf2-ARE通路，上调其下游的抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达，从而起到抗心肌细胞缺氧复氧损伤的作用。2.不同浓度的两种药物（吡那地尔和乳化异氟醚）后处理，通过在再灌注早期产生不同水平的ROS，激活Nrf2-ARE通路，起到不同水平的心肌保护作用。其中，吡那地尔（50μM）和乳化异氟醚（1.68mM）再灌注早期产生的ROS量最适宜，起到的心肌保护效果最佳。
成红[8]2017年在《右美托咪定对大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道电流的影响》文中认为右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)为咪唑啉类衍生物,是一种新型的α2肾上腺素能受体激动剂,作为麻醉辅助用药,近年来越来越得到广泛应用。临床研究发现,DEX具有多方面心肌保护作用,可对抗心肌缺血/再灌注损伤,减少心律失常的发生,而其机制尚未明了。大量研究显示,当心肌缺血缺氧时,心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道(sarc KATP)在诱发电信号传导紊乱,导致心律失常过程中发挥重要作用。然而DEX抗缺血/再灌注心律失常作用的机制是否与sarc KATP通道有关,尚未报道。目的:本实验拟利用全细胞膜片钳技术观察DEX对大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道电流(ATP sensitive potassium current,IKATP)大小的影响,探讨DEX对抗缺血/再灌注心律失常的电生理机制。方法:成年雄性SD大鼠,利用Langendorff离体心脏灌流装置进行酶解分离,获得单个的心室肌细胞。利用膜片钳技术记录心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道电流的变化。将细胞置于显微镜载物台标本小浴槽中,控制恒温和恒速细胞外液灌流,使用玻璃微管和细胞紧密接触形成高阻封接,再给予一定负压吸破细胞膜,形成全细胞记录模式。在电压钳模式下,通过运行pclamp记录程序,完成电流的诱发和采集。正常钾电流记录灌流液中加入KATP通道特异性开放剂吡那地尔(pinacidil,PIN,100μM)使细胞膜KATP通道开放后,根据灌流液中继续给药的不同将细胞随机分为四组,每组4个细胞:1 Glib组,在灌流液中加入KATP通道阻断剂格列苯脲(glibenclamide,Glib)50μM,观察电流的变化。2 DEX组,依次用含有DEX0.01μM、1μM、100μM的灌流液灌流,观察DEX对细胞膜IKATP的影响。3 DEX+YOH组,在灌流液中加入DEX1μM,之后再加入α2肾上腺素能受体阻断剂育亨宾(yohimbine,YOH)1μM,观察IKATP的变化。4 DEX+IDA组,在灌流液中加入DEX1μM,之后再加入咪唑啉受体阻断剂咪唑克生(idazoxan,IDA)1μM,观察IKATP的变化。结果:1 Glib组:在60m V测试电压下,背景电流值为10.7±1.1p A/p F,100μM吡那地尔使电流增加至20.6±1.3p A/p F(P<0.05),50μM格列本脲可使电流恢复至11.5±1.3p A/p F。结果表明,吡那地尔所增大的电流就是IKATP,此电流可被50μM格列本脲所完全阻断。2 DEX组:灌流液中先后加入吡那地尔100μM,DEX 0.01μM、1μM、100μM。在60m V测试电压下,IKATP分别为:10.1±0.4、9.0±0.7、6.6±0.6和1.7±0.5p A/p F。与吡那地尔相比较,DEX 0.01μM,1μM和100μM分别使IKATP降低11.2±3.8、34.2±4.5和82.7±5.1%。其中,中、高浓度DEX(1μM、100μM)明显抑制IKATP(P<0.05,P<0.01)。结果表明,DEX对KATP通道具有抑制作用。3 DEX+YOH组:在60m V测试电压下,灌流液中加入吡那地尔、DEX和育亨宾时,IKATP分别为10.3±0.7、6.6±1.2和6.2±1.5p A/p F。育亨宾对DEX电流抑制无影响(P>0.05)。结果提示,DEX对KATP通道的抑制作用与α2肾上腺素能受体无关。4 DEX+IDA组:在60m V测试电压下,灌流液中加入吡那地尔、DEX、和咪唑克生时,IKATP分别为9.4±1.2、6.3±0.9和8.8±1.2p A/p F。咪唑克生可明显减弱DEX对IKATP的抑制作用(P<0.05)。结果提示,DEX对KATP通道的抑制作用与咪唑啉受体有关。结论:DEX可通过咪唑啉受体介导,浓度依赖性地抑制大鼠心室肌细胞KATP通道;此作用可能是DEX抗心律失常作用的电生理学机制之一。
史斌[9]2006年在《尼可地尔后处理对大鼠离体缺血再灌注心肌的保护效应及作用机制的实验研究》文中指出目的:通过大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤模型,研究尼可地尔后处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护效应及其可能的机制,为临床缺血性心脏病的治疗和体外循环手术中的心肌保护用药提供实验依据。方法:利用Langendorff逆行灌流装置对大鼠心脏离体灌流,通过K-H液停灌,建立大鼠离体心脏全心缺血/再灌注模型。60只SD大鼠随机分为6组。缺血/再灌注组(IR组):缺血40min,再灌注60min;缺血后处理组(IPOC组):缺血末6个循环的再灌注10s/缺血10s,再灌注58min;尼可地尔后处理组(NPOC组):缺血末灌注含尼可地尔20umol/L的K-H液10min,再灌注50min;尼可地尔后处理+Glibenclamide组(G组):缺血末灌注含尼可地尔20umol/L和Glibenclamide 10umol/L的K-H液10min,再灌注50min;尼可地尔后处理+ Chelerythrine组(C组):缺血末灌注含尼可地尔20umol/L和Chelerythrine 5umol/L的K-H液10min,再灌注50min;尼可地尔后处理+ Lavendustin组(L组):缺血末灌注含尼可地尔20umol/L和Lavendustin 10umol/L的K-H液10min,再灌注50min。各组分别测量心功能指标(HR、LVSP-LVDP、±dp/dtmax)、
张立民[10]2012年在《ATP敏感性钾通道在一氧化氮调节失血性休克大鼠离体淋巴管泵功能中的作用》文中研究表明重症失血性休克后的微循环障碍是顽固性低血压、多器官损伤的重要因素。淋巴循环作为机体循环系统的重要组成的一部分,对于维持机体自稳态起着重要的作用。淋巴管泵功能是淋巴循环的动力学基础,在体与离体实验均已表明,在休克的发展进程中,淋巴管收缩性出现双相变化,即早期升高,晚期降低,与重症休克的发展关系密切。如何调控淋巴管泵功能,进而调节淋巴循环,对于重症休克的防治具有积极意义。淋巴管泵功能受多种体液因子的调节。研究表明,一氧化氮(nitric oxide, NO)的周期性变化除了参与生理状态下淋巴管的收缩、舒张以及张力调节外,同样也参与了失血性休克发展进程中淋巴管泵功能的调节；ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K+channel, KATP)通过调节淋巴管平滑肌细胞去极化程度,来调控生理状态下淋巴管的泵功能。国外学者研究发现,NO部分通过cGMP/cAMP及其依赖的蛋白激酶(PKA/PKG)作用于KATP来调控正常淋巴管收缩性。那么,KATP在休克后NO调节淋巴管泵功能这一过程中是否发挥作用?值得研究。这对于以KATP为靶点,开展休克后淋巴管的生物学调控具有重要的意义。为此,本研究首先观察了cAMP、PKA、cGMP、PKG在休克发展进程中的变化,并进一步应用离体微血管压力-直径测定技术,观察KATP以及cAMP/PKA、cGMP/PKG、NO/NOS工具药对休克淋巴管收缩性及其对P物质(SP)反应性的影响,探讨KATPP在NO调节休克大鼠淋巴管泵功能中的作用与机制,为休克后淋巴管泵功能的调控提供实验依据与理论基础。首先,将126只Wistar雄性大鼠随机分为休克组(经股动脉放血,维持平均动脉血压至40mmHg,复制失血性休克模型,分为shock0h shock0.5h、shock1h、shock2h、shock3h亚组,均n=21)、对照组(control group,仅实施麻醉及与休克组相同的手术,n=21)。在对照组完成手术后稳定30min、休克大鼠各时间点,分离胸导管,手术显微镜下去除胸导管周围组织,留取淋巴管组织。每组取出12条淋巴管制备组织匀浆后,用ELISA法检测cAMP、cGMP、p-PKA、p-PKG含量；每组9条淋巴管提取蛋白后,用western blot技术测定PKG蛋白表达。研究结果显示,随着休克的发展,淋巴管组织中cAMP、p-PKA含量逐渐增高,两者均在shock0.5h及以后显着增高；同样,cGMP、p-PKG含量也逐渐增高,从shock2h始显着性增加,而PKG蛋白在Shock0h组显着高于control组,随着休克的发展,PKG蛋白含量下降至control组水平。其次,42只大鼠分为control组(n=6)、shock0.5h组(n=36),制备离体淋巴管条,固定于微脉管灌流系统的浴槽内,待淋巴管出现稳定的收缩后,维持淋巴管跨壁压在3cmH20水平,control、shock0.5h组的各6条淋巴管直接观察并记录淋巴管的收缩频率(contraction frequency,CF)及淋巴管各期口径,根据淋巴管收缩末期口径(end systolic diameters,ESD)、舒张末期口径(end diastolic diameters, EDD)、被动管径(passive (relaxed) diameters, PD)和频率,计算淋巴管紧张指数(tonic index, TI)、收缩幅度(contraction amplitude, CA)、泵流分数(fractional pump flow, FPF)等指标,结合CF评价淋巴管泵功能。余下shock0.5h组的30条离体淋巴管出现稳定的自发性收缩,分别与L-Arg(NO供体)、L-Arg+H89(PKA抑制剂)、L-Arg+Glibenclaimde (KATP阻断剂)、8-Br-cAMP(PKA供体)、8-Br-cAMP+Gli孵育10min后(均n=6),观察并记录淋巴管的CF、EDD和ESD,评价KATP在NO-cAMP-PKA通路调节失血性休克大鼠离体淋巴管泵功能中的作用。结果显示,shock0.5h淋巴管CF、FPF、TI显着高于对照组,与L-Arg共孵育后CF、FPF、TI显着降低,其中FPF、TI也显着低于对照组；shock0.5h淋巴管与H-89和L-Arg共孵育后,CF和FPF都显着高于shock0.5h+L-Arg组；shock0.5h淋巴管与Gli与L-Arg共孵育后FPF显着高于shock0.5h+L-Arg组;shock0.5h淋巴管与8-Br-cAMP孵育后,CF和FPF显着降低,shock0.5h淋巴管与8-Br-cAMP、Gli共孵育后,CF显着高于对照组。上述各组淋巴管收缩性观察结束后,进一步给予梯度浓度的SP,使终浓度分别为：1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7mol/L,测量淋巴管的EDD、ESD、CF和PD,计算CA、FPF和TI,将给予各浓度SP前后CF、 TI、CA、FPF的差值ACF、△TI、△CA,△FPF作为淋巴管反应性性的指标。结果显示,shock0.5h淋巴管在SP某些浓度下,△CF、△FPF与ATI显着高于对照组；L-Arg可降低shock0.5h淋巴管在部分SP浓度下的△CF、△FPF与△TI,而Gli与L-Arg共孵育后能够抑制L-Arg的作用并在某些浓度点下显着提高△CF、△FPF以及△TI,其中△CF在某些浓度点上显着高于对照组；8-Br-cAMP可降低shock0.5h部分SP浓度点下的△CF、△CA、△FPF以及△TI,显着低于对照组,Gli则抑制了8-Br-cAMP的作用,显着提高△CF、△FPF与△TI。结果提示KATP参与了NO对大鼠休克早期离体淋巴管泵功能的调节作用,其作用与NO-cAMP-PKA信号通路有关。最后,42只大鼠在复制失血性休克模型后,制备shock2h离体淋巴管条,观察shock2h离体淋巴管的收缩性与反应性(n=6),并以前述control组作为对照。余下shock2h组的36条离体淋巴管出现稳定的自发性收缩后,分别与L-NAME(NOS抑制剂)、ODQ (sGC抑制剂)、KT-5823(PKG抑制剂)、吡那地尔(KATP开放剂)孵育10min,具体分组情况为：shock2h+L-NAME、shock2h+L-NAME+pinacidil、shock2h+ODQ、shock2h+ODQ+pinacidil、shock2h+KT-5823、shock2h+KT-5823+pinacidil(均n=6),观察淋巴管的收缩性与反应性变化,探讨KATP在NO-cGMP-PKG通路调节失血性休克大鼠离体淋巴管泵功能中的作用机制。结果显示,shock2h淋巴管的CF、FPF、TI较对照组显着性降低,L-NAME可提高shock2h淋巴管的CF、FPF、TI,ODQ可提高shock2h淋巴管的CF、TI,KT5823可提高shock2h淋巴管的CF、FPF,降低了TI；而L-NAME、ODQ、 KT5823分别于吡那地尔共孵育后,分别能显着降低shock2h淋巴管单独与L-NAME孵育时的CF、FPF,降低与单独ODQ孵育时的CF、 FPF,并恢复CA至对照组水平,降低单独与KT-5823孵育时的CF、 FPF。同时发现,在某些SP浓度点,shock2h淋巴管的△FPF、△TI显着低于对照组,L-NAME可提高shock2h淋巴管的△CF、△FPF、△CA, ODQ可提高shock2h淋巴管的△CF、△TI、降低△FPF,KT-5823可提高shock2h淋巴管的△CF、△FPF、△TI;吡那地尔可降低L-NAME提高shock2h淋巴管的△CF、△FPF、△TI的作用,降低ODQ提高△CF的作用,并进一步提高了△CA、△TI,降低了KT-5823提高△CF的作用。结果提示NO通过NO-cGMP-PKG信号通路介导重症休克低收缩性与反应性的机制与KATP有关。总之,在失血性休克的发展进程中,淋巴管的收缩性与反应性表现为早期升高、晚期下降,KATP参与了NO对大鼠休克离体淋巴管泵功能的调节作用,其作用与NO-cAMP-PKA、NO-cGMP-PKG信号通路有关。以KATP作为药物靶点,可调节休克淋巴管的泵功能。
参考文献：
[1]. Pinacidil预处理对损伤心肌细胞线粒体保护作用的实验研究[D]. 彭念寅. 第叁军医大学. 2004
[2]. 吡那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究[D]. 霍小萍. 第叁军医大学. 2002
[3]. 吡那地尔预处理对在体兔缺血再灌注心室肌的若干电生理参数影响[D]. 许佳俊. 福建医科大学. 2004
[4]. 异甜菊醇钠对豚鼠心肌细胞sarcK_(ATP)和mitoK_(ATP)通道的调控作用及机制[D]. 文婷. 华南理工大学. 2016
[5]. 药物预处理对离体心脏保存作用的实验研究[D]. 段大为. 第四军医大学. 2004
[6]. K_(ATP)通道在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用及分子机制研究[D]. 凌明英. 山东大学. 2013
[7]. 缺氧后处理、药物后处理激活Nrf2-ARE通路机制的研究[D]. 徐鹏. 遵义医学院. 2014
[8]. 右美托咪定对大鼠心室肌细胞膜ATP敏感性钾通道电流的影响[D]. 成红. 河北医科大学. 2017
[9]. 尼可地尔后处理对大鼠离体缺血再灌注心肌的保护效应及作用机制的实验研究[D]. 史斌. 重庆医科大学. 2006
[10]. ATP敏感性钾通道在一氧化氮调节失血性休克大鼠离体淋巴管泵功能中的作用[D]. 张立民. 河北北方学院. 2012
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