论文摘要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）,为唇形科鼠尾草属的双子叶草本植物,是我国传统中草药之一,主要用于心脑血管疾病的治疗。心脑血管疾病发病率极高,是引起人类死亡的头号杀手,这导致丹参的市场需求量极大。但是,野生丹参资源枯竭,人工种植的丹参产量下降、品质降低,这使得丹参市场面临供不应求的尴尬境地。利用基因工程等生物技术来提高丹参中有效成分的产量是行之有效的方法之一。WRKY转录因子在植物界中广泛存在,是植物界中最大的转录因子家族之一。因其特殊的保守结构域WRKYGQK而得名。WRKY转录因子通常参与到植物的抗逆途径。近期,有报道表明WRKYs还参与调节次级代谢产物的合成。本研究首先采用生物信息学手段,通过分析本实验室的Methyl jasmonate（MJ）诱导丹参转录组库,获得一条响应MJ的WRKY类基因,并克隆得到该基因ORF序列。将该序列输入NCBI网站中,发现其与已报道的丹参SmWRKY9同源性最高（98%）,故将其命名为SmWRKY9。组织表达谱结果显示SmWRKY9在丹参的主根中表达量最高。激素诱导表达谱结果表明,SmWRKY9受到MJ和Yeast extract（YE）的诱导效果显著。MJ诱导后SmWRKY9的表达水平迅速上升,在1h时达到最高点,为对照组的7倍;SmWRKY9的表达水平在YE诱导两小时后达到最高点,为对照组的5.6倍。此外,SmWRKY9的表达水平还会因Ethephon（ET）,Salicylic acid（SA）的诱导而轻微上调,因Abscisic acid（ABA）的诱导而轻微下调。亚细胞定位实验显示SmWRKY9蛋白定位在细胞核中。通过C58C1农杆菌侵染丹参无菌外植体获得了SmWRKY9过表达和SmWRKY9-SRDX的转基因毛状根。通过qRT-PCR测定转基因毛状根中丹酚酸生物合成途径关键酶基因的表达水平,结果显示过表达SmWRKY9能够明显上调SmRAS1,SmCYP98A14和Sm4CL1的表达水平;同时,SmWRKY9-SRDX的转基因毛状根中SmRAS1和SmCYP98A14表达量明显下降。HPLC测定迷迭香酸和丹酚酸B含量,结果显示SmWRKY9过表达株系中迷迭香酸的含量高于对照株系（9.83mg/g DW）,其中SmWRKY9-34号株系的迷迭香酸含量最高达到21.83mg/g DW。与之相反,SmWRKY9-SRDX株系的迷迭香酸含量低于对照株系,其中SmWRKY9-SRDX-24号株系的迷迭香酸含量最低为3.76 mg/g DW。而丹酚酸B在SmWRKY9过表达和SmWRKY9-SRDX株系中都较对照有所下降,其中SmWRKY9-SRDX-24号株系的丹酚酸B含量最低为0.48 mg/g DW。双荧光素酶报告基因检测实验表明SmWRKY9对SmRAS1和SmCYP98A14起到正调控的作用。酵母单杂交和凝胶阻滞（EMSA）实验结果表明SmWRKY9可与SmRAS1和SmCYP98A14启动子中的W-box互作。此外,我们还对SmWRKY9的过表达毛状根株系（26号）进行了RNA-seq分析,发现SmWRKY9的过表达还会使SmPAL3,Sm4CL2,Sm4CL3,Sm4CL8的表达量提高,暗示它们可能参与到SmWRKY9介导的途径。综上所述,丹参SmWRKY9能够通过直接正向调控SmRAS1和SmCYP98A14的表达来促进迷迭香酸的生物合成。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 张锡晨
导师: 开国银
关键词: 丹参,迷迭香酸,代谢工程
来源: 上海师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,生物学,农作物
单位: 上海师范大学
分类号: Q943.2;S567.53
DOI: 10.27312/d.cnki.gshsu.2019.000147
总页数: 69
文件大小: 3578K
下载量: 175